全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 957965 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目“强优势水稻杂交种的创制与应用”(2011AA10A101)和衡阳市科技局重点项目“黄色
带状标记基因在两用核不育系中的利用” (2011KZ15)资助。
The study was supported by the grants from National High-tech R&D Program of China (863 Program)(2011AA10A101) and the Key Project
Funded by the Hengyang Science and Technology Bureau (2011KZ15).
* 通讯作者(Corresponding authors): 袁隆平, E-mail: lpyuan@hhrrc.ac.cn, Tel: 0731-89733455; 邓华凤, E-mail: dhf@hhrrc.ac.cn; 袁定阳,
E-mail: yuandingyang@hhrrc.ac.cn
第一作者联系方式: E-mail: hnggq2008@163.com, Tel: 0734-2405130
Received(收稿日期): 2015-12-28; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-03-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1116.014.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00957
水稻斑马叶突变体 zebra1349的表型鉴定及基因精细定位
郭国强 1,2,3 孙学武 2 孙平勇 2 尹建英 3 何 强 2 袁定阳 2,*
邓华凤 1,2,* 袁隆平 1,2,*
1湖南农业大学农学院, 湖南长沙 410128; 2湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点实验室, 湖南长沙 410125; 3衡阳市农业科学研
究所, 湖南衡阳 421001
摘 要: 从恢复系育种材料[R128//(R318/R1025)F1] F6 中获得一个新的斑马叶突变体 zebra1349, 突变体秧苗期如果
不移栽, 与野生型一样表现绿色, 移栽后 5 d新抽出的叶片包括叶鞘会呈现出与叶脉垂直的黄绿相间的条纹, 移栽后
30 d抽出的叶片又表现正常绿色, 成熟期主要农艺性状与野生型无明显差异。与野生型相比, 突变体六叶期斑马叶黄
区部位的总叶绿素、叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素的含量分别下降了 55.86%、61.02%、39.34%和 47.03%。透射
电镜(TEM)观察表明, 突变体斑马叶绿区部位叶绿体发育正常; 黄区部位叶肉细胞中叶绿体结构异常, 类囊体膜退
化和分解严重, 类囊体基粒片层数量明显减少, 片层间距拉大, 排列疏松。对 zebra1349与正常叶色品种杂交 F1、F2
代的遗传分析表明该性状受 1对隐性核基因调控。利用 1192株 zebra1349/02428 F2隐性定位群体, 最终把 ZEBRA1349
基因定位在水稻第 12染色体 InDel标记 indel39和 indel44之间, 其遗传距离分别为 0.04 cM和 0.17 cM, 根据日本晴
基因组序列推测, 两标记之间的物理距离约为 89 kb。本研究为 ZEBRA1349 基因的图位克隆和功能研究以及分子标
记辅助育种奠定了基础。
关键词: 水稻(Oryza sativa L.); 斑马叶突变体; 叶绿体; 基因精细定位
Morphological Characterization and Fine Mapping of Zebra Leaf Mutant
zebra1349 in Rice (Oryza sativa L.)
GUO Guo-Qiang1,2,3, SUN Xue-Wu2, SUN Ping-Yong2, YIN Jian-Ying3, HE Qiang2, YUAN Ding-Yang2,*,
DENG Hua-Feng1,2,*, and YUAN Long-Ping1,2,*
1 College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 State Key Laboratory of Hybrid Rice, Hunan Hybrid Rice Re-
search Center, Changsha 410125, China; 3 Hengyang Agricultural Science Research Institute, Hengyang 421001, China
Abstract: A new zebra leaf mutant zebra1349 was attained in a restorer line crossing population of [R128//(R318/R1025) F1] F6
in Hengyang Agricultural Science Research Institute of Hunan province. This mutant showed normal green leaves at seedlings
stage, but a zebra leaf phenotype with green-yellow bands in penpendicular to leaf vein appeared at five days after transplanting,
which was most obvious at sixth-leaf stage, and recovered normal green leaves around 30 days (ninth-leaf stage) after transplant-
ing. Until the mature stage, the zebra1349 mutant showed insignificant difference with the wild type in major agronomic traits.
