全 文 ：武汉植物学研究
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( ) ∗ +, − . )/ 0 ∗ 1− , 2 ) 3− , 45 − . 6 7 87 − +5 1
大叶紫花首蓓愈伤组织原生质体再生植株 ‘
刘 明
∀兰州大学生物系
土 9 去(、’
兰州 : % ; ; ; ; #
提 要 大叶紫花首藉下胚轴诱导的愈伤组织在继代培养基上生长快速 , 易于分散 9 继代第

& < 的愈伤组织原生质体的得率为 9 = >
; , ? ≅ 鲜重 。 原生质体培养基为 ΑΒ 基本培养基 , 含
有
9 ; Χ ≅ ? Δ Ε , ! 一Φ 、 ; 9 = Χ ≅ ? Δ 2 Γ 、 & 9 ;  ? Δ Η Β 、 & Ι蔗糖 、 写葡萄糖 、 = Χ Χ ) .? Δ ϑ Κ Α , 培养
密度为
9 ) > .) 8 ? Χ Δ 。 培养至第
& < 时的原生质体再生细胞植板率为 % 9 : Ι 。 由原生质体形
成的小愈伤组织在含 & 9 ; Χ ≅ ? Δ Ε , ! 一Φ 的 ϑ Α 固体培养基上大量增殖 。 增殖的愈伤组织转移
至 & 9 ; Χ ≅ ? Δ Ε 一4Λ Μ 。9
Χ ≅ ? Δ Ν Γ Γ 的 2。培养基上 , 形成体细胞胚并发育成完整植株 。
关键词 大叶紫花首楷 , 愈伤组织 , 原生质体培养
首蓓是非常重要的豆科牧草 。利用基因工程的手段和方法 , 向首楷及首蓓属植物导入
有用的外源 目的基因具有十分重要的意义 。 原生质体培养是基因工程的基础 。 目前有关
首楷原生质体的培养仅限于叶片“〕、子 叶〔, · %〕和根 〔‘〕分离的原生质体 。 因此有必要建立由
愈伤组织分离的原生质体的培养体系 。 然而 , 对于首蓓来说 , 用愈伤组织的原生质体进行
培养 , 有 以下 % 个不利因素 ∃
首糟是具有遗 传倾向的植物种 , 不同植物品种的体外再生
存在着遗传差异〔卜 的  首蓓是具有体细胞胚胎发生的植物种 , 而体细胞胚胎发生能力受
营养成分 〔, 一川 、激素 〔, ’〕、生理状态 〔, !〕 、物理 因子 ‘, ‘〕和基因型〔’· ∀ · ’# , 的影响  ∃ 外植体和 由外
植体形成的愈伤组织的原生质体 ,两者的体外植株再生能力也存在着差异 。由外植体诱导
形成的愈伤组织因培养条件不合适 , 可能引起再生能力的丧失或部分丧失 。 因此 , 建立由
首楷愈伤组织的原生质体再生植株具有特别重要的意义 。 本文报道了首蓓愈伤组织原生
质体再生植株的系统 。
% 材料和方法
%& % 游离原生质体的愈伤组织细胞系的建立
将大 叶紫花首信 ∋ () ∗+ ,− . 。 / 。 0+ 1− 2 2 3 & / −0 4’1 “ 5种子萌发的无 菌实生苗的下胚轴切
收稿 日 / % 6 6 # 一 7 8 一 %9 & 修 回 日 / % 6 , #一 % %一 9!。 第一作者 / 男 & # ! 岁 , 博士 &
国家教委博士点基金资助项 目 。
。 现通讯地址 / 广州暨南大学生物工 程系 , # % 7 8 !9 。
武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷
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9 ; Χ ≅ ? Δ Ο Π 、 & 9 ;  ? Δ Η Β ∀水解酪 蛋 白#的
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9 ; Χ ≅ ? Δ Ε , ! 一Φ 、 ;9 &= Χ ≅ ? Δ
Ο Π 的相 同培养基 上继代培 养愈伤组 织 。 然后 把愈伤 组织 转移 至
9 ; Χ ≅ ? Δ Ε , ! 一Φ 、
; 9 = Χ ≅ ? Δ 2 Γ 的相 同培养基上继代培养 , 每
= 一 &; < 继代
次 , 愈伤组织转变为淡黄绿
色 、易于分散和生长快速的稳定细胞系 。

9 & 原生质体的游离 、纯化和培养
取
 继代的愈伤组织置于混合酶液 中游离原生质体 。 酶液组成 为 & Ι Η7. .∗ .− 8 7
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光 , 以 ; + ? Χ 4, 振荡酶解 。 观察原生质体的游离与释放 , 确定酶解时间 。 酶解材料经过 =;
目、 &; ; 目 、 %; ; 目和 ! ; 目不锈钢网过滤 , 除去大块未经酶解的组织和细胞团 。 滤过液以
! ; ; + ? Χ 4, 离心 = Χ 4, , 收集原生质体 。 用 ; 9
Χ ) .? Δ Η − Ης∃ · ΕΒ ΕΘ ∀含 = Χ Χ ) .? Δ ϑ Κ Α ,
ΞΒ Α 9 # 洗涤原生质体 & 次 。 然后用原生质体培养基洗涤
次 , 重新悬浮于原生质体培养
基中 。 用血球计数器确定原生质体的得率 , 并调整原生质体至合适的密度 。 原生质体培养
基为 Α Β 液体培养基 , 含有
9 ; Χ ≅ ? Δ Ε , ! 一Φ 、 ; 9 = Χ ≅ ? Δ 2Γ 、 & 9 ;  ? Δ Η Β 、 & Ι蔗糖 、 Ι葡
萄糖 、 = Χ Χ ) .? Δ ϑ Κ Α 。 同时使用含相同添加物的 ϑΑ 〔, ’〕、 2 Α 〔, Ψ ,和 Ζ 一Ο ϑ 〔, ’〕液体培养基作
为原生质体培养基 。 取 & 9 = Χ Δ 悬浮的原生质体置于直径 5 Χ 的培养皿中 , 于 &= 士 & ℃ ,
黑暗或散射光条件下 ,液体浅层静置培养 。观察原生质体的生长状况 , 并于第
& < 和第 %=
< 时各添加
次原生质体稀释培养基 ∀不含葡萄糖的原生质体培养基 # 。 第
