全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17( 2) : 122～126
Journal of Wuhan Botanical Research
菠菜铁型超氧化物歧化酶的纯化及性质

马长艳　魏锦城　程光宇　吴国荣
(南京师范大学生物系　南京　210097)
提　要　用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法检测出菠菜 SOD 同工酶谱带中含 3 条 Fe-SOD 活性
带。菠菜叶 Fe-SOD粗提液经硫酸铵分部沉淀, DEAE-纤维素-A 52和 Sephadex G-100 柱层析,
纯化出单一的 Fe-SOD活性带。纯化酶的分子量为 42. 6 kD ,亚基分子量为 21 kD。对金属元
素的分析表明,该酶每分子含 2. 6 个 Fe 原子。该酶紫外区最大吸收峰为 278 nm, 等电点为
4. 6, 氨基酸组成和其它来源的 Fe-SOD类似。
关键词　铁型超氧化物歧化酶, 菠菜, 纯化, 性质
一般认为铁型超氧化物歧化酶( Fe-SOD )主要存在于原核生物中〔1〕。80 年代以来,相继从油菜〔2〕、欧
洲萍蓬草〔3〕、番茄〔4〕和香石竹花瓣〔5〕等高等植物中检出或纯化到这一类型的 SOD。我们应用浓度梯度胶
电泳法〔6〕从芸香科、蓼科等多种高等植物中检测出 Fe-SOD, 并纯化了枸杞果实〔7〕及菠菜 Fe-SOD。
就菠菜而言, A sada 和 Hayakaw a 等〔8～10〕认为叶绿体中仅含 CuZn-SOD 和 Mn-SOD, 前者存在于基
质和类囊体腔中, 后者存在于类囊体膜上。其后, Kanemat su 等〔11〕在研究叶绿体型和细胞质型 CuZn-
SOD 氨基酸序列时, 提及叶绿体中存在 Fe-SOD, 但未见后续报道。我们通过实验确证菠菜叶绿体中存
在 Fe-SOD〔12〕,本文报道菠菜 Fe-SOD 的纯化及其部分性质。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料为菠菜( Sp inacea oleracea) ,从田间采摘后, 洗净、去叶脉备用。
1. 2　方法
( 1) 超氧化物歧化酶活性测定: 粗酶液及纯化过程中各步骤酶活性测定均用 NBT 光还原法〔13〕,以
抑制光还原率 50%的酶量作为 1个酶活性单位。
( 2) 蛋白质含量测定: 按 Bradford〔14〕方法,以牛血清白蛋白为标准蛋白。
( 3) 同工酶活性谱带分析: 粗酶液上 4%～35%聚丙烯酰胺梯度凝胶, 维持恒压,于 4℃电泳, 使电
压最终达 4 000 V / h 以上〔6〕。蛋白质染色用考马斯亮蓝 R-250。根据 CuZn-SOD 对 KCN 敏感, Fe-SOD
对 H2O 2敏感, M n-SOD 对两者均不敏感的原理, 分别于染液中加入 5 mmo l/ L KCN 和 5 mmo l/ L H2O2
进行同工酶类型鉴定。并应用 Shimadzu 紫外可见薄层扫描仪对凝胶薄板进行SOD 活性密度扫描,扫描
波长为 560 nm ,参照波长为 800 nm。


收稿日: 1998-03-15,修回日: 1998-05-20。第一作者:女, 1970年出生,讲师(硕士生) ,从事植物生理生化教学和
科研工作。
江苏省自然科学基金与应用基础基金资助。
( 4) 酶分子量和亚基分子量测定: 酶分子量用 Sephadex G-100 凝胶层析法测定; 亚基分子量用不
连续系统 SDS -PAGE 法测定。
( 5) 等电点测定: 采用等电聚焦电泳法进行测定。
( 6) 金属元素分析: 在电感耦合等离子直读光谱仪( Ja rr ell-Ash 1100+ 2000 型)上进行。
( 7) 氨基酸组成分析: 按 P ico-Tag TM氨基酸分析系统进行。
2　结果与讨论
2. 1　菠菜 SOD同工酶类型鉴定
聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和抑制剂处理结果显示,叶片 SOD 粗提液中电泳迁移率小的 2 条谱带是
Mn-SOD ,其次是 3 条Fe-SOD, 电泳迁移率大的 2条是 CuZn-SOD(图 1)。同样点样量的粗提液, 用10%
普通胶电泳, 只能检出 Mn-SOD 和 CuZn-SOD(资料未列入) ,表明 Fe-SOD 和 CuZn-SOD 谱带部分重
叠〔7〕。Asada、Hayakaw a等〔8～10〕可能未注意到这种现象, 而忽略了菠菜叶片中 Fe-SOD的存在。
按 SOD 活性谱带扫描峰面积计算, 菠菜叶片中 CuZn-SOD、Fe-SOD 和 Mn-SOD活性分别占酶总活
性的 57. 5%、33. 7%和 8. 8%。纯化叶绿体中上述各类型 SOD 分别占酶总活性的 52. 7%、38. 8%和
8. 5% (图 2) , 可见Fe-SOD 主要定位于叶绿体中。菠菜 Fe-SOD 活性约占 SOD 总活性的 1/ 3 左右,明显
高于其它高等植物, 而与衣藻〔15〕相近,这是否与菠菜富含 Fe元素有关, 尚待深入研究。
