全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(8): 13401349 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由“十二五”农村领域国家科技计划项目(2011AA100501), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-3-2-47), 国家自然科学
基金项目 (31171538, 30900896), 中央高校基本科研业务费专项资金项目 (QN2009007)和西北农林科技大学唐仲英育种基金项目
(A212020912)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 高翔, E-mail: gx@nwsuaf.edu.cn, Tel: 13709124775; 赵万春, E-mail: zhaowc2009@hotmail.com, Tel:
13110439969
第一作者联系方式: E-mail: wenzhifan2011@126.com, Tel: 15829719716
Received(收稿日期): 2014-01-10; Accepted(接受日期): 2014-06-04; Published online(网络出版日期): 2014-06-13.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140613.1004.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01340
一年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定
杨 帆 1 陈其皎 1,2 高 翔 1,2,* 赵万春 1,2,* 强琴琴 1 吴 丹 1 孟 敏 1
1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2陕西省小麦新品种培育工程研究中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: 醇溶蛋白是面筋的主要成分之一, 对小麦品质具有重要影响。根据数据库中全长 α-醇溶蛋白基因设计了 1
对通用引物, 从 5 份一年生簇毛麦(Dasypyrum villosum)品系中共得到 52 条序列, 长度在 816~873 bp 之间(GenBank
登录号为 KJ004676~KJ004727)。核酸序列分析表明, 其中有 8 条假基因, 有 1 条(KJ004680)缺失终止密码子。推导
氨基酸序列显示, KJ004677、KJ004686、KJ004714和 KJ004696含有 1个额外的 Cys, 其中, 前 3条序列由于 Tyr→Cys
所致, 而 KJ004696 则由于 Ser→Cys 突变。序列间的差异主要出现在 N-端重复区和多聚谷氨酰胺 I 区, 根据 N 端重
复区多肽序列的差异将一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白分为 5种类型。为了分析具有额外 Cys的 α-醇溶蛋白所具有的品质
效应, 选取 KJ004708 (具有典型的 6个 Cys)和 KJ004714 (具有 1个额外的 Cys)分别构建表达载体, IPTG诱导后均得
到分子量约 30 kD的蛋白, 与理论值相符; 目的条带经切胶串联质谱鉴定证明, 这 2个 α-醇溶蛋白基因在大肠杆菌中
正确表达。对表达的蛋白亚基进行纯化、复性和低温冷冻干燥, 经 4 g粉质仪分析表明, KJ004708和 KJ004714均能
改善面团的加工品质, 其中具有 1个额外 Cys的 KJ004714亚基对面粉品质的改善更为显著。
关键词: 一年生簇毛麦; α-醇溶蛋白; 原核表达; 品质分析; 蛋白质串联质谱鉴定
Cloning, Prokaryotic Expression and in vitro Functional Analysis of α-Gliadin
Genes from Dasypyrum villosum
YANG Fan1, CHEN Qi-Jiao1,2, GAO Xiang1,2,*, ZHAO Wan-Chun1,2,*, JIANG Qin-Qin1, WU Dan1, and
MENG Min1
1 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 New Varieties Cultivation of Wheat Engineering Research Centre of
Shaanxi Province, Yangling 712100, China
Abstract: Gliadin, which has a great effect on wheat quality, is one of main components in gluten. According to the full lengths of
α-gliadin genes deposited in NCBI database, a conserved primer pair was designed to clone α-gliadin genes in five Dasypyrum
villosum lines. A total 52 sequences (816 to 873 bp in length) were isolated (GenBank accession numbers: KJ004676 to KJ004727)
including eight pseudogenes and another sequence KJ004680 without stop codon. Deduced amino acid sequence anaylsis showed
that KJ004677, KJ004686, and KJ004714 contain an extra Cys from the Tyr → Cys mutation, whereas, the extra Cys in KJ004696
resulted from the Ser → Cys mutation. Amino acid variation mainly occurred in N-terminal repetitive region and polyglutamine
domain I. Variation in N-terminal repetitive region formed five groups in the 43 α-gliadins. To study the effects of an extra Cys on
dough quality, we constructed the prokaryotic expression vectors for KJ004708 (with the typical six Cys residues) and KJ004714
(with an extra Cys) and obtained proteins of ~30 kD from Escherichia coli BL21(DE3) under the induction of isopro-
pyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) with the predicted molecular weight. These expressed proteins were verified by matrix-assisted
laser desorption-ionization time-of-flight MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry analysis. The result showed that these
α-gliadins were expressed correctly in E. coli. After purification, renaturation, and freeze-drying process, the functions of the ex-
pressed proteins were tested with 4 g Farinograph. Both KJ004708 and KJ004714 had positive effects on flour quality, especially
KJ004714 with an extra Cys.
第 8期 杨 帆等: 一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定 1341


