全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 992−998 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划 (863 计划 )项目 (2011AA10A100), 国家自然科学基金项目 (31171178)和重庆市攻关项目 (CSTC,
2012ggc8002)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: kischengxin@126.com
Received(收稿日期): 2012-11-12; Accepted(接受日期): 2013-01-05; Published online(网络出版日期): 2013-03-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130322.1737.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00992
水稻叶片灰白转黄突变体 pyr1的鉴定与基因定位
程 欣 任德勇 马 娇 朱晓燕 桑贤春 凌英华 赵芳明 何光华*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市市级重点实验室 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 鉴定和克隆叶色突变基因对于深入了解叶绿素合成、降解途径的关系以及植物的光合作用有着重要的作用。
从 EMS 诱变恢复系缙恢 10 号后代中鉴定出 1 个灰白转黄突变体 pyr1, 该突变体在苗期部分死亡, 整张叶片呈现灰
白色, 在不同的生育时期叶片呈现不同的颜色, 直到孕穗期叶片上部和叶缘表现黄色。苗期到抽穗期突变体叶绿素含
量比野生型显著或极显著降低。透射电镜观察表明, 突变体与野生型细胞结构无明显差异, 但叶绿体发育异常, 内部
大量降解, 基质片层退化。遗传分析表明该性状受 1 对隐性基因控制, 利用 326 株 F2隐性定位群体将 PYR1 基因定
位在第 1染色体长臂上, 位于标记 RM11722和 Ind1之间, 物理距离约 92 kb, 本研究为 PYR1基因的图位克隆奠定了
基础。
关键词: 灰白叶; 水稻(Oryza sativa L.); 叶绿体; 基因定位
Identification and Gene Mapping of Leaf Pale Yellow-Revertible Mutant pyr1
in Rice
CHENG Xin, REN De-Yong, MA Jiao, ZHU Xiao-Yan, SANG Xian-Chun, LING Ying-Hua, ZHAO
Fang-Ming, and HE Guang-Hua*
Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops /
Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China
Abstract: It is important for the further understanding of the relationship between chlorophyll synthesis and degradation pathways
and plant photosynthesis to identify and clone leaf color mutant gene. A leaf pale yellow-revertible mutant temporarily designated
as pyr1 was obtainted from the progeny of rice (Oryza sativa L.) restorer line Jinhui 10 which was induced by ethyl methane sul-
fonate (EMS). In the seedling stage, the whole leaf of mutants presented pale and some mutants died. The pyr1 displayed different
colors in different growth periods. At the booting stage upper-leaf and leaf margin exhibited yellow. Compared with the wild type,
the chlorophyl contents of pyr1 mutant decreased from seedling stage to filling stage. Transmission electronic microscopy obser-
vation showed that the structure of cells had no obvious differences between mutant and wild type, but the chloroplast developed
abnormally with degradation of the inside and matrix slices. Genetic analysis revealed that the trait was controlled by one reces-
sive gene. With 326 recessive individuals from the F2 segregation population, the PYR1 gene was finally mapped between
RM11722 and Ind1 on the long arm of chromosome 1, with an approximate physical distance of 92 kb. These results provide a
basis of PYR1 gene cloning by map-based strategy.
