全 文 ：武汉植物学研究 , 一
青菜与芥菜花粉一体细胞
原生质体融合的研究
‘
李昌功 周嫦 杨弘远 李香花 张启发
武汉大学 生命科学学院植物生殖生物学
研究室 武汉 。。
华中农业 大学 作物遗传改 良国家重点
实验室 武汉
提 要 以聚 乙 二醉 为诱导剂 , 试验 用 种方法进行青菜 莎
一 、、
,
。 。 、 幼 嫩花
粉原生质体与芥菜 。 下胚轴原生质休的融合 , 结果 以修改的 等的方法最好
。
融合后原生质体的培养形成 了愈伤组织 , 但未分化出芽 , 个别愈伤组 织分化了根 。 用
技术对任选的 个细胞系进行鉴定 , 发现 个细饱系含双 亲的 片段 , 可确认是 青菜幼
嫩花粉原生质体与芥菜 下胚轴原生质体融合后产生的杂种细饱系
。
关键词 配子 一 体细胞杂交 , 花 粉原生质体 , , 杂种细 胞系
自 和 报道烟草属小抱子四分体原生质体与体细胞原生质体融合
再生杂种植株成功 〔’〕以来 , “ 配子一体细胞杂交 ” 一 研究取得
了较大进展 。 但现有的报道中以小泡子四分体的融合居多〔‘一 ‘ 〕, 而以游离花粉时期的原生
质体进行配子一体细胞杂交的研究 , 直至近年才取得突破 压
·‘〕。 本文报道青菜幼嫩花粉原生
质体与芥菜下胚轴原生质体的融合实验 , 并对融合后产生的愈伤组织细胞系进行
。 。 一 〔 分子生物学鉴定的结果
。
材料与方法
亲本原生质体的制备
从青菜 。 。。 、 一 品种南京白的幼嫩花粉 单胞中晚期至二胞早期 分离花粉
原生质体 , 从芥菜 ,“ 叹 的下胚轴分离体细胞原生质体 , 分离与纯 化方法同前
文 〔 〕。
融合
按 和 的方法 〔 〕配制融合液 乡。聚乙二醇
、
葡萄
收稿 日 一 。 一 修 回 日 。 第一作者 男 岁 , 副教授 博士 。
国家 然 科学基金资助项 目 。
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
糖和 、
· 。
采用 种方法进行融合试验
。
怎 “ 小规模融合法 ’, 〔, 刁 将
滴两种原 生质体混合液滴于 载玻 片上或培养皿底 , 静置 一 后 从两侧各滴 滴
融 合液 , 滴溶 液相接触后再 从上方滴 滴 融合液 , 一 后加 洗
液 〔’。〕 下同 ②修改的 和 法 〔‘〕 先滴数滴原生质体混合液于培养皿
底 , 静置 一 后于每滴原生质体混合液之上滴加 滴 融合液 ③修改的 丁
等的方法川 〕 操 作程 序与 ②中相反
, 即将原生质体混 合液滴于 融合液之 上 ①
一 高 之一 法 用上述 ③法处理 时滴加高 一 溶液 〔’
。 将融合处理后的
原生质体调至 一 又 。‘ 的密度 , 转入培养
。 上述过程 中的显微观察
、
异核体的鉴别
以及融合率的计算方法同前文 〔 〕
。
培养
以 〔, 只〕和 , 〔“ 为 基 本 培 养 基 , 附 加 葡 萄糖
、 飞 、
谷氨酞胺
、 一
· 一 , 一 、 一 、 一 。 、
·
, 加或不加 。
·
琼脂糖 , 进行脱分化培养
。
愈伤组织增殖培养基同前文 〔 〕 , 分化培
养 基 为 基本培 养基 附加 蔗糖 ,
·
一 或 、
’
一 。
, 一 。 以芥菜下胚轴原生质体的培养作对照 。
植物总 的提取与 分析
随机挑选融合后原生质体再生的 个愈伤组织细胞系
、
青菜的叶片与芥菜下胚轴原
生质体再生的愈伤组织 , 按文献 〔 〕的方法抽提 和进行 扩增 。 共选用华中农
业大学作物遗传改 良国家重点实验室合成的 个随机 聚 于 引物用于 扩
增 。
结果
几种融合方法的融合效果
青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体在大小
、 比重等方面差异较大 图版
, , 前者形体 小而 比重大 , 致使在 种不同的融合处理方式中二者的表现不一致
。 在
“ 小规模融合法 ”与 和 的融合方法中 , 先滴的原生质体在两侧或上方
滴加的 融合液的推动下
,
下胚轴原生质体的运动速度快 , 先于花粉原生质体到达 中
央或边缘
, 导致异源融合机会较少 , 而下胚轴原生质体同源融合较多
。
修改的 等的
融合处理 中 , 原生质体在重力和张力的作用下 , 同时缓慢地 向周围扩散且一直处于
融合液之上 。 由于 种原生质体分布均匀
,
扩散运动中相互接触的机会增多 , 使异源融合
率得以提高 。 在 诱导的融合过程中添加高 一 溶液并未提高融合率 , 反而使部