The contents of total chlorophyll, chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid in yellow parts of the mutant leaf at sixth-leaf stage
decreased by 55.86%, 61.02%, 39.34%, and 47.03%, respectively. Transmission Electron Microscopic (TEM) results indicated
that the chloroplast of the mutant yellow leaf showed a serious thylakoid membrane degradation and decomposition, and the
number of thylakoid grana lamella decreased significantly with larger gap and looser arrangement. Genetic analysis using F1 and
F2 of the reciprocal crosses between zebra1349 and normal green rice varieties revealed that the zebra-leaf trait was controlled by
958 作 物 学 报 第 42卷
one pair of recessive nuclear genes. With 1192 recessive plants in a F2 population from the cross between zebra1349 mutant and
normal green variety 02428, the ZEBRA1349 gene was finely mapped between two InDel markers indel39 and indel44 on chro-
mosome 12 with a genetic distance of 0.04 cM and 0.17 cM respectively, and the physical distance was 89 kb based on comparing
with the reference genome of Japonica rice Nipponbare. These results provide a foundation for further map-based cloning of
ZEBRA1349 and molecular marker-assisted breeding.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Zebra leaf mutant; Chloroplast; Gene fine mapping
叶色突变是一种表型比较明显、易于鉴别、相
对容易获得的突变性状, 有关叶色突变的研究早在
20世纪 30年代就有报道, 迄今已在水稻、拟南芥、
小麦、大豆、大麦、玉米、番茄、烟草、油菜等多
种植物中被报道。叶色突变通常在苗期表达, 根据
苗期叶色表型可分为白化、黄化、浅绿、绿白、白
翠、黄绿、绿黄、条纹 8 种类型[1]。而其中的条纹
突变体又可分为两类, 一类为与叶脉平行的条纹叶,
另一类为与叶脉垂直的条纹, 俗称“斑马叶”。叶色突
变体如今已广泛应用于叶绿素生物合成途径[2]、光合
作用[3]、光形态建成[4]、激素生理[5]、质核基因互
作及信号传导途径[6]等光合系统结构、功能及其调
控机制的研究。另外把叶色标记应用到水稻不育系
中, 对保证水稻不育系繁殖和杂交制种纯度具有重
要的意义[7]。
对水稻叶色突变体的遗传分析和基因定位, 国
内外已有较多报道, 目前已发现近 134个水稻叶色
突变体, 这些突变基因分布在水稻所有 12条染色体
上[8]。水稻叶色突变体性状大多受 1 对隐性核基因
控制 [9], 而由细胞质基因或显性基因控制的叶色突
变体很少[10-11]。叶色突变的机制主要有: (1)叶绿素
生物合成途径相关基因突变; (2)血红素生物合成途
径中的基因突变; (3)编码其它叶绿体蛋白的基因突
变; (4)与光合系统无直接关系的基因突变等。目前
被子植物中拟南芥的叶绿素生物合成从谷氨酰
-tRNA到叶绿素 a, 叶绿素 a再经叶绿素酸酯 a加氧
酶氧化形成叶绿素 b, 整个反应过程需要 15 步, 所
有控制这 15步反应的酶基因都已被成功克隆。水稻
中也成功克隆了一些叶色相关基因, 如编码 Mg2+-
螯合酶 3 个亚基的 OsChlH、OsChlD 和 OsChlI 基
因 [12-13], 编码叶绿素合酶的 YGL1 基因[14], 编码叶