1, 2. Mn-SOD;
3～5. Fe-SOD;
6, 7. CuZn-SOD
A, B.酶活性染色;
C.蛋白质染色
A, B w ere enzyme
act ivity s tained;
C w as p rotein
s tained w ith
coom as sie blue
图 1　菠菜叶片SOD粗提液( A)及纯
化的 Fe-SOD ( B, C)的聚丙烯酰胺
凝胶电泳图谱
Fig. 1　PAGE of crude ext ract ( A)
and purif ied Fe-SOD ( B,C ) f rom
Sp inacea oler acea
图 2　菠菜叶片(左)及叶绿体(右) SOD粗提液凝胶电泳扫描图谱
Fig. 2　Scann ing of SOD on gel elect rophoresis f rom crude
ex tract of s pinach leaves ( left ) an d chloroplas ts ( right )
2. 2　菠菜叶片 Fe-SOD 的纯化
参照 Fe-SOD 的纯化步骤〔7〕, 粗酶液经 35%～90%饱和
度硫酸铵分部沉淀、溶解并透析后上 DEAE-纤维素 A 52柱进
行梯度洗脱, 在 50～100 mmo l/ L 磷酸盐缓冲液梯度下除去
CuZn-SOD, 然后在0～200 mmol/ L NaCl (含 100 mmo l/ L 磷酸盐缓冲液 )梯度下洗脱出 Fe-SOD, 并重
复 1次。透析后进行 Sephadex G-100柱层析, 用 200 mmo l/ L NH4HCO 3洗脱, 在经过同样柱层析后,得
到相互重叠的单一的酶活性峰和蛋白峰 (图 1)。
以 Fe-SOD 占酶总活性 33. 75%计算, 3 kg 叶片中 Fe-SOD 总活性约为 26 193. 7 U , 比活为
4. 6 U / mg pro tein。最后纯化得到 2 mg Fe-SOD 蛋白,酶总活性为 314. 6 U , 得率为 1. 2% (表 1)。与菠
菜叶片 CuZn-SOD纯化得率达 40%左右相比〔11〕,显然 Fe-SOD的纯化得率偏低。
2. 3酶的分子量和亚基分子量
Sephadex G-100 凝胶过滤, 流速为 12 mL / h, 每管 2 mL 分部收集,测定 238 nm 处 A 值, 酶的洗脱
123　第 2期　　　　　　　　　　马长艳等:菠菜铁型超氧化物歧化酶的纯化及性质
体积为 35 mL。从牛血清白蛋白、卵清蛋白、胰蛋白酶和细胞色素 C 所作的标准曲线上查得纯酶分子量
为 42. 6 kD。不同来源 Fe-SOD分子量在 36. 5～48 kD范围内,菠菜 Fe-SOD 分子量与银杏〔16〕、番茄〔4〕、
枸杞果实〔7〕等比较接近。
表 1　菠菜 Fe-SOD 的纯化
Table 1　Pur ificat ion o f Fe-SOD fr om Spinach leaves
纯化步骤　
Purif icat ion　
s tep　
总蛋白
( mg)
T otal
protein
总活性
( U)
Total
activity
比活性
( U / mg)
Specif ic
act ivity
纯化步骤
(倍数)
Purif icat ion
( fold)
回收率
( % )
Yield
粗提物
Crude ext ract
5 688. 8 26 193. 7 4. 6 1. 0 100　
35%～90% ( NH4) 2SO 4 1 680. 0 12 386. 7 7. 4 1. 6 47. 3
DEAE-C ellulose-A 52 14. 7 917. 9 62. 4 13. 6 3. 5
Seph adex G-100 2. 0 314. 6 157. 3 34. 2 1. 2
纯化酶在 SDS-PAGE 凝胶电
泳中呈现 1 条单带, 用斜率法求
得亚基分子量为 21 kD, 表明该
酶是由分子量相同的亚基组成的
二聚体。
2. 4酶的等电点
纯化酶经等电聚焦 PAGE
后, 活性染色呈 1条单带,测得菠
菜 Fe-SOD等电点 pI= 4. 6, 与真
核生物相类似〔2～4〕。
2. 5酶的紫外吸收光谱
纯化酶在紫外区最大吸收值为 278 nm, 在 260 nm 和 290 nm 处均可见弱肩形吸收峰(图 3) ,为典型
的 Fe-SOD紫外吸收光谱〔7, 16～18〕。
2. 6酶的金属元素分析
纯化的 Fe-SOD每分子含 2. 6 个铁原子, 明显高于欧洲萍蓬草〔3〕、番茄〔4〕等的 Fe-SOD, 而与细致虫
藻〔19〕、簇生鞭毛虫〔20〕的 Fe-SOD 接近。该酶每个亚基还含有 1. 6 个锌原子以及 0. 2 个铜原子。不同来源
的 Fe-SOD中锌元素含量常占一定比例,其作用有待阐明。
图 3　菠菜 Fe-SOD的吸收光
谱(酶蛋白浓度 0. 32 mg/ mL ,
光径 1 cm )
Fig. 3　Absorpt ion spect rum
of Fe-SOD from Spinacea
oleracea ( w ith a enzyme