Keywords: Dasypyrum villosum; Alfa-gliadin; Prokaryotic expression; Functional analysis; MALDI-TOF/TOF tandem
mass spectrometer
小麦是我国主要粮食作物之一, 品质改良是小
麦的重要育种目标。但是在普通小麦中发现的能够
编码优质蛋白的基因并不多, 并且由于现代农业导
致小麦品种越来越单一化, 使得种内遗传变异逐渐
丧失, 造成新选育的小麦品种遗传基础越来越狭窄,
限制了小麦品质的进一步改良。因此, 通过在小麦
近缘种属中寻找新的优质基因资源来拓宽小麦的遗
传基础成为小麦品质育种的一条有效途径。
一年生二倍体簇毛麦 [Dasypyrum villosum,
2n=14, VV (syn. Haynaldia villosa)], 原产于地中海
东北部和高加索地区, 是小麦遗传改良的重要种质
资源[1-3]。一年生簇毛麦具有许多重要的小麦病害抗性
基因资源, 如抗黑穗病(Ustilago nuda和 U. triticii) [4]、
白粉病(Erysiphe graminis) [5-6]、纹枯病(Pseudocerc-
osporella herpotricoides) [7]、锈病(Puccinia graminis
和 P. recondite) [8]和根腐病(Rhizoctonia solani)[9]等多
种病害, 同时也具有耐盐[10]等抗逆特点。一年生簇
毛麦的籽粒蛋白含量高, 在 1V、6VS 和 7V 染色体
上 , 已经发现含有编码种子储藏蛋白的基因位点
Glu-V1 [11]、Glu-V3 [12]、Gli-V2 [13]和 Wsp-1 [14]。此
外, 一年生簇毛麦中还携带矮秆[15]、产量[16-17]和面
筋强度[18]的相关基因。
小麦胚乳储藏蛋白是决定小麦品质, 尤其是小
麦加工品质的主要因素。它主要由麦谷蛋白
(glutenins)和麦醇溶蛋白(gliadins)组成, 为面筋的主
要成分, 是决定面团黏弹性的主要因素[19]。麦醇溶
蛋白约占小麦胚乳贮藏蛋白总量的 50%~60% [20-21],
其中 α-醇溶蛋白占总醇溶蛋白的 25% [22]。它包含信
号肽(signal peptide)、N-端重复区(N-terminal repeti-
tive region)、多聚谷氨酰胺 I区(polyglutamine repeats
I)和 N-端非重复区(unique non-repetitive domain I),
最后是多聚谷氨酰胺 II 区(polyglutamine repeats II)
和 C-端非重复区(unique non-repetitive domain II) [23]。
目前, 已经从小麦及其近源物种中分离了许多 α-醇
溶蛋白基因, 但国内外尚未报道关于一年生簇毛麦
中 α-醇溶蛋白基因对小麦品质贡献的研究。本研究
利用简并引物分离一年生簇毛麦中的 α-醇溶蛋白
基因, 对克隆得到的部分 α-醇溶蛋白基因进行原核
表达、亲和层析及体外功能鉴定, 为研究一年生簇
毛麦中 α-醇溶蛋白亚基对小麦品质改良的作用提
供基础。
1 材料与方法
1.1 簇毛麦 α-醇溶蛋白基因的克隆
用 微 量 CTAB 法 [24] 提 取 一 年 生 簇 毛 麦
TA10220、TA10224、TA10227、TA10232和 TA10249
(由美国堪萨斯州大学小麦遗传与基因组资源中心
Bikram S. Gill博士实验室提供)的基因组 DNA。利
用 Primer Premier 5, 根据 GenBank (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/)中已注册的 α-醇溶蛋白基因序列的保
守区域设计扩增基因全长编码区的引物 (al-GliF:
5′-ATG AAG ACC TTC CTC ATC TTT GTC-3′;
al-GliR: 5′-CCA TGT TTG AAC TAG TAT AGG TCG
G-3′)。PCR体系为 5 × PrimeSTAR buffer (Mg2+ plus)
5 µL, 2.5 mmol L–1 dNTP Mixture 2 µL, 0.1 mmol L–1
上下游引物各 1 µL, 模板 DNA 100 ng, 2.5 U µL–1
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa) 0.2 µL,
加 ddH2O 至反应体积为 25 µL。PCR 程序为 94 ℃
5 min; 94 45 s℃ 、50 50 s℃ 、72 90 s℃ , 30个循环;
72 8 min℃ 。PCR扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳
检测后, 切胶回收目的片段。用 pEASY-T1载体连接
目的片段并转化大肠杆菌 Trans1-T1 (北京全式金生
物技术有限公司), 在选择性培养基上过夜培养, 画
线后从每个克隆挑选 3 个独立阳性菌落送至南京金
斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2 生物信息学分析
用 DNAMAN (6.0)推导分析 α-醇溶蛋白的序列;
采用NCBI在线 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)
进行序列的同源性比对; SignalP 4.1 Server在线完成
氨基酸序列信号肽分析; 蛋白质二级结构的预测采
用 PSIPRED server (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/);
以 MEGA 5.0构建系统演化树; 参照 van Herpen等[25]
和李光蓉等[26]报道的方法分析识别 α-醇溶蛋白序列
的毒性多肽位点。
1.3 簇毛麦 α-醇溶蛋白原核表达和品质鉴定
设计 1对表达引物 Ex.al-gliF (5′-GTA CTT AGA
GTT CCA GTG CCG C-3′)/Ex.al-gliR (5′-TTA GTT
ACT ACC GGT GCT ACC AAA T-3′), 分别对含有 2
条代表性序列的阳性质粒进行 PCR 扩增(KJ004708
和 KJ004714), 回收目的片段并分别连接至表达载
体 pEASY-E1, 转化表达菌株 BL21 (DE3)(北京全式
金生物技术有限公司), 挑取阳性菌落接种至 LB 中
(氨苄青霉素, 100 mg mL–1), 37℃过夜培养后按照体
1342 作 物 学 报 第 40卷