绿素酸酯 a 加氧酶的 OsCAO1 和 OsCAO2 基因[15],
编码鸟苷酸激酶的基因 virescent2[16], 编码核糖核苷
酸还原酶大亚基蛋白 RNRL1 和小亚基蛋白 RNRS1
的基因 Virescent3 和 Stripe1[17], 三角状五肽重复蛋
白基因 OsPPR1[18], 持绿突变体基因 SGR[19], 叶绿
素 b还原酶基因NYC1[20]及其同源基因NYC1-LIKE[21],
以及编码联乙烯还原酶的 OsDVR 基因[22], 但这些
基因主要是集中在编码叶绿素合成与降解途径中的
酶基因 , 水稻叶色变化过程和调控机制还远未阐
明。因此有必要发掘、鉴定一些新的水稻叶色突变
体, 进行基因定位、克隆和功能分析等方面的研究,
对于补充和完善叶绿体发育机理及叶绿素合成代谢
途径具有重要的意义。
本课题组从恢复系育种材料 [R128//(R318/
R1025)F1]F6 中获得一个斑马叶突变体 zebra1349,
该突变体秧苗期如果不移栽, 叶色和正常的秧苗一
样表现绿色, 移栽后 5 d, 新出的叶片包括叶鞘出现
与叶脉垂直的黄绿相间斑马叶性状, 以后又逐渐转
绿, 其突变性状与目前已报道的叶色突变体性状均
不相同, 是一份新的叶色突变材料。本研究对其主
要农艺性状、叶绿素含量和叶绿体超微结构等进行
了研究, 同时构建了 zebra1349×02428 F2 群体, 对
突变基因进行遗传分析和利用分子标记对突变基因
进行精细定位, 旨在为相关基因的克隆、基因功能
研究及育种应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
斑马叶突变体 zebra1349经 10代连续自交观察,
其斑马叶表型性状在湖南衡阳、湖南长沙、海南三
地都能稳定遗传。以野生型亲本 R1349为对照。
1.2 zebra1349表型特征及主要农艺性状调查
2014年在湖南省衡阳市农业科学研究所试验田
种植斑马叶突变体 zebra1349和野生型亲本 R1349。
5月 10日播种, 四叶期移栽, 单本植, 株行距 20 cm×
20 cm, 采用随机区组设计, 田间种植 3 次重复, 每
个小区 5 行, 每行 12 株, 按育种小材料田进行田间
肥水管理, 及时防治病虫害。观察实验材料在不同
时期的叶色变化, 成熟期分别取斑马叶突变体和野
生型亲本各 10株, 考察生育期、株高、剑叶长、单
株有效穗数、穗长、每穗总粒数、千粒重、结实率
等主要农艺性状。以 t 测验分析突变型与野生型的
相关性状是否存在显著差异。
第 7期 郭国强等: 水稻斑马叶突变体 zebra1349的表型鉴定及基因精细定位 959
1.3 zebra1349不同时期叶绿素含量分析
从斑马叶突变体 zebra1349 与其野生型亲本
R1349群体中, 分别取三叶期(未移栽前)、六叶期(移
栽后斑马叶典型期)、九叶期(复绿后)植株的第一叶,
去中脉 , 分别剪碎混匀 , 参照 Lichtenthaler[23]的方
法测定光合色素含量。
1.4 zebra1349叶绿体超微结构观察
取自然条件下突变体 zebra1349 斑马叶黄区部
位和绿区部位叶片及复绿叶片, 先用 3%的戊二醛
和 1%的四氧化锇双重固定, 接着用 0.2 mol L–1的磷
酸缓冲液漂洗, 再用 50%、70%、80%、95%和 100%
的乙醇梯度脱水, 最后用环氧化树脂包埋, 超薄切
片, 经醋酸铀-柠檬酸铅双染色后, 在透射电子显微
镜下观察叶绿体超微结构, 并拍照。
1.5 zebra1349的遗传分析
2013 年夏用斑马叶突变体 zebra1349 分别与正
常叶色野生型亲本 R1349、粳型广亲和材料 02428
正反交得到 F1, 其中 R1349/zebra1349、 zebra
1349/02428 两个组合同年冬季在海南三亚加代获得
F2, 2014 年在衡阳市农业科学研究所试验基地同时
种植 F1、F2, 5月 10日播种, 5月 30日移栽, 单本植,
移栽后, 当植株长至五至六叶期, 观察各植株的叶
色, 同时统计两个组合 F2群体中突变表型和正常表
型的植株数 , 计算分离比 , 根据孟德尔遗传规律 ,
进行遗传分析, 并进行 χ2测验, 推断 zebra1349的遗
传模式。
1.6 zebra1349的基因定位
用 zebra1349 与粳型广亲和材料 02428 杂交产
生的 F2作为定位群体, CTAB法[24]提取亲本及 F2群
体中叶色突变单株的基因组 DNA。先用实验室均匀
分布于水稻 12 条染色体上的 550 对分子标记(引物由
上海生工生物工程有限公司合成)进行亲本多态性分
析, 然后采用Michelmore等[25]提出的近等基因池分析
法, 将F2群体中10株正常绿叶和10株斑马叶单株DNA
等量混合, 构建正常池和突变池。用在两亲本间具有多
态性的标记分别对亲本和突变体DNA混池进行电泳分
析, 根据多态性引物在亲本和突变池的基因型, 初步找