Keywords: Pale leaf; Rice (Oryza sativa L.); Chloroplast; Gene location
光合作用完成光能到化学能的转换, 对植物生
命活动起着重要的作用。光合作用主要是在叶绿体
上进行, 叶绿体是植物细胞所特有的半自主性细胞
器 , 也是叶绿素、脂类、淀粉和氨基酸的合成场
所[1-2]。叶绿素合成与叶绿体发育紧密相关, 涉及到
叶绿体基因和核编码基因的协同表达 [3], 尤其是编
码质体蛋白的核基因的表达, 依赖于叶绿体的发育
和代谢状态[4]。叶色突变是自然界中比较常见的突
变形式, 以其突变频率高、性状明显、易于鉴别等
特点, 很早就被人们所关注和研究。由于导致突变
第 6期 程 欣等: 水稻叶片灰白转黄突变体 pyr1的鉴定与基因定位 993
的基因往往对叶绿素合成和降解途径产生直接或间
接的影响 , 改变叶绿素含量 , 从而导致叶色变化 ,
因此也被称为叶绿素缺陷突变体[5]。近些年, 叶色突
变体的应用价值受到越来越多的青睐, 叶色变异可
作为标记性状, 简化良种繁育和杂交育种[6]。具有某
些特殊优良性状的叶色突变体, 也为作物遗传育种
提供了优异的种质资源[7]。另外, 随着水稻、拟南芥
等模式植物基因组序列的公布, 叶色突变体在功能
基因组学上的研究价值正受到越来越多的关注, 已
成为研究植物光合系统结构[8-9]、激素生理和抗病机
制[10-11]以及基因功能和调控机制[12]的理想材料。
自 20 世纪 30 年代以来, 在拟南芥、水稻、玉
米、高粱、棉花、小麦、大麦和大豆等高等植物中
均有叶色突变体的报道[12-14], 水稻叶色突变基因在
染色体上的分布比较广泛, 据不完全统计, 目前报
道的已超过 80个, 其中白化、黄化叶突变体最多, 部
分叶色突变基因已经被定位[15-17], 至少有6个已被克
隆 , 如控制突变性状的编码镁离子螯合酶的
OsCHLH基因[18]; 编码叶绿素 a加氧酶(chlorophyll a
oxygenase, CAO)的 OsCAO 基因[19]以及编码叶绿素
合成酶的 YGL1 基因[20]。这些基因大多是通过图位
克隆的方法获得的。
大多数水稻叶色突变在苗期表达, 出现诸如白
化、黄化、浅绿、条纹、斑点等表型。本研究利用
EMS诱变恢复系缙恢 10号, 获得一个新型的灰白转
黄突变体 pyr1, 该突变体叶片苗期呈现灰白色, 在
不同生育期表现不同颜色, 至孕穗期叶片呈黄色。
本文对其进行了表型鉴定、遗传分析和分子定位等
研究。
1 材料与方法
1.1 材料
在 EMS 诱导籼稻恢复系缙恢 10 号(Jinhui 10)
后代中发现 1 个灰白转黄突变体 pyr1, 连续多代种
植观察, 突变表型稳定遗传。以缙恢 10号为野生型
对照。
1.2 叶绿体色素含量测定
上午 9:00, 选取种植小区中间 5 个单株, 在苗
期、抽穗期分别测定 pyr1及其野生型叶片中部的叶
绿体色素含量。计算参考 Lichtenthaler的方法[21]。
1.3 细胞结构观察
参照何瑞峰等[22]的方法用电镜观察突变体和野
生型叶片的细胞结构。以戊二醛和锇酸双重固定后,
利用不同梯度的乙醇逐级脱水, 再置换和包埋, 超
薄切片后 , 以醋酸双氧铀和柠檬酸铅液双重染色 ,
H600型透射电镜观察并照相。
1.4 农艺性状
在植株成熟后, 分别选择缙恢 10号和 pyr1突变
体小区中间 10株, 考查株高、有效穗、每穗粒数、
每穗实粒数、千粒重、结实率等主要农艺性状。
1.5 DNA的提取和连锁标记的筛选
参照 Michelmore等[23]的 BSA法筛选连锁标记,
即从 F2植株群体中分别选取 10株正常单株和 10株
突变单株, 剪取等量叶片, 采用改良的 CTAB 法提
取 DNA[24], 构建正常基因池和突变基因池。采用碱
煮法提取定位群体单株 DNA用于连锁分析[25]。
1.6 SSR扩增分析
SSR 引物序列参照 http://www.gramene.org/mi-
crosat。PCR总体积 25 μL, 包括 2.5 μL的 10×PCR
buffer (+Mg2+), 0.5 μL的 2.5 mmol L−1 dNTPs, 17.75
μL的 ddH2O, 2.0 μL的 10 μmol L−1引物, 2.0 μL的模
板DNA和 0.25 μL的 5 U μL−1 Taq DNA聚合酶。PCR
程序为 94℃预变性 3 min; 94℃ 30 s、57℃ 30 s、
72℃ 1 min, 35个循环; 最后再 72℃延伸 10 min。
PCR 产物经 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和快速
银染后观察[26]。
1.7 遗传图谱的构建
选取日本晴/pyr1 构建的 F2 群体隐性单株为作
图群体。将具有日本晴带型的单株标记为 A, 具有