积比 1∶100将培养物接种到新鲜 LB中培养至 A600 =
0.5~0.8, 取 1 mL过夜培养的菌液作为阴性对照, 向
剩余的菌液中加入诱导剂 IPTG (终浓度 1 mmol L–1)
诱导 6 h (37℃, 200转 min–1)。9300  g离心 10 min
收集菌体, 加入 1 × SDS凝胶加样缓冲液重悬, 煮沸
7 min, 以 12% SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达, 并
用消毒手术刀在 PAGE 胶上切下与预测分子量相符
的正确表达的蛋白 , 采用 MALDI-TOF/TOF 4800
(Applied Biosystem)质谱仪进行串联质谱鉴定(中国
科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中
心), 采用一级肽指纹质量与二级肽碎片质量综合分
析法 Combined (MS+MS/MS)分析样品序列 , 通过
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)序列同源性比对
确定蛋白质的性质。
离心收集诱导后的菌体(4℃, 6800  g, 10 min),
加入破碎缓冲液(50 mmol L–1 Tris-HCl, 100 mmol
L–1 NaCl, 2 mmol L–1 EDTA, 1 mg L–1溶菌酶, pH 8.5)
在冰上放置 45 min, 超声破碎细胞并离心收集沉淀
(4℃, 15 000  g, 10 min)。沉淀经 6 mol L–1盐酸胍的
磷酸盐缓冲液预处理后 , 采用 ProteinIso Ni-NTA
Resin (北京全式金生物技术有限公司)纯化和收集目
的蛋白。将收集的蛋白透析 72 h, 低温冷冻干燥 48 h
后在–20℃冰箱中保存备用。
采用 4 g 微量粉质仪测定一年生簇毛麦 α-醇溶
蛋白亚基的品质效应。在 4 g基础面粉中加入 50 mg
纯化蛋白和适量水, 混合 4 min后加入 0.25 mL DTT
溶液(50 mg L–1)反应 1 min, 再加入 0.25 mL KIO3溶
液(200 mg L–1)反应 10 min, 记录粉质曲线和相应品
质参数。
2 结果与分析
2.1 α-醇溶蛋白基因的克隆及相似性比对
通过分析已公布的 α-醇溶蛋白基因, 利用序列
的保守区设计 1对简并引物 , 以一年生簇毛麦基因
组 DNA为模板扩增得到 52条序列(GenBank登录号
为 KJ004676~KJ004727)。NCBI 在线 BLAST 表明,
得到的序列与已公布的多年生簇毛麦 α-醇溶蛋白基
因序列相似度较高, 最高可达 94%。克隆得到的序
列全长介于 816~873 bp之间(图 1), 最常见的基因片
段长度为 858 bp, 共出现 19次。
DNAMAN 开放阅读框分析表明 , 8条序列
(KJ004720~KJ004727)含有提前终止密码子, 属于假
基因。其中 KJ004725在642 bp处(特征区 II)缺失碱
基 C 导致阅读框移码, 其他假基因均因碱基替换所
致。碱基替换在 N 端重复区出现的频率最高(3/7)。
在7个碱基替换的类型中 , 有6个均因密码子的第1
位碱基 C 被 T 替换, 分别导致 CAA→TAA (3/6)和
CAG→TAG (3/6), 而 KJ004726是因密码子的后两
位碱基同时被碱基 A 替换导致 TGG→TAA。
KJ004680则因3′端倒数第8个密码子的第3位缺失碱
基 T而移码突变, 使得终止密码子缺失。
SNP分析表明, 碱基转换占 73%, A/G和 T/C类
型分别占 39%和 34%; 碱基颠换只占 27%, 并以A/T
颠换为主(58%), 其他几种碱基颠换的比例较低。

图 1 1.5%琼脂糖凝胶扩增 α-醇溶蛋白基因序列
Fig. 1 Amplification products of α-gliadin gene sequences
separated on 1.5% agarose gel
M: Trans 2K Plus DNA marker; 1: TA10220; 2: TA10224;
3: TA10227; 4: TA10232; 5: TA10249.