到目的基因所在的连锁群, 再用 179 株 F2群体中的斑
马叶单株进行重组分析和连锁验证, 确定目的基因在
染色体上的大概区段, 最后在目标基因附近开发新的
SSR标记和 InDel标记进行进一步精细定位。
PCR 扩增总体系为 10 μL, 包括 1.0 μL 模板
DNA, 5.0 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix (TRAN
SGEN, 中国), 3.0 μL ddH2O, 1.0 μL引物。PCR程序
为 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s, 53~60℃退火
35s, 72℃延伸 1 min, 35个循环; 最后再 72℃后延伸
5 min。扩增产物经 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳和硝酸银染色后观察。
2 结果与分析
2.1 zebra1349的表型特征及主要的农艺性状
通过对 zebra1349 的叶色观察, 发现其叶色转
变过程为正常绿色—斑马叶色—正常绿色。秧苗期,
如果不移栽, zebra1349 与野生型一样表现绿色, 不
会出现叶色的变化(图 1-A); 移栽后 5 d 左右, 新出
的叶片包括叶鞘会呈现出与叶脉垂直的黄绿相间条
纹(图 1-B), 这种性状在六叶期表现最为明显, 以后
斑马叶片上的黄色条纹逐渐消失, 移栽后 30 d, 从
第九叶开始及以后抽出的叶片表现正常绿色 (图
1-C)。突变体 zebra1349 成熟后(图 1-D), 与野生型
图 1 突变体 zebra1349与其野生型亲本 R1349在不同时期的
表型
Fig. 1 Phenotype of the zebra1349 mutant and its wild-type
parent R1349 at the different stages
A: 苗期, 移栽前; B: 移栽后 5 d, 斑马叶出现; C: 移栽后 30 d,
斑马叶复绿; D: 成熟期; WT: 野生型; M: 突变体。
A: seedling stage, before transplanting; B: at five days (d) after
transplanting, zebra leaves appeared; C: at thirty days (d) after
transplanting zebra leaves disappeared; D: mature stage. WT: wild
type; M: mutant.
960 作 物 学 报 第 42卷
相比在株高、剑叶长度、穗长、每穗总粒数上略有减
少, 而生育期、有效穗数、结实率、千粒重有不同程
度的增加(表 1), 但 t测验表明, 突变体 zebra1349与野
生型亲本R1349在所有调查的主要农艺性状上差异不
显著。由上可知, zebra1349移栽后出现的斑马叶表型
对其后期的主要农艺性状几乎没有影响。
表 1 突变体 zebra1349与野生型(WT)亲本主要农艺性状比较
Table 1 Comparison of major agronomic traits between the zebra1349 mutant and its wild-type (WT) parent
材料
Material
生育期
Whole growth
period (d)
株高
Plant height
(cm)
剑叶长
Flag leaf length
(cm)
有效穗数
No. of effec-
tive panicles
穗长
Panicle
length (cm)
每穗总粒数
No. of spikelets
per panicle
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weigh (g)
WT 127.50±1.31 88.71±2.60 19.16±1.19 7.94±0.61 18.60±0.76 148.40±5.52 92.04±1.31 22.1±0.12
zebra1349 128.30±1.42 87.45±2.29 18.27±1.23 8.07±0.70 18.30±0.52 146.46±3.29 92.87±0.83 22.2±0.12
|t| 1.242 1.091 1.560 0.420 0.977 0.906 1.606 1.768
zebra1349和野生型的所有性状均差异不显著(P > 0.05), t(18)0.05=2.10。
The zebra1349 mutant and its wild-type had no significant difference in those traits investigated (P > 0.05), t(18)0.05=2.10.
