全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(1): 76−83 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目 (31101166, 30971798), 江苏省农业科技自主创新资金 [CX(11)2052], 江苏省自然科学基金
(BK2010474)和国家科技支撑计划项目(2011BAD35B06-4-3)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 易金鑫, E-mail: yij@jaas.ac.cn, Tel: 025-84391105
第一作者联系方式: E-mail: cotton.z@126.com
Received(收稿日期): 2012-02-21; Accepted(接受日期): 2012-09-05; Published online(网络出版日期): 2012-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121114.1643.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00076
大豆 GmTIP1;1基因的克隆与表达分析
张大勇 1 胡国民 3 易金鑫 1,* 许 玲 1 Ali ZULFIQAR 4 刘晓庆 1
袁玲玲 2 徐照龙 1,2 何晓兰 1 黄益洪 1 马鸿翔 1
1 江苏省农业生物学重点实验室 / 江苏省农业科学院农业生物技术研究所 , 江苏南京 210014; 2 南京农业大学农学院 , 江苏南京
210095; 3扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009, 4 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Fais-
alabad 38040, Pakistan
摘 要: 利用 RT-PCR方法从大豆根部组织获得 Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长, 经测序验证、Blast比对与
同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的 TIP1;1 蛋白具有较高的相似性 , 故命名为 GmTIP1;1 基因
(GenBank登录号为 AK285481), 该基因 ORF长 753 bp, 编码 1个包含 250个氨基酸的蛋白, 在 ORF内部第 381个核
苷酸处含有 1 个 94 bp 的内含子, 符合↓GT--AG↓的剪接方式; 系统进化树分析发现 GmTIP1;1 聚类到豆科植物分支,
其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支 , 推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据之一 ; 半定量
RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平, 暗示该基因在植
物的整个发育进程中均具重要作用; 在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势, 但仍然保持较高的表达水平;
以 pYES2为酵母表达载体, 转化酿酒酵母 INVSc1菌株, 获得重组酵母 INVSc1 (pYES2-GmTIP1;1), 转化菌株在盐胁
迫下的存活率明显高于对照 INVSc1 (pYES2), 而在干旱胁迫下则没有显著差异, 表明该基因的表达能有效地提高酵
母的耐盐性。
关键词: GmTIP1;1; 组织表达; 诱导表达; 酵母表达
Isolation and Expression Analysis of GmTIP1;1 in Soybean (Glycine max L. Merr.)
ZHANG Da-Yong1, HU Guo-Min3,YI Jin-Xin1,∗, XU Ling1, Ali ZULFIQAR4, LIU Xiao-Qing1, YUAN
Ling-Ling2, XU Zhao-Long1,2, HE Xiao-Lan1, HUANG Yi-Hong1, and MA Hong-Xiang1
1 Provincial Key Laboratory of Agrobiology / Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2 College
of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3 College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou
225009, China; 4 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Faisalabad 38040, Pakistan
Abstract: The full length open reading frame (ORF) of gene named Glyma03g34310.1 was amplified from the soybean root tis-
sues by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Sequencing, Blast and homology analyses showed that
the amino acids encoded by this gene had the higher similarity with the TIP1;1 from other species, so designated GmTIP1;1
(GenBank accession number: AK285481), its ORF was 753 bp, encoded a polypeptide with 250 amino acids, and contained a 94
bp intron at the site of the 381th nucleotide complying with the ↓GT--AG↓ mode of splicing. GmTIP1;1 had two copies in the
soybean genome, with the other one of Glyma19g37000.1. Multiple alignment using protein indicated that GmTIP1;1 contained
six conserved transmembrane domains and two higher conserved NPA motifs. Phylogenetic tree analysis using MEGA5.05
showed that GmTIP1;1 was indeed grouped into the legumes clade and several different clades which belonged to the different
plant coleus were regularly separated based on the TIP1;1 protein sequences, which implied that TIP1;1 sequence probably could
be regard as a proof of plant taxonomy. Semi-quantity RT-PCR analysis demonstrated that the GmTIP1;1 gene constitutively ex-
pressed in soybean organs including root, stem, leaf, flower and pod, and the expression levels were no obvious difference in dif-
ferent tissues at the different developmental stages, which implied GmTIP1;1 gene plays important roles in plant growth. The
第 1期 张大勇等: 大豆 GmTIP1;1基因的克隆与表达分析 77


expression of GmTIP1;1 appeared a declined trend at the different time points under the treatment of salt solution (200 mmol L–1
NaCl), although still showing the abundant transcript. In addition, the recombinant plasmid pYES2-GmTIP1;1 was constructed by
inserting the GmTIP1;1 gene into the yeast expression vector pYES2. The recombinant plasmid pYES2-GmTIP1;1 was trans-
formed into yeast Saccharomyces cerevisiae INVScl, then treated with salt and drought stresses, respectively. The results showed
that the survival rate of the recombinant yeast INVScl (pYES2-GmTIP1;1) was higher than that of the control strain under salinity
condition, but no difference under drought condition. These results indicated that the heterologous expression of GmTIP1;1 could
effectively improve the tolerance of yeast to salinity stress.