2.2 氨基酸序列分析
分析推导的氨基酸序列, 得到 43条完整的 α-醇
溶蛋白序列, 编码 271~290 氨基酸残基, 均具有典
型的 α-醇溶蛋白结构, 分别是由 19个氨基酸残基组
成的信号肽, N-端重复区, 多聚谷氨酰胺 I区, 特征
区 I, 多聚谷氨酰胺 II 区和特征区 II。根据 N-端重
复区多肽序列的差异, 将这 43 条 α-醇溶蛋白分为 5
种类型(图 2-A)。序列比对分析发现, 氨基酸变异位
点大部分存在于 N-端、特征区 I 和特征区 II, 导致
Gln 和 Arg、Leu 和 Pro, 以及 Gln 和 Leu 之间的相
互转换。N-端重复区和多聚谷氨酰胺Ⅰ区多肽长度
的变异主要是由于第 V类亚基中的 4个 α-醇溶蛋白
(KJ004681、KJ004693、KJ004709和 KJ004711)缺失
了富含 Gln 的片段。本试验获得的一年生簇毛麦 α-
醇溶蛋白多聚谷氨酰胺 I 区的长度介于 11~23 个氨
基酸残基之间, 其中 Gln 的平均含量为 18.1 个。有
33条序列发生了 Q→E突变, 其中 KJ004682还发生
了 Q→R突变。多聚谷氨酰胺 II区序列都非常短, 只
第 8期 杨 帆等: 一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定 1343


含有 5个氨基酸残基(QQLQQ)且非常保守(图 2-B),
只有KJ004717在这个区域的第 1位氨基酸残基由谷
氨酰胺 Q变异为亮氨酸(LQLQQ)。
通过比较不同物种间多聚谷氨酰胺 I和 II区中谷
氨酰胺残基数量的变异, 发现不同物种间多聚谷氨
酰胺区中 Gln的数量变异比较大。除拟斯卑尔脱山羊
草和稃旱麦草外, 其他 6个物种多聚谷氨酰胺 I区中
Gln的数量要多于多聚谷氨酰胺 II区。与其他物种相
比, 本研究从一年生簇毛麦中获得的 α-醇溶蛋白在
多聚谷氨酰胺 II区中 Gln数量的变异较小(图 2-C)。
α-醇溶蛋白中 Cys 的位置和数目都非常保守,
分别在特征区 I 和特征区 II 中含有 4 个和 2 个 Cys
(图 2-B)。在所得到的序列中, KJ004677、KJ004686、
KJ004696和 KJ004714含有 7个 Cys。除 KJ004696

图 2 α-醇溶蛋白基因推导氨基酸序列分析
Fig. 2 Deduced amino acid sequence analysis of α-gliadin genes
A: 43条推导氨基酸序列的毒性多肽位点和分类, 粗线框示毒性多肽位点, 虚线框示不同类型的 α-醇溶蛋白。
B: α-醇溶蛋白的结构及二硫键模式, N端重复区(N-terminal)存在毒性多肽位点, 多聚谷氨酰胺 II区(Q II)存在 QQLQQ多肽序列,
星号(*)示半胱氨酸残基的位置。C: 不同物种 α-醇溶蛋白在多聚谷氨酰胺 I区和 II区中谷氨酰胺残基数量的变异, 误差线表示标准差。
1: 一年生簇毛麦, n = 43; 2: 普通小麦, n =26; 3: 粗山羊草, n = 16; 4: 一粒小麦, n = 15; 5: 二粒小麦, n = 17 ; 6: 黑麦, n = 17;
7: 拟斯卑尔脱山羊草, n = 7; 8: 稃旱麦草, n = 7。
A: T-cell stimulatory epitopes and classification of 43 α-gliadin amino acid sequences, thick frames indicate T-cell stimulatory epitopes,
dot line frames indicate different types of α-gliadins. B: Schematic structure of α-gliadin and intra-molecular disulfide bonds, T-cell stimula-
tory epitopes existed in the N-terminal, QQLQQ existed in the Q II, * indicates the positions of cysteine residue. C: Variations in
mean number of glutamine residues in the polyglutamine domains (Q I and Q II) of α-gliadins among different species. Error bars show the
standard deviations, 1: Dasypyrum villosum, n = 43; 2: Triticum aestivum, n = 26; 3: Aegilops tauschii, n = 16; 4: Triticum monococcum,
n = 15; 5: Triticum dicoccoides, n = 17; 6: Secale cereale, n = 17; 7: Aegilops speltoides, n = 7; 8: Eremopyrum bonaepartis, n = 7.
1344 作 物 学 报 第 40卷

的额外 Cys是由 Ser变异而来, 其他 3个序列的额外
Cys均由 Tyr变异而来(Tyr→Cys)。进一步分析额外
Cys出现的位置, 发现其出现在 KJ004686的 N-端重
复区、KJ004696的特征区 I、KJ004677和 KJ004714
的特征区 II。
2.3 α-醇溶蛋白中毒性多肽位点的分析
α-醇溶蛋白中主要含有4个能诱发乳糜泻病的
多肽因子, 分别是 Gliα-α (QGSFQPSQQ)、Gliα-α2
(PQPQLPYPQ)、Gliα-α9 (PFPQPQLPY)和 Gliα-α20
(FRPPQQPYPQ) [25-26], 人体 T细胞与这些特定多肽
结合后会引起小肠黏膜损伤和吸收不良[27]。不同的
诱发因子有特定的保守分布区域, Gliα-α 出现在特
征区 II, 而 Gliα-α2、Gliα-α9 和 Gliα-α20 均分布在
N-端重复区, 且 Gliα-α2和 Gliα-α9多肽序列有部分
重叠(图 2-A)。将 43 条一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白多
肽序列与这 4个毒性多肽位点对比分析表明 , 所有
序列中都不含有完整的 Gliα-α2、Gliα-α9和 Gliα-α20
毒性多肽位点序列, 并缺失 Gliα-α位点(表 1)。
比较发现, 不同物种的 α-醇溶蛋白毒性多肽位
点分布差异非常大(表 2)。其中冰草属和本研究中的
5份一年生簇毛麦品系均不含 4个毒性多肽位点, 旱
麦草属只含有 Gliα-α 位点, 黑麦属缺失 Gliα-α20 位
点, 而偃麦草属、山羊草属和小麦属则含有全部 4
个毒性多肽位点(表 2)。