& < 统计植板
率 。
,
9 % 植株再生
当细胞 团长至
一 Ε Χ Χ 大小时 , 转至含 & 9 ) Χ ≅ ? Δ Ε , ! 一Φ 的 ϑ Α 固体培养基上增殖
培养 。 然后将增殖的愈伤组织转移至下列分化培养基上进行分化培养 。 分化培养基为 ∃

( : 基本培养基 , 含 7 & # ; . < = > ? 、 7 & % ; . < = ≅ ? ?  > : 基本培养基 , 含 9 & 7 ; . < = > ? 、
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含 %& 7 ; . < = >? 、 7& % ; . < = Δ >? 。
9 结果与分析
9& % 原生质体的游离与培养
用混合酶解液对愈伤组织的大量酶解实验表明 / 原生质体的得率与愈伤组织的生理
状态 ∋继代培养的天数 5密切相关 。实验中观察到原生质体的植板率与原生质体的得率 、培
养密度和培养基的种类有明显关系 , 结果见表 %。
在不合适的密度和培养基上培养的原生质体虽然能形成小细胞团 , 但不能继续生长
和分裂 。在不合适的生理状态下分离的原生质体即便在最合适培养条件下 , 仍难于生长和
分裂 , 细胞的生长和分裂停滞于某一阶段 。
新分离的原生质体 , 大部分含有较大的液泡 ∋图版 Δ / %5 。 在最适宜的条件下 , 第 ! ∗
即开始分裂 ∋图版 Δ / 95 。 第 Ε Φ 2 ∗ 时未见到分裂细胞 , 但观察到分裂的小细胞团 ∋图版
第 ! 期 刘明志 ∃ 大叶紫花曹蓓愈伤组织原生质体再生植株
表
原生质体得率 、培养密度和培养基对植板率的影响∀植板率 ∃ Ι #
Π − [ .7
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, 密度和培养基在最高原 生质体得率 ∀
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ς ∃ % # 。 第
& < 时 , 出现肉眼可见的小细胞团 。 此时统计植板率为 % 9 : 写 。
此外 , 即使在最佳条件下 , 当激素配比改为 &9 ) Χ ≅ ? Δ Ε , ! 一Φ 、 ;9 8 Χ ≅ ? Δ 2Γ 时 , 原生
质体再生细胞仍不能持续生长和分裂 。实验中观察到 , 经继代半年的愈伤组织细胞系仍能
得到较好的重复结果 。
& 9 & 植株再生
原生质体培养至第 %= < 时 , 添加
次原生质体稀释培养基 , 以利细胞团的持续生长
和 分裂 ∀图版 ς ∃ !# 。 & 个 月后 , 当小愈伤组织长至
∋ Ε Χ Χ 大小时 , 转 到含 & 9 ) Χ ≅ ? Δ
& , ! 一Φ 的 ϑ Α 固体培养基上进行增殖培养 。 愈伤组织的增殖率为
; Ι 。 经增殖的愈伤组
织转移至分化培养基
、Χ上时 , 愈伤组织为淡黄绿色 , 但未 出现分化 。 在培养基 上 , 愈
伤组织上出现小芽点 , 但未进一步分化 。在培养基∃ 上 , 有胚状体的形成 ∋图版 Δ / # 5 , 并发
育成完整植株 ∋图版 Δ / 85 。
! 讨论
原生质体培养是改变植物遗传品质的主要手段和方法〔Α75 。 通常用于原生质体培养的
材料为再生性器官的组织 , 或具再生潜力的胚性愈伤组织和悬浮细胞系 。本实验所选用的
首楷材料有 9 个特点 / 一是首楷体外植株再生明显依赖于基因型 ,本实验所选用首蓓材料
不具有再生性强的特点 二是首楷的体外植株再生又明显依赖于培养条件等因素 ∋见前言
部分 5 。 因此 , 本实验所选用的愈伤组织不具备再生性器官和具再生能力的胚性愈伤组织
的优点 , 但是都具有易于培养和能得到大量原生质体的特点 , 对于大部分植物材料 , 特别
是无胚胎发生潜力的植物材料具有更重要的意义 。实验中 , 精心挑选用于游离原生质体的
愈伤组织 , 是培养成功的关键 。
原生质体单独作为一个生活着的个体存在时 , 它具有复杂的 、多细胞的生命体所具有
的全部特点 。 此时它对环境条件变得十分敏感 , 同时变得易于对环境条件形成某种依赖
性 。 因此 , 当原生质体培养于营养丰富的培养基上时 , 由原生质体再生的细胞和细胞团易
于形成对某些营养成分的依赖性 。这实际上使得细胞形成 了某种营养缺陷型的突变体 , 使
得 由原生质体形成的愈伤组织 ∋某种营养缺陷型 5更加难于再生 , 特别是 由基 因型所决定
的这种植物的体外再生能力较低时 。 首蓓即属于这种情况 。 对于首楷属植物来说 , 影响其
体外植 株再生 的因素除基 因型外 , 主要是通过改变培养基 的配 比和组成来达到此 目
的 〔, 一 ‘’〕 。 本实验则通过激素的调整 , 即用 9一 +3 刺激体细胞胚胎发生和植株再生〔, ” 。 实验
中 , 体细胞胚形成和植株再生的能力极低 。因此 , 有必要使用激素和各种培养成分的调整 ,
% % & 武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷
诱导高频率的体细胞胚胎发生和植株再生 。
参 考 文 献


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许智 宏 9 Φ − α 7 Τ ϑ 6 , Η ) 7 Σ 4, ≅ Κ Η 9 高等植物根原生质体的分离与培养 9 中国科学 ∀2 辑 # ,
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谷祝平 , 郑 国铝 9 植物激素和复合添加物对红豆草体纽胞胚发生的影响 9 实验生物学报 9