2.2 突变体与野生型叶绿素含量的差异
三叶期 zebra1349 叶绿素和类胡萝卜素的含量
与野生型差异均不显著, 六叶期 zebra1349 斑马叶
黄区部位的色素含量极显著低于野生型, 其总叶绿
素、叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的含量分别
下降了 55.86%、61.02%、39.34%和 47.03%。而 zebra1
349 转绿后, 其叶绿素和类胡萝卜素的含量与野生
型差异又均不显著, 说明 zebra1349转绿后, 叶片的
色素合成也随之恢复正常。
2.3 突变体叶绿体超微结构观察
超微结构观察显示, 野生型叶肉细胞中叶绿体
数目多, 形状呈椭圆型, 基质浓厚, 基粒丰富, 片层
垛叠排列紧密、厚实(图 3-A)。zebra1349 斑马叶片
绿区部位叶肉细胞中叶绿体发育正常(图 3-B); 黄区
图 2 zebra1349和野生型(WT)不同发育时期叶片中色素含量分析
Fig. 2 Pigment content in leaves of zebra1349 mutant and wild type (WT) at different growth stages
**表示野生型与突变体在 0.01水平上差异显著。
** Represent significant difference between zebra1349 mutant and the wild type at the 0.01 probability level.
第 7期 郭国强等: 水稻斑马叶突变体 zebra1349的表型鉴定及基因精细定位 961
部位叶肉细胞中叶绿体类囊体膜系统退化和分解严
重, 类囊体基粒片层数量明显减少, 片层间距拉大,
排列疏松(图 3-C)。复绿后的叶片叶肉细胞中叶绿体
结构恢复正常, 类囊体膜系统重建(图 3-D)。说明
zebra1349的叶色变异与类囊体结构发育异常有关。
图 3 突变体 zebra1349和野生型叶肉细胞中叶绿体显微结构
Fig. 3 Ultrastructures of chloroplasts in the mesophyll cell of
the zebra1349 mutant and WT
A、B、C、D分别为野生型、zebra1349斑马叶绿区部位和
黄区部位及复绿叶片的叶绿体结构。P: 原片层体; G: 基粒;
O: 嗜锇粒。
A, B, C, D represent chloroplasts of the wild type, the green parts,
the yellow parts and green leaves of the zebra1349 mutant, respec-
tively. P: prolamellar body; G: granum; O: osmiophilic globule.