pr otein concent ration of
0. 32 mg/ mL and a l ight
path of 1 cm)
表 2　菠菜与某些高等植物及原核生物 Fe-SOD的氨基酸组成比较
T able 2　A compa rison o f amino acid composition of Fe-SOD from
Sp inacea oleracea with those fr om o ther higher plants and proca ry otes
氨基酸
Am ino acid
Fe-SOD( residues / mol)
Sp inacea
oler acea
L ycop ersicon〔4)
esculeutum
L ycium〔7〕
chinese
P lectonema〔21〕
boryanum
E. coli〔22〕
Lys 21 20 16 24 20
His 3 8 5 10 12
Arg 8 8 11 3 8
Asp 37 38 42 47 44
Th r 17 18 19 20 26
Ser 27 16 32 18 20
Glu 35 28 32 32 32
Pro 22 24 28 20 18
Gly 51 20 57 29 32
Ala 37 32 29 48 52
Cys 1 - 2 2 2
Val 23 20 20 21 22
Met 8 8 3 3 0
Ile 16 16 15 5 16
Leu 29 36 29 34 30
T yr 4 12 9 10 12
Phe 15 18 11 25 20
T rp - 14 8 11 8
2. 7酶的氨基酸组成
菠菜 Fe-SOD 的氨基酸组成见表 2。由表 2 可看出,菠菜 Fe-SOD 的氨基酸组成中,甘氨酸含量较
124 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　
高, 组氨酸和酪氨酸含量较低,与枸杞 Fe-SOD 类似。其它氨基酸组成则与番茄最为接近,且与蓝绿藻、
大肠杆菌较为接近。可为高等植物 Fe-SOD从原核生物演化而来〔1, 4〕的观点提供证据。
参 考 文 献
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125　第 2期　　　　　　　　　　马长艳等:菠菜铁型超氧化物歧化酶的纯化及性质
PURIFICATION AND PROPERTIES OF AN
IRO-CONTAINING SUPEROXIDE DISMUTASE FROM
SPINACH LEAVES, SPINACEA OLERACEA
Ma Changyan　Wei Jincheng　Cheng Guangyu　Wu Guorong
( Dep artment of Biology, N anj ing N ormal Univ ersity　Nanjin g　210097)
Abstract　Iron-super ox ide dismutase was found in the crude ext ract from leaves o f Sp inacea oleracea af-
ter gr adient PAGE analysis. The enzyme was iso la ted and purified to homogeneity by using ammonium
sulfate fr act ionat ion follow ed by DEAE-Cellulose-A 52 chr om atog raphy and Sephadex G-100 gel filtr a-
tion. T he mo lecula r mass of the pur ified Fe-SOD is about 42. 6 kD, and its subunit mo lecula r mass is
about 21 kD. Metal analy sis r evea ls that the pro tein conta ins about 2. 6 g ram atoms o f ir on per
molecule. The purified enzyme exhibits one abso rption max imum in t he ult rav io let at 278 nm with a low
shoulder of abso rption at 260 nm and 290 nm . It s isoelectr ic point is 4. 6. In t he aspects o f amino acid
composit ion, the enzyme from spinach is most similar to Fe-SOD fr om o ther sour ces.
Key words　Fe-SOD, Spinach, Pur ification, Pr oper ty
126 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