Keywords: GmTIP1;1; Tissues expression; Induced expression; Yeast expression
水通道蛋白(aquaporin, AQP)是近年发现的一类
专一运输水分的质膜或液泡膜上 26~30 kD 的内在
蛋白, 与离子通道、甘油通道等功能通道蛋白同属
MIP (major instrinsic protein)蛋白家族。
水通道蛋白是细胞水分运输的一个重要组成成
分。水通道蛋白家族利用跨膜的水分梯度进行水分
运输, 调节细胞膜的水分传导, 增强水分透性(可使
水分透性提高 10~20倍), 在水分调节方面起重要作
用[1]。约 70%~90%的体内水分运动通过水通道蛋白
完成, 水通道蛋白可较好地解释水分流动的共质体
途径和跨细胞途径。相关研究结果表明: 质膜 AQP
(plasma membrane intrinsic proteins, PIP)负责水分的
吸收与外排, 液泡 AQP (tonoplast intrinsic proteins,
TIP)负责调节膨压, 因而细胞结构的完整性得以维
持[2]。盐和干旱胁迫下, 水通道蛋白可能具有调节水
分通过细胞膜速度的功能[3-4]; 水分的跨膜运输还与
水通道蛋白的活性有关, 水通道蛋白上存在多个磷
酸化位点, 其开关受磷酸化和去磷酸化调节[5]。在菠
菜中, 低水势能降低水通道蛋白 PM28A 的磷酸化程
度, 而磷酸化程度降低导致水分通透能力下降[6]。 来
自郁金香的 2 个水通道蛋白基因 TgPIP2;1 和
TgPIP2;2 在毕赤酵母中过表达时, 蛋白激酶和蛋白
磷酸酶影响它们在酵母细胞中的水通道活性, 这表
明水通道蛋白的活性受磷酸化调节[7]。总体来说, 植
物水通道蛋白具有促进水的长距离运输、细胞内外
的跨膜水运输、调节细胞涨缩及运输小分子物质的
功能, 一些水通道蛋白与植物响应水分胁迫有关[8]。
水孔蛋白、H+/ATPase 和 Na+/H+反向运输蛋白在调
节细胞水势和胞内盐离子分布中起信号传导作用。
植物体可以通过调控水孔蛋白等膜蛋白以加强细胞
与环境的信息交流和物质交换, 改变膜对水分的通
透性, 实现渗透调节, 增强植物的抗旱、耐盐能力。
在完成大豆全基因组测序之后, 一些在植物生
理生化过程中起重要作用的关键基因的挖掘成为目
前的主要任务。为发掘大豆抗逆关键基因, 本研究
对大豆的 6个水通道蛋白进行了功能测试 , 探索其
中 1 个液泡膜水通道蛋白基因 GmTIP1;1 的过表达
对外界盐胁迫的耐性, 同时检测转基因酵母对外界
盐胁迫的耐性, 以期为通过基因工程改良重要农艺
性状所需基因资源的储备奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料、菌株和试剂
大豆材料 Willimas82由南京农业大学植物保护
学院窦道龙教授惠赠, 大肠杆菌菌株 DH5α 为本实
验室保存。pGEM-T Easy Vector T克隆试剂盒、Taq
DNA聚合酶、DNA marker、Trizol reagent、T4 DNA
连接酶来自 Fermentas 公司; 反转录试剂盒购于上
海捷瑞生物工程有限公司; 酵母表达载体 pYES2、
酿酒酵母 INVScI 和引物均由上海英骏生物技术有
限责任公司(invitrogen)提供, DNA 纯化回收试剂盒
购于 Promega 公司, 其他生物学试剂购自上海皓嘉
科技发展有限公司。
1.2 总 RNA提取和 cDNA合成
将幼苗期的根、茎、叶, 开花期的茎、叶、花
和结荚期的茎、叶、荚, 以及经 200 mmol L–1 NaCl
溶液分别处理 0 (对照)、2、4、8、12、24 和 36 h
的根部组织等样品在液氮中研磨后用 Trizol 提取总
RNA, 经 DNaseI 消化去除 DNA, 并经质量体积分
数 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的浓度和完整
性。采用上海捷瑞生物工程有限公司反转录试剂盒
合成 cDNA。
1.3 基因克隆
利用 RT-PCR 方法从大豆幼苗根部组织 mRNA
中扩增全长开放阅读框(ORF), 所用正向引物序列
为 Primer F: 5-ATGCCGATCAGAAACATCGCCA-
TC-3和反向引物序列为 Primer R: 5-CTAGTAGT-
CAGTGCTGGGAAGCT-3, 以基因组为模板扩增基
因全长 DNA 序列 , 扩增体系包括适量 cDNA 或