表 1 不同研究获得的一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白毒性多肽位的比较
Table 1 Comparison of T cell stimulatory epitopes of α-gliadins in Dasypyrum villosum obtained from different studies
毒性多肽位
T-cell stimulatory epitopes
毒性多肽位序列
Sequences for T-cell stimulatory epitopes
KJ004676 to KJ004719
(except KJ004680)
EU325688 to EU325697 [28]
Gliα-α QGSFQPSQQ — QGSFQPSQQ
Gliα-α2 PQPQLPYPQ PQPQPFPPQ LPQLTYPQ
Gliα-α9 PFPQPQLPY PFPQPQPFP PFLPQLTY
Gliα-α20 FRPPQQPYPQ FPPQQPYPR —
粗斜体表示保守氨基酸残基, —表示缺少相应的毒性多肽位点。
Bold italic and dash indicate the conserved amino acids and the lack of T cell stimulatory epitopes, respectively.

表 2 不同物种 α-醇溶蛋白中毒性多肽位点数量的比较
Table 2 Comparison of the quantity of T cell stimulatory epitopes in α-gliadins among different species
物种
Species
α-醇溶蛋白数
No. of α-gliadins Gliα-α Gliα-α2 Gliα-α9 Gliα-α20
一年生簇毛麦 Dasypyrum villosum 43 0 0 0 0
冰草属 Agropyron 15 0 0 0 0
旱麦草属 Eremopyrum 8 0.875 0 0 0
黑麦属 Secale 26 0.615 0.615 0.615 0
偃麦草属 Thinopyrum 120 0.419 0.015 0.015 0.015
山羊草属 Aegilops 130 0.759 0.616 0.536 0.812
小麦属 Triticum 350 0.420 0.363 0.534 0.537
冰草属、偃麦草属、山羊草属和小麦属数据来自 Chen et al. [29]; 旱麦草属和黑麦属来自 NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
Data of Agropyron, Thinopyrum, Aegilops, and Triticum genus originated from Chen et al. [29]; data of Eremopyrum and Secale genus
were collected from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

2.4 蛋白质二级结构预测和分析
一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白的二级结构主要由
α-helix和 coil组成。α-helix出现的位置和数目比较
保守, 在特征区 II中除 KJ004696含有 2个 α-helixes
外, 其他均只含 1 个 α-helix, 且在 N-端重复区不含
α-helix。成熟的一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白中 α-helix
通常出现 5次, 但是 KJ004677、KJ004679、KJ004682、
KJ004685、 KJ004694、 KJ004696、 KJ004700、
KJ004704、KJ004713、KJ004715 和 KJ004716 中有
6个 α-helixes, 另外 KJ004683和 KJ004702中只含 4
个 α-helixes。在这 43条 α-醇溶蛋白中, 除KJ004685、
KJ004691、KJ004697、KJ004707 和 KJ004713 在特
征区 II出现一次 β-strand (分别占序列的 1.1%、0.8%、
1.1%、0.7%和 0.8%)外, 其他序列均不含 β-strand。
2.5 系统进化树分析
将获得的43条一年生簇毛麦α-醇溶蛋白序列
第 8期 杨 帆等: 一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定 1345


与NCBI中已注册的小麦以及其他近缘种的α-醇溶
蛋白氨基酸序列构建系统进化树, 发现本实验中得
到的所有一年生簇毛麦α-醇溶蛋白被单独聚为一
类, 与小麦及小麦其他近源物种的α-醇溶蛋白亲缘
关系较远 , 同时与Li等 [28]得到的一年生簇毛麦亲
缘关系也较远 , 推测本研究从这5份一年生簇毛麦
品系中获得的α-醇溶蛋白为醇溶蛋白家族新成员
(图3)。

图 3 α-醇溶蛋白序列的系统演化树分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of the α-gliadins
KJ004676~KJ004719 (不含 KJ004680)来自本研究。■: 一年生簇
毛麦; ◇: 多年生簇毛麦; #: 拟斯卑尔脱山羊草; ☆: 粗山羊草;
★: 华山新麦草;
▲: 黑麦; ▽: 普通小麦; *: 一粒小麦; : 二粒小麦。
KJ004676 to KJ004719 (except KJ004680) were from this study.
■: Dasypyrum villosum; ◇: Dasypyrum breviaristatum;
#: Aegilops speltoides; ☆: Aegilops tauschii; ★: Psathyrostachys
huashanica; ▲: Secale cereal; ▽: Triticum aestivum;
*: Triticum monococcum; : Triticum dicoccoides.