2.4 zebra1349的遗传模式
zebra1349分别与正常叶色野生型亲本 R1349、
粳型广亲和材料 02428 正反交, 4 个 F1杂交植株叶
片均表现为正常绿色, R1349/zebra1349、zebra1349/
02428 F2群体中正常绿苗植株与斑马叶突变植株分
离十分明显, 经 χ2检验均符合 3∶1的理论比(表 2),
表明 zebra1349 的斑马叶性状由 1 对隐性核基因控
制。
2.5 zebra1349的基因精细定位
利用 550对分子标记对亲本 zebra1349和 02428
的基因组进行多态性分析, 共筛选到 225 对在两亲
本间呈现多态性的引物, 多态性检出率为 39.57%。
选取 186对扩增效果好、均匀分布于水稻 12条染色
体的多态性引物分别扩增 2 个亲本和 2 个基因池,
发现第 12染色体上的 RM3103、RM1986、RM235、
RM17 和 SFP-12-3 标记与目标基因是连锁的, 随后
用第 12染色体上的 6个多态性标记 IRO5399、RM27
809、RM101、Zm12-5、CS1215和 RIO5415进一步
对 F2 群体中 179 个具斑马叶表型的单株进行验证,
发现这 6个标记的交换单株数依次为 22、15、1、0、
11和 36, 进一步说明该基因位于第 12染色体上, 遗
传连锁分析表明 , 斑马叶基因位于 RM101 和
CS1215之间, 遗传距离分别为 0.3 cM和 2.9 cM, 而
介于这 2个标记之间的Zm12-5没有检测出交换单株,
推断目标基因在 Zm12-5标记附近。
表 2 zebra1349与野生型亲本 R1349和 02428杂交 F2斑马叶分离情况
Table 2 Segregation of F2 population in the crosses of R1349 and 02428 with zebra1349
杂交组合
Cross
正常植株数
No. of green leaf plants
斑马叶植株数
No. of zebra leaf plants
F2群体总株数
Total No. of plants
χ2(3:1) χ20.05
zebra1349/02428 3767 1217 4984 0.454 3.84
R1349/zebra1349 1559 633 2492 2.602
为进一步精细定位该斑马叶基因, 在 Zm12-5
标记附近设计了一系列 SSR、InDel 标记(表 3), 利
用这些标记对 F2群体的 1192 株突变单株进行连锁
分析, 发现 indel39有 1个交换株, indel44有 4个交
换株, indel40 标记与目标基因共分离, 因此将目标
基因定位在 indel39 和 indel44 之间, 遗传距离分别
为 0.04 cM和 0.17 cM。根据日本晴序列, 两标记之
间的物理距离约为 89 kb, 位于一个 BAC 克隆
OJ1194_E11上(图 4)。MSU (http://rice.plantb iology.m
su.edu/)网站提供的基因注释信息, 在定位区域内包
含 12个预测基因(表 4)。
3 讨论
有关水稻斑马叶突变体, 早在 20 世纪 80 年代
Iwata 等[26]就报道过, 迄今为止国内外发现的水稻
斑马叶突变体至少有 34 个[8], 己定位到染色体上的
有 15 个(z1~z15) (http://www.shigen.nig.ac.jp/rice
/oryzabase/), 精细定位的 2个(z15[27]和 zebra524[28]),
克隆的 2个(zn[29]和 z2[30])。它们分别位于水稻第 1、
第 2、第 3、第 4、第 5、第 6、第 7、第 8 和第 11
染色体上。目前在 ZEBRA1349 所定位的第 12 染色
962 作 物 学 报 第 42卷
表 3 ZEBRA1349基因的连锁标记
Table 3 Sequence of markers linked with ZEBRA1349
引物名称
Primer name
正向序列
Forward sequence (5′3′)
反向序列
Reverse sequence (5′3′)
SFP-12-3 AATTTTCAGTGTGGCGCAAT GATCTGAGTCCCTCCATCC
IRO5399 ACGCGTCCAGGAAGGATT GATGCATGCAGGAGAACATC
CS1215 CACCTATAAATGCCAAGC TGACCCTATCCAGAAACT
RIO5415 TGCATGTTACTCAATCCTGTCC GGATATCTTGAGGCCCCTTG
RM27919 TGGCAGGTAGGAGAGGGTCTCG CTTCGGCAACGTCAGCAATGG
Zm12-5 TGGGCAACTGAATCTAACCA GGAGATGATGATGCGGTGAT
indel35 TGTAGGCGTATGTACGATTG TGTCCATATTTTCTTATCAG
indel39 TGTATATACCACCGGAACAA GAGGGAAAAGACTTCCATTT
indel40 ATTCTAAGTCCATGAGGCAA TCTCCAACATTGAGAACACA
indel44 AGTCAGGCAATTTGAAACAT ATGAGGAATGTGGAGTATGG
indel45 AAAAGTCCATGTTCCAAAAA CATAACATTCGCGTCATCTA
图 4 ZEBRA1349基因在第 12染色体上的精细定位
Fig. 4 Fine mapping of ZEBRA1349 on chromosome 12
A: ZEBRA1349被定位到第 12染色体 RM101与 CS1215之间; B: ZEBRA1349被精细定位在 InDel标记 indel39与 indel44之间;
C: ZEBRA1349被定位在 BAC克隆 OJ1194_E11 89 kb范围内; D: 定位区间预测的基因。
A: ZEBRA1349 was positioned between RM101 and CS1215 on chromosome 12; B: ZEBRA1349 was fine mapped between two InDel
markers indel39 and indel44; C: ZEBRA1349 was located in a BAC of OJ1194_E11 within 89 kb; D: putative genes in the target interval.