DNA稀释样, 10×PCR buffer 2.5 µL, 10 mmol L–1
dNTPs 0.5 µL, 25 mmol L–1 MgCl2 1.5 µL, 10 mmol
L–1上下游引物各 1 µL, 5 U mL–1Taq DNA聚合酶 0.2
78 作 物 学 报 第 39卷

µL, ddH2O补足至 25 µL。反应程序为: 94℃预变性
3 min; 94℃变性 45 s, 55℃复性 45 s, 72℃延伸 1 min,
35 个循环; 72℃延伸 10 min。将 PCR 产物连入
pGEM-T Easy Vector T克隆试剂盒载体中, 送交南
京金思瑞生物科技有限公司测序, 重复 3 次, 获得
目的序列。
1.4 序列分析
采用 BlastP 搜索 NCBI 的核苷酸和蛋白质数据
库进行序列相似性分析及氨基酸保守性预测; 利用
ClustalX 进行氨基酸序列比对及功能结构域查找与
相似序列分析 ; 利用 http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/
form.html 在线预测蛋白亚细胞定位 ; 利用 http://
www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/在线预测蛋白分泌
部位; 采用MEGA 5.05程序获得进化树, 保存 JEPG
格式备用。
1.5 基因表达分析
采用半定量 RT-PCR 分析法, 利用提取的幼苗
根、茎、叶组织和花以及豆荚的 cDNA 为模板检测
基因组织表达情况。利用 200 mmol L–1 NaCl溶液处
理 2、4、8、12、24和 36 h的根部组织 cDNA为模
板来分析基因的诱导表达 , 基因正向引物序列为
5-ATGCCGATCAGAAACATCGCCATC-3, 反向引
物序列为 5-CTAGTAGTCAGTGCTGGGAAGCT-3,
以大豆持家基因 GmActin (Glycine max actin-1-like)
(登录号为XM_003552652)为内参, 正向引物序列为
5-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3, 反向引物序
列为 5-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3, 扩增
体系总体积为 25 µL, 包括适量 cDNA 稀释样 ,
10×PCR buffer 2.5 µL, 10 mmol L–1 dNTPs 0.5 µL, 25
mmol L–1 MgCl2 1.5 µL, 引物各 1 µL, 5 U mL–1 Taq
DNA聚合酶 0.2 µL, ddH2O补足至 25 µL。反应程序
为; 94℃预变性 3 min; 94℃变性 45 s, 55℃复性 45 s,
72℃延伸 1 min, 26~29个循环; 72℃延伸 10 min。
1.6 GmTIP1.1 基因酵母表达载体的构建及酵母
转化与处理
根据大豆 GmTIP1;1 基因的序列设计酵母表达
引物, YGmTIP1.1F 序列为 5-ATGCGGCCGCATG
CCGATCAGAAACATCGCCATCGG-3, YGmTIP1.1R:
序列为 5-GCCTCGAGCTAGTAGTCAGTGCTGG
GAAGCT-3, 2个引物分别带有 Not I和 Xho I酶切
位点, 以根部组织 cDNA 为模板, 扩增获得该基因
ORF 全长、检测、回收和纯化后与酵母表达载体
pYES2 连接, 重组质粒双酶切和测序验证, 用乙酸
锂沉淀法[9]转入酿酒酵母 INVSc I (Saccharomyces
cerevisiae), 以转入空载体为对照, 将重组酵母分别
命 名 为 INVScI (pYES2-GmTIP1;1) 和 INVScI
(pYES2); 为了验证非转基因酵母与转质粒酵母在
正常生长条件下是否具有相同的生长势, 在 30℃条
件下, 将等摩尔数的 INVScI (pYES2-GmTIP1;1)、
INVScI (pYES2)和 INVScI, 不稀释以及分别稀释
100、1000和 10 000倍后, 吸取 2 µL接种在 YPDA
固体培养基上, 过夜培养后观察 3 种酵母的生长势;
酵母胁迫处理实验参照潘妍等[10]方法, 分别为质量
体积分数 30% PEG6000和 5 mol L–1 NaCl溶液处理
40 h, 以水处理为对照, 实验重复 3次, 实验结果经