2.6 原核表达和蛋白纯化
选取两条具有代表性的一年生簇毛麦 α-醇溶蛋
白序列, 对其进行体外功能鉴定, 其中 KJ004708 含
有 α-醇溶蛋白典型的 6 个半胱氨酸残基, KJ004714
在特征区 II 含有一个额外的半胱氨酸残基。含有重
组表达质粒的菌株在 37℃经过 1 mmol L–1 IPTG诱
导 6 h后, SDS-PAGE电泳检测结果表明在约 30 kD
处出现目的条带 , 与预测的分子量大小相符 (图
4-A)。将表达条带进行切胶和串联质谱测序后(表 3),
对质谱鉴定的 α-醇溶蛋白肽段序列进行比对表明原
核表达产物的氨基酸序列与推导的氨基酸序列完全
一致, 且与 NCBI 数据库来源的 α-醇溶蛋白相似度
高于 60%, 但不同来源的 α-醇溶蛋白在多肽片段
DVLLQQHNI/VAPIR中的序列差异很大(表 3)。表达
产物纯化后经 SDS-PAGE 电泳分析表明在约 30 kD
处同样出现明显目的条带, 证明原核表达产物纯化
成功(图 4-B)。

图 4 蛋白表达和纯化的 SDS-PAGE分析
Fig. 4 SDS-PAGE analysis of protein expression and protein
purification
A: 诱导表达产物的 SDS-PAGE分析; B: 纯化产物的 SDS-PAGE
分析。M: Blue Plus protein marker; 1: 未诱导的表达菌株(DE3);
2: 未诱导空载体; 3: 诱导空载体; 4和 6: 未诱导的重组质粒;
5和 7: 诱导后的重组质粒。箭头示目的蛋白。
A: analysis of expressed proteins by SDS-PAGE; B: analysis
of purified proteins by SDS-PAGE. M: Blue Plus protein marker;
1: protein of BL21 (DE3) expression strain without induction;
2, protein of non-recombinant plasmid without induction;
3, protein of non-recombinant plasmid after induction; 4 and 6,
protein of recombinant plasmid without induction; 5 and 7,
protein of recombinant plasmid after induction. Target proteins
are indicated by arrows.

2.7 蛋白的体外功能鉴定
采用4 g 微量粉质仪通过氧化还原反应分别将
50 mg 纯化后的表达产物掺入到基础面粉中, 通过
测定面团的粉质曲线, 分析粉质参数的变化来揭示
一年生簇毛麦中不同类型的 α-醇溶蛋白亚基对小
麦品质的影响。分析表明, 添加 KJ004708亚基后面
团的形成时间、弱化度、公差指数和粉质质量指数
都有显著增加 , 而添加 KJ004714亚基后面团的7
个主要的粉质参数较对照均出现显著变化 (图5和
表4)。

图 5 纯化的 α-醇溶蛋白亚基对粉质曲线的影响
Fig. 5 Effects of purified α-gliadin subunits on the
Farinograph parameters
1346 作 物 学 报 第 40卷

表 3 原核表达的 α-醇溶蛋白串联质谱鉴定
Table 3 Identification of prokaryotically expressed α-gliadins using MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer
项目
Item
KJ004708匹配肽段
KJ004708 matched peptides (MPS)
KJ004714匹配肽段
KJ004714 matched peptides (MPS)
MPS-1 MPS-2 MPS-3 MPS-4 MPS-5 MPS-6
理论分子量 Theoretical MW (Da) 858.4792 1516.8595 2751.2615 858.4792 1502.8439 2737.2458
观测分子量 Observed MW (Da) 858.4792 1516.785 2751.0918 858.4754 1502.7788 2737.1099
误差 Difference (Da) 0 –0.0745 –0.1697 –0.0038 –0.0651 –0.1359
蛋白质得分 Protein score 198 229
蛋白得分置性度 C.I. % 100 100
等电点 Isoelectric point 8.28 8.23
与其他 α-醇溶蛋白序列相似度 Similarity to other α-gliadins (%)
推导氨基酸序列 Deduced sequence 100 100 100 100 100 100
原核表达产物 Prokaryotic expression 100 100 100 100 100 100
Australopyrum retrofractum (ABW79851) 86 62 95 86 69 100
Dasypyrum hordeaceum (ACY71755) 71 100 95 71 92 100
Dasypyrum villosum (ABY48872) 71 69 86 71 62 90
匹配肽段序列分别为 SQVLQQR (MPS-1和MPS-4); DVLLQQHNIAPIR (MPS-2)和DVLLQQHNVAPIR (MPS-5); TYQELQQQCCQQ
LWQI PEQSR (MPS-3)和 SYQELQQQCCQQLWQIPEQSR (MPS-6)。下画线表示相同多肽片段的不相同氨基酸位点。
Matched peptide sequences are SQVLQQR (MPS-1 and MPS-4); DVLLQQHNIAPIR (MPS-2) and DVLLQQHNVAPIR (MPS-5); and
TYQELQQQCCQQLWQIPEQSR (MPS-3) and SYQELQQQCCQQLWQIPEQSR (MPS-6). Amino acid site variations are underlined.