第 7期 郭国强等: 水稻斑马叶突变体 zebra1349的表型鉴定及基因精细定位 963
表 4 水稻第 12染色体定位区间内基因及其推测功能
Table 4 Gene names and their putative functions in the target interval
基因名称
Gene name
推测功能
Putative function
LOC_Os12g18630 Expressed protein
LOC_Os12g18640 Pentatricopeptide, putative, expressed
LOC_Os12g18650 Regulator of chromosome condensation domain containing protein, expressed
LOC_Os12g18660 Expressed protein
LOC_Os12g18670 Expressed protein
LOC_Os12g18680 Retrotransposon protein, putative, unclassified
LOC_Os12g18690 Expressed protein
LOC_Os12g18700 Expressed protein
LOC_Os12g18710 Expressed protein
LOC_Os12g18729 Expressed protein
LOC_Os12g18750 Expressed protein
LOC_Os12g18760 Peptidase family C78 domain containing protein, expressed
体上只定位了 3 个叶色突变基因(http://www.grame
ne.org/rice_mutant), 即 ETL2[31] (已克隆)、TCML2[32]
和 YGL6[33], ETL2和 YGL6为控制水稻黄化的叶绿素
缺乏突变基因 , ETL2 位于水稻第 12 染色体短臂
147 kb和 209 kb的范围内, etl2全生育期叶片呈黄色;
YGL6 位于水稻第 12 染色体着丝粒区域 Indel 标记
Ind23和 Ind37之间 143 kb范围内, ygl6在苗期叶片
为黄绿色, 到拔节期叶色变成淡绿色。TCML2 为一
个控制水稻温敏感失绿的基因, 位于水稻第 12染色
体长臂上分子标记 ID21199 和 ID21436 之间的
237 kb区域内, tcml2在 20℃条件下第 2、第 3幼叶
失绿, 第 4 叶开始完全转绿, 而 24℃以上条件其表
型与野生型一致, 呈正常绿色。本研究所鉴定的叶色
突变体 zebra1349 秧苗期如果不移栽, 与野生型一样
表现绿色, 移栽后 5 d 新出的叶片包括叶鞘会呈现出
与叶脉垂直的黄绿相间条纹, 移栽后 30 d抽出的叶片
又表现正常绿色, 其叶色变异特征和以往报道的斑马
叶色突变体完全不同, 并且其基因位于水稻第 12染色
体短臂靠近着丝粒 InDel标记 indel39和 indel44之间,
因此无论是从叶色的表型上还是基因在染色体的位置
上都可推断 ZEBRA1349是一个新的叶色基因。
叶绿体是光合作用的场所, 其发育调控机制一直
是植物生理和分子生物学研究的热点。Kusumi 等[34]
将水稻叶绿体发育在分子水平上分为 3 个时期: (1)与
叶绿体发育和分裂相关的基因(如 OsPOLP1和 FtsZ)
大量表达; (2)依赖核基因编码的 RNA 聚合酶(NEP)
转录的质体编码的 RNA 聚合酶 (PEP)基因 , 如
OsRpoTp、v2、rpoA等基因大量表达; (3)与光合作用