UNISCANC1880平板扫描仪扫描。
2 结果与分析
2.1 GmTIP1;1基因的克隆
利用 perl 脚本软件下载大豆全基因组水通道蛋
白基因[11], 挑选其中的 6个MIP基因, 包括 3个 PIP
(Glyma13g40100.1、Glyma14g06680.1 和 Glyma16-
g27140.1); 2 个 TIP (Glyma03g34310.1、Glyma13g-
40820.1)和 1个 NIP (NOD26-like intrinsic proteins,
Glyma09g37280.1)类基因进行关键耐逆基因的精
选。根据它们的 ORF (open reading frame)全长设计
上下游引物序列, 利用 RT-PCR 方法从大豆幼苗的
不同器官中扩增获得序列, 结果发现除了 NIP 在大
豆所有的器官中都不表达外, 其他 5个基因都获得了
相应的序列 , 测序比对表明这 5个基因均与 http://
www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/soybean/网站提
供的序列一致; 构建了这些基因的过表达载体, 注
射发根农杆菌获得组合苗, 在干旱和盐胁迫处理下
发现只有转过表达 Glyma03g34310.1 基因的大豆幼
苗耐盐, 但不耐干旱; BlastP分析发现该基因编码蛋
白序列与水稻、拟南芥、玉米等植物中 TIP1; 1同源
性较高 , 故命名为 GmTIP1;1 (GenBank 登录号为
AK285481), 该基因 ORF 长 753 bp, 编码 1 个包含
250个氨基酸的蛋白。
2.2 GmTIP1;1基因的序列分析
利用 http://www.soybase.org/网站提供的 Blast
程序比对发现, 该基因在大豆基因组中共有2个拷贝,
一个为 Glyma03g34310.1, 另一个为 Glyma19g-
37000.1, 它们都含有 MIP 家族蛋白保守结构域, 二
者编码的蛋白序列仅有 4 个氨基酸的差别 , 但
Glyma03g34310.1 位于第 3 染色体; 而 Glyma19g-
第 1期 张大勇等: 大豆 GmTIP1;1基因的克隆与表达分析 79


37000.1 基因位于第 19 染色体; 为了进一步了解二
者的基因结构, 利用上下游引物同时扩增了基因的
基因组 DNA 序列, 发现该基因仅有 1 个长度为 94
bp的内含子, 符合↓GT--AG↓的剪接方式。多重序列
比对发现 GmTIP1; 1具有水通道蛋白在进化过程中
形成的 2 个保守的“NPA”基序和 6 个跨膜区(图 1);
系统进化树分析发现, 豆科、十字花科、茄科、锦
葵科和大戟科植物分别聚类为不同的分支, 而且十
字花科是与豆科亲缘关系最近的 , 其次是锦葵科 ,
亲缘关系最远的为茄科植物, 表明该蛋白氨基酸序
列可以作为植物分类的依据 , 即植物“条形码”(图
2)。由于水通道蛋白上存在多个磷酸化位点, 其开关
受磷酸化和去磷酸化调节 , 因此利用 http://www.
predictprotein.org/在线分析软件预测该蛋白在 N-端
第 19 位的“TLK”存在 1 个蛋白激酶 C 磷酸化位点;
第15位“THPD”基序和161位“TAVD”基序分别具有酪
蛋白激酶 II 磷酸化位点 ; 而且在第 83 位的
“HVNPAVTFG”和第 196 位的“AMNPAVTFG”基序内
具有 2 个典型的 MIP 家族信号肽。利用 http://psort.
ims.u-tokyo.ac.jp/form.html 在线软件预测分析发现 ,
该蛋白位于质膜(确信度0.6); 利用http://www.cbs.dtu.dk/
services/TargetP/分析表明, 该蛋白不属于分泌蛋白。

图 1 GmTIP1;1蛋白氨基酸序列与其他物种 TIP蛋白的多重比对
Fig. 1 Multiple sequence alignment of GmTIP1;1 protein amino acids with that of other species
TM1-6代表 6个跨膜区域, 2个方框表示 MIP家族蛋白的保守“NPA”基序。
TM1-6 represent six the membrane-spanning helices of GmTIP1.1; two boxes present two conserved “NPA” motifs of the MIP
superfamily protein.