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第 ! 期 刘明志 ∃ 大叶紫花首箱愈伤组织原生质体再生植株 % % %
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野生稻 愈伤组织的超低温保存和冻后再生植株的形成 · · · · · · · ·· · · · · · · · ·· ·· ·⋯ ⋯ 殷晓辉 舒理慧 郑 从义
螺旋藻培养液吸收 Η ; &特性的研究 · · · · · · · · · · · · 一 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · ” · , · · ·· · · · · · · ·⋯⋯ 李 夜光
染色体研究的进展与植物分类学 ∀下 》 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯⋯ 徐炳声 张芝玉 陈家宽
植物染色体原位杂交技术 的发展与应用 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯ ⋯ 奇文清
银杏胚胎发育研究述评—兼论银杏系统 发育 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯⋯ 邢世岩竹柏叶精油化学成分的研究 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · ·⋯⋯ 吴惠勤 王 艇 苏应娟
刊讯 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · ·· · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯⋯
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中国绿球藻 目的新记录属 、种 、变种和变型 ∀下》 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯ ⋯ 胡征 宇 凌元洁 梁 良弼 毕列爵 ∀% ;
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宜昌大老岭种子植物区系研究 · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯⋯ 吴金清 郑 重 金义兴 ∀% ; #
金沙江干热河谷植物 区系和生态多样性的初步研究 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·一 欧晓 昆 金 振洲 ∀%
Ψ#模拟污水中氮 、磷对水稻幼苗根系呼吸作用的影响 · · · · · · · · · · · · · · · ∋ · ∋ · · · · ∋一 崔克辉 何之常 张 甲耀 夏盛林 ∀% & %#大叶紫花首箱愈伤组织原生质体再生植株 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯⋯ 刘 明志 ∀% & #
渗透胁迫下稻苗中游离脯氨酸累积与膜脂过氧化的关系 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯⋯ 肖用森 王 正 直 郭绍川 ∀% % !#
湖南省珍稀植物观赏价值及应用前景探讨 ·· · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯⋯ 隆振雄 ∀% !
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以 ΗΘ Ε为碳源工业化生产螺旋藻工艺技术的研究 · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · ·· · · · · · · ⋯ ⋯ 李夜光 胡鸿钧 张 良军 陈志祥 ∀% ! #
果树遗传转化及基 因组转 移研究进展 · · · ·· · ·· · · · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯ ⋯ 邓秀新 刘继红 ∀% = :#
!种珍珠菜 属植物染色体研究 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ⋯⋯ 廖 亮 徐玲玲 田 先华 ∀% : ;#
湖北 、河南 、安徽三 省大别 山区地理新分布植物 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯ ⋯ 何家庆 ∀% : %#
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长江三峡工程湖北库 区药 用植物 引种栽培 · · · · ·· · · · · · · · ·· · ·· · ·· · 一 ·· · · · · ·· · ·· · · · · ·· · · · · · ·· ··一 林 刚 康 宁 刘启宏 ∀% Ψ
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简讯 · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · , · · · · ·· · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·⋯⋯ ∀% !Ψ , % = 9 % : &#
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