表 4 添加 KJ004708和 KJ004714对小麦面团粉质特性的影响
Table 4 Effects of KJ004708 and KJ004714 on Farinograph parameters
添加物
Additive
断裂时间
BdT (min)
形成时间
DvT (min)
稳定时间
ST (min)
带宽
WC (FU)
弱化度
DS (FU)
公差指数
MTI (FU)
粉质质量指数
FQN (mm)
DTT, KIO3 (control) 2.1 b 1.4 b 1.0 b 50 b 159.9 b 155 b 17.5 b
DTT, KIO3, KJ004708 2.2 ab 1.6 a 1.1 b 50 b 169.9 a 170 a 20.2 a
DTT, KIO3, KJ004714 2.6 a 1.6 a 1.7 a 55 a 154.9 c 150 c 21.5 a
表中数据为 3次重复取平均值, 同列中不同字母表示差异显著(P < 0.05)。
Data are the means of three replicates. Values followed by different letters within columns are significantly different at P < 0.05. BdT:
breakdown time; DvT: development time; ST: stability time; WC: width of curve; DS: softening of dough; MTI: mixing tolerance index; FQN:
farinograph quality number.

3 讨论
一年生簇毛麦中不仅含有许多重要的抗逆位点,
而且还具有能增加籽粒蛋白含量和增强面筋强度等
优质性状, 是小麦品种改良的重要遗传资源。目前
已经培育了许多不同的小麦-簇毛麦代换系、易位系
等材料, 有效地拓宽了小麦的遗传资源并加快了小
麦育种进度。目前已经从不同的物种中分离得到了
许多 α-醇溶蛋白基因 , 但是假基因比例都比较高 ,
如 van Herpen等[25]从小麦不同的染色体祖先中获得
的230条 α-醇溶蛋白基因中假基因的比率就高达
87%, 其他的一些研究者获得的 α-醇溶蛋白基因也
存在比较高的假基因频率[30-32]。据推测, α-醇溶蛋白
基因家族中假基因出现的频率高达50% [33], 而本研
究从一年生簇毛麦中共获得了52条序列, 其中仅有
8条假基因(15.4%), 不仅远低于前人从不同物种中
得到的假基因频率, 也低于 Li等[28]从簇毛麦中得到
的假基因比例(31.3%), 推测获得的假基因频率与不
同来源的材料有密切关系。醇溶蛋白高比例假基因
的发生可能是染色体非均等交换和基因大量复制过
程中的突变所致[21,34]。突变产生的类型中, 碱基 C
被 T 替换是最常见的类型之一, 一般认为, 由于醇
溶蛋白中含有大量 Gln, 而编码 Gln 的密码子 CAA
和 CAG中的第1位 C一旦被 T替换就会产生翻译的
终止, 产生假基因[33], 本试验中的6个假基因(75%)属
于此类。van Herpen等[25]曾报道此类假基因产生比
第 8期 杨 帆等: 一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定 1347