2.3 GmTIP1;1基因的表达分析
利用 http://soybase.org/soyseq/index.php 在线预
测 Glyma03g34310.1 和 Glyma19g37000.1 的数字表
达表明, 它们在根中的表达量极高, 分别为 2244和 1181
(标准化后的数据), 其次是 21DAF (days after flower-
ing)种子(835)和(1119), 这种差异可能是由于二者启
80 作 物 学 报 第 39卷

动子序列差异造成的。序列分析发现Glyma03g34310.1
和 Glyma19g37000.1基因 m RNA序列第 22 bp (A/G)
和 740 bp (G/C)处即正向引物和反向引物中分别有一
个单核苷酸的多态性 SNP (single nucleotide polymor-
phism)位点, 且靠近 3端, 引物序列可以特异地分析
Glyma03g34310.1 的表达特征。同时 , 利用半定量
RT-PCR 分析大豆的根、茎、叶、花和幼荚的不同器
官的表达, 发现该基因是组成型表达的, 在各个组织
中都有表达, 且表达量较高。对大豆幼苗期的茎叶、
开花期的茎叶花和结荚期的茎叶和荚部位的表达分析
表明, 该基因在不同发育阶段不同组织的表达也是组
成型的, 表明该基因在植株的整个生长过程和不同的
器官中都起着重要作用(图 3)。根部组织经 200 mmol
L–1 NaCl 溶液处理不同时间点的表达情况表明, 从处
理前一直到处理 36 h后, 该基因的表达都处于较高的
水平, 并有下降的趋势(图 4)。
2.4 INVSc1 (pYES2-GmTIP1;1)重组酵母对逆
境胁迫的抗性分析
经过夜培养后观察发现 3 种酵母的长势基本
相同(图 5-A), 这表明在非胁迫处理条件下 , 它们


图 2 利用 MEGA5.05软件对 GmTIP1;1氨基酸序列和来源于其他植物 TIP1;1氨基酸序列的系统进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic tree based on alignment of amino acid among GmTIP1;1 and some TIPs published previously by MEGA5.05 software
豆科植物: LjTIP来自百脉根, TrgammaTIP来自白三叶草, PsTIP来自豌豆, MtAQP1来自苜蓿, MsMCP1来自紫花苜蓿, MpTIP1-1来自
含羞草; 十字花科植物: SaTIP来自野芥, bobTIP26-1来自花椰菜, AtTIPO1-1来自拟南芥, BnTIP来自油菜; 锦葵科: GhTIP、TIP1-4、
TIP1-5、TIP1-6和 TIP1-8来自棉花; Pcgamma TIP来自西洋梨(蔷薇科), HaTIP来自半日花(半日花科); 大戟科: HbTIP来自巴西橡胶树;
RcTIP来自蓖麻; VvTIP来自葡萄(葡萄科); 茄科: SlTIP来自番茄; NtTIP来自烟草; Nggamma TIPl光烟草; DcTIP来自胡萝卜(伞形科)。
标尺 0.02表示分支长度。
Legumes: LjTIP from Lotus japonicus, TrgammaTIP from Trifolium repens, PsTIP from Pisum sativum, MtAQP1 from Medicago truncatula,
MsMCP1 from Medicago sativa, MpTIP1-1 from Mimosa pudica. Cruciferae: SaTIP from Sinapis arvensis, bobTIP26-1 from Brassica
oleracea var. botrytis, AtTIPO1-1 from Arabidopsis thaliana, BnTIP from Brassica napus, GhTIP, TIP1-4, TIP1-5, TIP1-6, and TIP1-8 from
Gossypium hirsute (Malvaceae); Pcgamma TIP from Pyrus communis (Rosaceae); HaTIP from Helianthemum almeriense (Cistaceae); HbTIP
from Hevea brasiliensis; RcTIP from Ricinus communis (Euphorbiaceae); VvTIP from Vitis vinifera (Vitaceae); SlTIP from Solanumlycoper-
sicum; NtTIP from Nicotiana tabacum; N ggamma TIPl from Nicotiana glauca (Solanaceae ); DcTIP from Daucus carota (Umbelliferae).
The scale bar (0.02) is used to measure the branch length.