相关的核编码和质体编码的基因大量表达。zebra1349
是一个由移栽等机械损伤引起叶色变异的新材料 ,
其调控叶色变异的分子机制可能不同于以往叶色突
变体, 该突变体的发现可能会成为研究高等植物叶
绿体发育机理的理想材料。本研究将 ZEBRA1349基
因定位在水稻第 12染色体短臂靠近着丝粒 InDel标
记 indel39和 indel44之间, 分别距其 0.04 cM和 0.17
cM, 根据日本晴序列可知物理距离约为 89 kb。利用
MSU网站对该区域内的 12个预测基因分析, 发现 2
个与叶色有关的基因, 1 个是 LOC_Os12g18630, 该
基因表达蛋白与质体发育有关 ; 另一个是 LOC_
Os12g18640, 该基因编码一个三角状五肽蛋白
(pentatricopeptide repeat protein)。近年来的研究表明,
PPR 基因在植物中大量存在, 水稻基因组中有 650
个, PPR蛋白基因由细胞核控制, 亚细胞定位大多数
定位在叶绿体或线粒体上, PPR 蛋白基因对这些细
胞器基因的表达具有重要的调控作用[35], 许多植物
失绿突变体与 PPR 蛋白有关[36], 生物信息学方法分
析表明 PPR 的基因结构有一个显著特点, 其基因序
列几乎不含内含子[35], 而据水稻基因组信息, LOC_
Os12g18640只有一个内含子, 其转录子全长 2028 bp,
说明 LOC_Os12g18640编码典型的 PPR蛋白。但要最
终确定哪个基因是 ZEBRA1349, 还需对野生型和突变
体全长基因进行克隆、测序, 并对候选基因进行互补
验证, 相关研究正在进行当中。
近年来, 叶色标记在育种中的应用愈来愈受到
关注, Shu等[37]经多年研究认为, 作为叶色标记应具
备以下 4个条件: (1)标记性状明显, 易鉴别; (2)标记
性状稳定, 不易受环境因素影响; (3)标记性状无显
著负效应; (4)标记性状受隐性核基因控制。由于叶色
964 作 物 学 报 第 42卷
突变往往直接或者间接影响叶绿素的合成降解, 导
致光合效率下降, 造成植株生长发育不正常而减产,
在迄今发现的水稻叶色突变体中, 绝大多数由于农
艺性状欠佳难以在育种上利用。zebra1349遗传行为
简单、由 1 对隐性核基因控制, 叶色标记明显、易
于识别, 同时成熟期主要农艺性状与野生型相比差
异均不显著, 说明突变性状对植株的生长发育没有
产生不利影响, 因此 ZEBRA1349作为叶色标记基因
在水稻遗传育种中具有更大的应用前景。
4 结论
从恢复系育种材料[R128//(R318/R1025)F1]F6 中
获得一个斑马叶突变体 zebra1349, 该突变体秧苗期
如果不移栽, 叶色和正常的秧苗一样表现绿色, 移
栽后 5 d, 新出的叶片包括叶鞘会出现斑马叶性状,
从第九叶开始及以后抽出的叶片表现正常绿色, 成
熟期主要农艺性状与野生型相比没有明显的差异。
斑马叶片黄区部位中的叶绿素和类胡萝卜素含量显
著下降, 叶绿体结构异常, 绿区部位叶绿体结构正
常。突变性状由 1 对隐性核基因控制, 该基因位于
第 12 染色体短臂靠近着丝粒 InDel 标记 indel39 和
indel44之间, 遗传距离分别为 0.04 cM和 0.17 cM,
物理距离约为 89 kb, 尚未见该区段内有叶色突变体
的报道。zebra1349是一个新的水稻叶色突变体, 为
水稻叶色变异机制的研究提供了理想材料, 本研究
为下一步该基因的克隆和功能分析奠定了基础。
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