例为77.2%, 而张晓霞等 [31]研究发现假基因中有
95%是 C-T 突变类型。本研究中 C-T 突变频率占总
突变频率的34%, 仅次于 A-G 突变(39%), 而最终假
基因频率仅有15.4%, 并且主要由于 C-T 突变造成,
说明这5份一年生簇毛麦品系中较低的假基因频率
并不是由于 C-T 突变频率较低引起的。本研究中还
发现一个密码子的后两位碱基被同时替换(TGG→
TAA)而产生终止密码子的例子。
α-醇溶蛋白序列结构具很高保守性, 典型特征
是含 5个不同的区域(图 2-B)。根据 N端重复区多肽
序列的不同, 将本试验获得的 α-醇溶蛋白分为 5 种
类型(图 2-A)。研究一般认为多聚谷氨酰胺 II区是 α-
醇溶蛋白氨基酸序列变异比较大的一个区域[26,31,35],
而本研究得到的序列在此区域不仅非常保守而且仅
含 4个 Gln (图 2-B), Li等[28]从一年生和多年生簇毛
麦中获得的 α-醇溶蛋白在此区域分别平均含 14.3个
和 18.6 个 Gln, 而李光蓉等[26]从多年生簇毛麦中得
到的 α-醇溶蛋白在多聚谷氨酰胺 II 区也平均含 9.1
个 Gln。贮藏蛋白亚基中 Cys 的含量和位置会对亚
基的品质效应产生较大影响。α-醇溶蛋白中 Cys 的
数目和相对位置非常保守, 一般含 6个 Cys。其中有
4个位于特征区 I, 另外 2个位于特征区 II, 并且第 1
和第 2位, 第 3和第 5位, 第 4和第 6位的 Cys可以
形成 3 对分子内二硫键[36]。本研究共得到 4 个含额
外 Cys 的序列, 额外的 Cys 可能参与分子间二硫键
的形成, 对稳定蛋白空间网络结构和改善面筋品质
具有积极作用。在这 4条序列中只有 KJ004696是由
于 Ser突变为 Cys, 其余 3条均由于 Tyr突变为 Cys,
其中 KJ004686在 N-端重复区倒数第 9位密码子后 2
位碱基同时发生转换突变(TAC→TGT), 导致 Tyr→
Cys 突变。其他的一些研究也发现在 α-醇溶蛋白中
存在一个额外的 Cys, 但这些额外的 Cys 多出现在
特征区 II并且是由丝氨酸(Ser)变异产生的[22,34,37-38]。
Li 等[28]从一年生簇毛麦中分离了一个在特征区 I 含
一个额外 Cys 的 α-醇溶蛋白, 但这个 Cys 仍由 Ser
变异而来。
聚类分析发现, 本研究得到的一年生簇毛麦 α-
醇溶蛋白被单独聚为一类, 同其他物种的亲缘关系
较远。Li等[28]通过分离一年生和多年生簇毛麦中的
α-醇溶蛋白并构建系统进化树, 发现簇毛麦属和小
麦属间的亲缘关系较远, 同时一年生和多年生簇毛
麦 α-醇溶蛋白也分别被单独聚为一类, 与本研究得
出的结果相似, 推测簇毛麦中 α-醇溶蛋白是一个新
的 α-醇溶蛋白家族。同时本研究中获得的 α-醇溶蛋
白与其他一年生簇毛麦来源的 α-醇溶蛋白[28]亲缘关
系也较远, 说明不同来源的一年生簇毛麦中 α-醇溶
蛋白变异非常丰富。α-醇溶蛋白中对乳糜泻病人具
有毒性的多肽主要有 4种, 分别是 Glia-α、Glia-α2、
Glia-α9 和 Glia-α20。序列比较结果表明, 本研究获
得的一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白均不含 Glia-α毒性多
肽位点, 且由于氨基酸残基的变异导致不含有完整
的另外 3个毒性多肽位点。Li等[28]从一年生簇毛麦
中得到的 α-醇溶蛋白含有完整的 Glia-α 位点, 但是
缺失 Glia-α20 毒性位点序列, 另外也不含有完整的
Glia-α2和 Glia-α9位点(表 1)。说明不同来源的一年
生簇毛麦中 α-醇溶蛋白毒性多肽位点序列变异很大,
与聚类分析的结果相符, 这有助于选育不含有毒性
多肽位点的新品种。
微量掺粉试验结果表明, 一年生簇毛麦中两种
不同类型的 α-醇溶蛋白亚基对小麦面团品质都能产
生显著影响。面团的稳定时间、形成时间和断裂时
间越长, 带宽值愈大, 同时弱化度和公差指数值越
小, 说明面团的面筋强度和弹性越好, 而粉质质量
指数则是用于综合评价面粉筋力和耐揉性一个重要
依据[34,39-40]。粉质结果显示, 虽然 KJ004708显著增
加了弱化度和公差指数 , 降低了面团的面筋强度 ,
但是对面团的形成时间和最终的粉质质量指数有显
著的提升作用(表4)。含有一个额外 Cys的 KJ004714
亚基显著作用于所有的7个主要粉质参数 , 添加
KJ004714能够显著增加面团的稳定时间、形成时间、
断裂时间、带宽和粉质质量指数, 同时又显著降低
面团的弱化度和公差指数, 对面团面筋的强度和弹
性都有显著改善(表4)。推测 KJ004714中含有的额外
Cys 参与分子间二硫键的形成, 促进蛋白质亚基间
的聚合 , 从而显著地改善面团的结构 , 推测
KJ004714对小麦面粉品质的改良具有很大潜力。李
敏等[34]对来源于普通小麦的一个含7个 Cys 的 α-醇
溶蛋白品质鉴定表明, 加入外源蛋白亚基后面团的
断裂时间、稳定时间和粉质质量指数值显著降低 ,
而弱化度和公差指数值却显著升高, 说明此亚基对
面团品质有不利影响。并且本研究和李敏等[34]得到
的 α-醇溶蛋白亚基中额外 Cys 均出现在特征区 II,
但最终对于品质的影响相差非常大, 说明额外 Cys
对小麦品质的影响可能非常复杂, 不仅与 Cys 的数
目和位置有关, α-醇溶蛋白本身的序列也可能影响
亚基的品质效应。
1348 作 物 学 报 第 40卷

4 结论
利用特异引物, 从 5 份一年生簇毛麦材料中分
离得到 52条序列, 其中 8条为假基因, 1条由于碱基
的缺失导致移码突变而缺失终止密码子。得到的 43
条完整 α-醇溶蛋白序列可被划分为 5种不同的类型,
序列间的差异主要存在于 N端重复区和多聚谷氨酰
胺 I 区。毒性多肽位点的比较、聚类分析和质谱鉴
定结果的序列比对分析发现不同来源的簇毛麦 α-醇
溶蛋白序列间差异较大, 这可能对小麦品质育种产
生有利的影响。本研究中获得的 α-醇溶蛋白既缺失
Gliα-α毒性多肽位点 , 也不含完整的其他 3个毒性
多肽位点。KJ004708 与 KJ004714 均能改善小麦面
团的品质, 说明这些一年生簇毛麦品系是小麦品质
育种的优良材料, 并且 KJ004714对品质的改善更为
显著, 其所含额外 Cys 有助于小麦面筋网络结构的
形成。
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