第 1期 张大勇等: 大豆 GmTIP1;1基因的克隆与表达分析 81



图 3 GmTIP1;1基因的组织表达特征
Fig. 3 Expression patterns of GmTIP1;1 in different organs and different stages
A: GmActin为内参基因, 在大豆根(R)、茎(S)、叶(L)、花(F)和豆荚(P)组织中表达情况; B: GmActin为内参基因, 在大豆不同器官不同发育时
期的表达分析, 其中, 1为三叶期幼苗茎, 2为三叶期幼苗叶, 3为开花期茎, 4为开花期叶, 5为幼花, 6为结荚期茎, 7为结荚期叶, 8为幼荚。
A: GmActin is the reference gene, the expression pattern of GmTIP1;1 in organs of root, stem, leaf, flower, and pod. B: GmActin is the refer-
ence gene, the expression pattern of GmTIP1;1 in different organs at different stages. 1: stem at three-leaf stage; 2: leaf at three-leaf stage;
3: stem at flowering stage; 4: leaf at flowering stage; 5: flower; 6: stem at podding stage; 7: leaf at podding stage; 8: younger pods.


图 4 GmTIP1;1在 200 mmol L–1 NaCl溶液胁迫处理不同时间
点的表达
Fig. 4 Expression pattern of GmTIP1;1 at different time
points with 200 mmol L–1 NaCl solution

具有相同的生长势 ; 当用 30% PEG6000 模拟干旱
处理 40 h后 , INVScI (pYES2-GmTIP1;1)和 INVScI
(pYES2)在稀释不同倍数后的生长情况没有显著
的差异 ; 然而 , 当用 5 mol L–1 NaCl 处理 40 h 后 ,
二者均能够生长 , 但 INVScI (pYES2-GmTIP1;1)
的存活率显著高于 INVScI (pYES2)(图 5-B~C), 这
表明由于 GmTIP1;1 基因的异源表达 , 使得
INVScI (pYES2-GmTIP1;1)对 NaCl 胁迫的耐受能
力明显增强 , 说明 GmTIP1;1 具有耐盐胁迫的能
力。

图 5 正常生长条件下不同类型酵母的生长情况和 GmTIP1;1基因耐胁迫分析
Fig. 5 Growth of different yeasts under normal condition and the tolerance analysis of GmTIP1;1 under stresses
A: 不同类型酵母经不稀释、稀释 100倍、1000倍和 10 000后在培养基上的生长情况; B: 经 30%PEG处理后经不稀释、稀释 100倍、1000倍
和 10 000倍的生长情况; C: 经 5 mol L–1 NaCl处理后经不稀释、稀释 100倍、1000倍和 10 000倍的生长情况, Control为水处理 40 h后的酵母。
A: growth of different yeasts diluted at 100, 1000, and 10 000 folds under normal situation; B: growth of different yeasts diluted at 100 folds,
1000 folds, and 10 000 folds under 30%PEG; C: growth of different yeasts diluted at 100 folds, 1000 folds, and 10 000 folds under 5 mol L–1
NaCl; control is the yeast treated with water.
82 作 物 学 报 第 39卷

3 讨论
植物 MIP 蛋白序列的多重比对分析表明, MIP
能被分为 3 个亚组, 包括液泡膜水通道蛋白(TIP)、
细胞质膜水通道蛋白和大豆结瘤素-26 和拟南芥结
瘤素-26 水通道蛋白[12]; 之后研究者又在此基础上
进行了更为细致的分类, 细分出 SIPs (small basic
intrinsic protein)和未被鉴定的 XIP (X intrinsic pro-
tein)两类[13-15]。液泡膜水通道蛋白亚家族又被细分
为不同的亚类, 如 TIPX;X (X=1, 2, 3, …, n)和 TIP
(a、b和 gamma)。根据 BlastP和多重序列比对结果,
本研究克隆的 TIP基因与其他植物的 TIP1;1型具有
较高的相似性, 故命名为 GmTIP1;1, 该基因序列由
Umezawa等[16]于 2008年上传 NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/) GenBank 数据库, 但并没有对该基因
进一步研究, 本文在前期序列获取和功能测试的前
提下, 继续对其进行了相关的深入研究。