分原生质体破裂
。
综上所述
, 以修改的 , 等的方法较适于本实验组合的融合
。
浓度与 对融合效果的影响
采用上述修改的
’
等的融合方法
, 根据前文 ‘几〕选定双亲原生质体的密度为花粉
原生质体 又 己
、
下胚抽原生质体 只 几 , , 进行了 浓度和添加 二 甲
亚矾 对融合效果影啊 的研究
。
结果表明
, 旦 劝 的 均能诱导融合 图版 ,
且随着浓度的提高异源融合率 与一对一融合率不断提 高 , 其中以 功 弓。的 诱导 的异
源融合率最高
,
达 从 少。 。叹。 与 。 , 。 配合使用 比单独的 叨 。 诱导的
第 期 李昌功等 青菜与芥菜花粉一 体细胞原生质体融合的研究
融合率有较大提高 , 达 , 与 的融合效果相近 。
融合后原生质体的培养
在所用的培养基 中 , 融合后原生质体均能分裂和进一步 发育 , 比较而言 优于
。 在所试的激素浓度与组合中 , 以
, 一 、 和
的效果最好
。 原生质体在液体与固体浅层培养中均能分裂并形成小细胞团
。 往往培养
发生第 次细胞分裂 图版 培养 第 次分裂 图版 左右即形成小细
胞团
。
一般在液体培养中 , 原生质体分裂几次后即形成星射状小细胞团 图版 , 而固
体浅层培养中的小细胞团则呈致密球形 , 在添加稀释培养基后周围细胞向外发射伸长 图
版 工 。 上述 种小细胞团均可进一步发育形成愈伤组织 。 经增殖培养后的愈伤组织在
所设计的多种分化培养基上均旺盛生长 , 但近两年一直没有分化出芽 , 仅有少数分化出根
图版 。 作为对照的亲本芥菜下胚轴原生质体产生的愈伤组织 , 虽亦无芽的分化 , 但
根的分化率很高 , 几乎达 环
。
愈伤组织细胞系的 分析
在所 用的 个 引物 中 ,
、 和 的扩增 产物 的 电泳 图谱不 清 晰 , 仅
的扩增结果于亲本间有明显的多态性 , 随机选取的 个愈伤组织细胞系间亦有不
同 。 从图版 看 , 第 细胞系含有
、 和 的 条青菜的 片段
和 。。 的 条芥菜的 片段
。
次重复的结果相同 。 据此可以确认该细胞系是青菜
幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体融合后产生的杂种细胞系
。
讨论
前人在小抱子四分体原生质体与体细胞原生质体的融合工作中主要采用了 种融合
方法 , 一是高 法 〔’
, ‘ 〕 , 二是低 一 高 十 法 〔乙 〕 , 均成功地得到 杂种植 株
。
等 〔 〕曾提到用各种浓度的 融合液处理 , 均引起烟草小饱子四分体原生质体破
裂 。 在本实验中 , 由于青菜幼嫩花粉原生质体的分离与纯化较为困难 , 得率较低 , 限制 了其
融合的规模 。 但经试验 发现青菜幼嫩花粉原生质体较耐 融合液处理 , 这就使得用
法进行其融合实验成为可能 。 原生质体融合的前提是原生质体间的相互接触 , 而异
源融合率的高低在很大程度上取决于异源原生质体间相互接触机会的多寡
。 在本实验试
用的 种融合方法中
, 以修改的
‘
等的方法 ’ 〕效果最好 , 融合时间也 比体细胞原生
质体融合大为缩短 。 结合 浓度与 对融合效果影响的研究 , 确定以
与 配合使用能获得最佳的融合效果 。
融合后原生质体是异源融合体
、 下胚轴同源融合体以及 种亲本原生质体的混合群
体
。 花粉原生质体在体外 尚不能发育 , 其它均具发育的潜能
。 芥菜下胚轴原生质体很难再
生植株
。
本研究中无论是融合后原生质体还是亲本下胚轴原生质体均能形成愈伤组织 , 但
皆未分化出芽
。
对随机选取的 个融合后原生质体的细胞系所进行的 技术鉴定 ,
证 明一个为杂种细胞 系
。 这是继青菜与甘蓝型油菜「 〕和烟草与 阳 , , 。 “ 。 , ,卜
〔们 的花粉一体细胞杂交成功后的第 例游离花粉一 体细胞原生质体融合
。 表明利用游
离花粉时期的原生质体与体细胞原生质体融合是获得杂种的一 条有效途径
。
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
参 考 文 献
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李 昌功 , 周嫦 , 杨弘远 芸苔属花粉
一 下 胚轴原生质体融 合再生杂种小植株 植物学报 , 一