TIP 类蛋白负责调节细胞膨压, 维持细胞结构
的完整性 ; 水通道蛋白具有 6个典型的跨膜保守结
构和 2个保守的 NPA (Asn-Pro-Ala)基序[17], 通常以
四聚体存在于膜结构上, 每个单聚体单独形成一个
独立的孔[18], GmTIP1;1也具有 6个典型的跨膜结构
域和两个非常保守的“NPA”基序, 暗示该类蛋白在
进化与功能上具有一定的保守性; 利用进化树分析
软件对该蛋白与其他来自不同植物科的植物相似蛋
白序列分析发现, 豆科植物、茄科植物和其他几种
不同科的植物都分别聚类为不同的分支, 而且豆科
植物的该蛋白 N-端第 60位氨基酸残基为丝氨酸(S),
而其他植物该部位氨基酸残基为天冬氨酸(A), 说明
可以把该蛋白的氨基酸序列作为植物分类的分子证
据之一。
前期的研究表明, 水通道蛋白基因在植物所有
的组织中都能够表达, 并且其时空表达特征依赖发
育时期和环境条件[19-20]; Park等[21]利用半定量RT-PCR
的方法发现棉花水通道蛋白基因大部分是组成型表
达, 只有少数为组织特异表达。本研究克隆的基因
在大豆各个组织中都有表达, 而且在不同组织的不
同发育时期表达水平都没有差异, 表明该基因在大
豆植株的整个生长发育过程都起着重要作用。在逆
境条件下, 如干旱、盐害、渗透胁迫等, 在转录水平
以及蛋白质水平上大多数水通道蛋白基因表达下调,
从而导致通道活性下降甚至消失, 最终限制了植物
体内水分流失, 以维持体内水分平衡, 增加植物对
胁迫因子的耐受能力[22], 而另有报道称水通道蛋白
基因在水分胁迫或冷害胁迫下的表达要么上调, 要
么下调[23], 在盐浓度为 200 mmol L–1不同时间点的
胁迫下, GmTIP1;1基因的表达也呈现下降表达的趋
势, 这表明该基因的下调表达可能导致通道活性下
降, 最终处于关闭状态, 进而限制外界盐离子进入
细胞或液泡, 以维持体内外的离子平衡, 增加大豆
植物对盐胁迫的耐受能力; 然而, 当过表达该基因
时, 转基因复合植株则表现出对外界盐胁迫具有一
定的耐性(结果未给出), 可能是通过增加水通道分
子数来加速细胞内外离子交换, 最终使细胞内部盐
离子浓度降低达到增强植物耐盐性的目的, 同时将
该基因转入酵母细胞中也显著提高了对外界盐胁迫
的耐性, 而对干旱胁迫没有显著响应差异, 本研究
通过植物表达系统和酵母表达系统来同时验证基因
功能, 在一定程度上提高了基因功能验证的效率和
准确性, 但是详细的分子机制仍需要进一步研究。
为了更加清晰地阐明该基因是否在植物抵御盐胁迫
过程中发挥作用, 以构建过表达载体转化大豆子叶
节获得了组合转基因植株, 在盐胁迫处理下该植株
表现一定的耐性。该基因的确切功能以及耐盐机制
仍然需要进一步验证。
4 结论
克隆了 GmTIP1;1基因, 该基因 ORF长 753 bp,
编码一个包含 250 个氨基酸的蛋白 , 在 ORF 内部
第 381 个核苷酸处含有 1 个 94 bp 的内含子, 以
↓GT--AG↓为剪接方式; 其氨基酸序列与其他植物的
TIP1;1 蛋白有高度的相似性, 尤其是与百脉根的相
似性极高; Gm TIP1;1被聚类到豆科植物分支; 该基
因在大豆的不同器官, 以及不同器官的不同发育阶
段表达都比较高且保持同等的表达水平; 在盐胁迫
处理的不同时间点其表达量有下降的趋势, 但仍然
保持较高的表达水平; 该基因的表达能有效地提高
酵母的耐盐性。
References
[1] Maurel C, Chrispeels M J. Aquaporins: a molecular entry into
plant water relations. Plant Physiol, 2001, 125: 135–138
[2] Fotiadis D, Jeno P, Mini T, Wirtz S, Muller S A, Fraysse L,
Kjellbom P, Engel A. Structural characterization of two
aquaporins isolated from native spinach leaf plasma membranes.
J Biol Chem, 2001, 276: 1707–1714
[3] Chrispeels M J, Crawford N M, Schroeder J I. Proteins for
transport of water and mineral nutrients across the membranes of
第 1期 张大勇等: 大豆 GmTIP1;1基因的克隆与表达分析 83


plant cells. Plant Cell, 1999, 11: 661–675
[4] Azaizeh H, Steudle E. Effects of salinity on water transport of
excised maize roots. Plant Physiol, 1991, 97: 1136–1145
[5] Johansson I, Larsson C, Kjellbom P. The major integral proteins
of spinach leaf plasma membrane are putative aquaporins and are
phosphorylated in response to Ca2+ and apoplastic water potential.
Plant Cell, 1996, 8: 1181–1191
[6] Johansson I, Karlsson M, Shukla V K, Chrispeels M J, Larsson C.
Water transport activity of the plasma membrane aquaporin
PM28A is regulated by phosphoryl a channel-mediated water
pathway. Plant Cell, 1998, 10: 451–459
[7] Abul K A, Yoshihiro S, Takahiro I, Hitoshi S. Heterologous ex-
pression of tulip petal plasma membrane aquaporins in Pichia
pastoris for water channel analysis. Appl Environ Microbiol,
2009, 75: 2792–2797
[8] Aharon R, Shahak Y, Wininger S, Bendov R, Kapulnik Y, Galili
G. Overexpression of a plasma membrane aquaporin in transgenic
tobacco improves plant vigor under favorable growth conditions
but not under drought or salt stress. Plant Cell, 2000, 15:
439–447
[9] Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning of Laboratory
Manual. Beijing: Science Press, 2005. pp 1596–1597
[10] Pan Y(潘妍), Wang Y-C(王玉成), Zhang D-W(张大伟), Yang
C-P(杨传平). Cloning and stress tolerance analysis of an LbGRP
gene in Limonium bicolor. Hereditas (遗传 ), 2010, 32(3):
278–286 (in Chinese with English abstract)
[11] Zhang D-Y(张大勇), Wang C-B(王长彪), Yi J-X(易金鑫), He
X-L(何晓兰), Ma H-X(马鸿翔). Perl-based high-throughput nu-
cleotide sequence extraction in soybean (Glycine max L. Merri.).
J Nanjing Agric Univ (南京农业大学学报), 2012, 35(1): 7–13
(in Chinese with English abstract)
[12] Weig A, Deswarte C, Chrispeels M J. The major intrinsic protein
family of Arabidopsis has 23 members that form three distinct
groups with functional aquaporins in each group. Plant Physiol,
1997, 114: 1347–1357
[13] Chaumont F, Barrieu F, Wojcik E, Chrispeels M J, Jung R.
Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family
in maize. Plant Physiol, 2001, 125: 1206–1215
[14] Johanson U, Karlsson M, Johansson I, Gustavsson S, Sjövall S,
Fraysse L, Weig A R, Kjellbom P. The complete set of genes en-
coding major intrinsic proteins in Arabidopsis provides a frame-
work for a new nomenclature for major intrinsic proteins in
plants. Plant Physiol, 2001, 126: 1358–1369
[15] Danielson J A, Johanson U. Unexpected complexity of the
aquaporin gene family in the moss Physcomitrella patens. BMC
Plant Biol, 2008, 8: 45
[16] Umezawa T, Sakurai T, Totoki Y, Toyoda A, Seki M, Ishiwata A,
Akiyama K, Kurotani A. Sequencing and analysis of approxi-
mately 40000 soybean cDNA clones from a full-length-enriched
cDNA library. DNA Res, 2008, 15: 333–346
[17] Fujiyoshi Y, Mitsuoka K, de Groot, B L, Phlllppsen A, Grubmu-
ller H. Structure and function of water channels. Curr Opin Struct
Biol, 2002, 12: 509–515
[18] Luu D T, Maurel C. Aquaporins in a challenging environment:
molecular gears for adjusting plant water status. Plant Cell Envi-
ron, 2005, 28: 85–96
[19] Wudick M M, Luu D T, Maurel C. A look inside: localization
patterns and functions of intracellular plant aquaporins. New
Phytol, 2009, 184: 289–302
[20] Heinen R B, Ye Q, Chaumont F. Role of aquaporins in leaf physio-
logy. J Exp Bot, 2009, 60: 2971–2985
[21] Park W, Bauer P J, Scheffler B E, Campbell B T. Identification of
the family of aquaporin genes and their expression in upland
cotton (Gossypium hirsutum L.). BMC Plant Biol, 2010, 10: 142
[22] Kaldenhoff R, Fischer M. Aquaporins in plants. Acta Physiol,
2007, 187: 169–176
[23] Sakr S, Alves G, Morillon R L, Maurel K, Decourteix M, Guilliot
A, Fleurat-Lessard P, Julien J L, Chrispeels M J. Plasma mem-
brane aquaporins are involved in winter embolism recovery in
walnut tree. Plant Physiol, 2003, 133: 630–641