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李昌功 , 周嫦 , 杨弘远 等 芸 苔属花粉 体细胞杂种植株 的生 长 发育及分子 生物学 鉴 定 科 学通报 ‘
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第 期 李昌功等 青菜 与芥菜花粉 一 体细胞原生质体融合的研究
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图 版 说 明
图 版
纯化的青菜幼嫩花粉原生质体群体 义 。。 芥菜下胚轴原 生质体 〔 花粉原生质体与下胚轴原生质体融
合中 。。 一 融 合后原生质体进行细胞分裂 与形成愈伤组织 第 次分裂 培养 。。 第 次分裂
培养 火 液体浅层培养中的星射 尺细胞团‘培养 固体浅层培养中的小细胞团 音养
义 。 , 固体浅层培养添加稀释培养摹后小细胞团 呈发射伸长 。 ,
,
愈伤组织形成 愈伤组织 无性系
扩增产物的电泳照 片 从左 至 至右依次为 青菜 , 第 一 无性系 芥菜 标准 分子量标记
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武汉植物学研究 第 卷 总 目 次
第 期 年 月
个新的枝柑突变体 —
“ 桂林 良丰 ”无核桂柑的细胞学鉴定
· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯ ⋯ 陈立松
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· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· ⋯ ⋯ 王 臣 刘 玫
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· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
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· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯ ⋯ 李丸 平 孙 蒙样 蔡得 田
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· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ” · · · · · · · · · · · · · · · “ · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯ ⋯ 张晓艳
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· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ” · · · · ” · · · · · · · · · · · · ·“ ⋯
’二 ’二 ”· ’ · ”二 ’二 ’ ·‘ ” ’ ‘ ’ ‘ ” ”‘ ” ” ’
湖北宜昌大老岭桦 、栋
、 栗林优势种群的分布格局动态研究
·一 · · · · · · 一 · · · · · · · · · · · · · 一 · ⋯⋯ 张 全发 闭耀 川
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’ · ·
⋯
’二 “ ” ’‘ ’ “ ’
℃。一了射线诱变钝顶螺旋藻的研究
· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯ ⋯ 龚 小敏
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“ ”” ” ”” ” ”” ‘ ’ · ’ · ” ⋯
’ ’ · ’ ‘ 二 ‘ 二 ‘ · · ⋯ ⋯
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· · · · 一 · · · · ” · · · · · ⋯ ⋯ 张 伦 辛克敏 陈谦海 徐夭 禄
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