pyr1 带型的单株标记为 B, 具有双亲带型的单株标
记为 H, 用 Mapmaker3.0 分析数据和作图 [27], 用
Kosanbi函数[28]将重组率转化为遗传距离(cM)。
2 结果与分析
2.1 灰白转黄突变体 pyr1的表型鉴定
pyr1 突变体在苗期便表现严重的灰白化, 整张
叶片都呈现灰白的性状(图 1-A, B), 分蘖期叶片边
缘出现淡黄色的条纹, 植株发育受阻, 株型较为细
小(图 1-C, D)。到孕穗期植株叶片变成黄色(图 1-E,
F)。而野生型缙恢 10号叶片一直保持正常。分蘖期
分别选取叶片上部细胞以透射电镜观察显示, 野生
型叶肉细胞的叶绿体规则地贴壁分布, 完整地被膜
包裹, 基质浓厚, 基质片层有序排列(图 1 中的 1-1
和 1-2); 突变体的细胞不规则, 内部大量降解, 叶绿
体结构异常, 有少量嗜锇小体, 基质片层减少退化,
不规则地散乱分布, 说明该区域叶绿体已经退化(图
994 作 物 学 报 第 39卷
1中的 2-1和 2-2)。在主要农艺性状方面, 与野生型
相比, pyr1的有效穗、千粒重和株高显著下降, 每穗
粒数、每穗实粒数和结实率极显著减少。其中 pyr1
的株高为对照的 83.47%, 结实率为对照的 72.41%,
而每穗粒数和每穗实粒数仅为对照的 56.32%和
40.08% (表 1)。
2.2 光合色素含量分析
由图 2可知, 在苗期, pyr1的叶绿素 a、叶绿素
b 和类胡萝卜素的含量都极显著小于野生型, 抽穗
期 pyr1倒三叶的叶绿素 a和叶绿素 b含量极显著降
低, 类胡萝卜素含量显著降低; 倒二叶和剑叶的叶
绿素 a和叶绿素 b的含量显著下降, 而类胡萝卜素没
有显著变化。在 3 片功能叶中, 倒三叶下降幅度明
显高于倒二叶和剑叶。
2.3 遗传分析
日本晴与 pyr1 正反交结果表明 F1群体表现正常,
日本晴/pyr1 的 F2 代群体出现明显的分离, 正常单
株(912株)∶灰白转黄突变株(326株)符合 3 1∶ 的分
离比例(χ2=1.12 < χ20.05=3.84), 说明 PYR1受 1对隐性
核基因控制。
2.4 PYR1基因的分子标记定位
利用均匀分布于 12 条染色体上的 400 对 SSR
图 1 野生型(WT)和突变体 pyr1的表型比较和叶绿体透射电镜观察
Fig. 1 Phenotype and observation of chloroplast under transmission electron microscope of pyr1 mutant and the wild type
(WT)
A~B: 苗期表型; C~D: 分蘖期表型; E~F: 孕穗期表型; 1-1: 图 D部位 1的细胞结构; 1-2: 图 D部位 1的叶绿体结构,
2-1: 图 D部位 2的细胞结构; 2-2: 图 D部位 2的叶绿体结构。
A–B: Phenotype at seedling stage; C–D: Phenotype at tillering stage; E–F: Phenotype at booting stage; 1-1: Cell structure of part 1 in figure
D; 1-2: Chloroplast structure of part 1 in figure D; 2-1: Cell structure of part 2 in figure D; 2-2: Chloroplast structure of part 2 in figure D.
表 1 突变体 pyr1与野生型(WT)的主要农艺性状分析
Table 1 Main agronomic traits of the pyr1 mutant and the wild type (WT)
材料
Material
有效穗
Effective panicle
每穗粒数
Grain number
per panicle
每穗实粒数
Filled grain number
per panicle
结实率
Seed setting rate
(%)
千粒重
1000-grain
weight (g)
株高
Plant height
(cm)
WT 8.6±0.75 157.5±4.93 139.90±4.38 88.91±0.76 26.58±0.08 115.95±4.63
pyr1 6.0±1.79* 88.7±7.39** 57.08±7.97** 64.38±2.58** 23.99±0.61* 96.78±3.82**
* 在 0.05水平上差异显著; ** 在 0.01水平上显著差异。* Significantly different at P<0.05; ** Significantly different at P<0.01.
第 6期 程 欣等: 水稻叶片灰白转黄突变体 pyr1的鉴定与基因定位 995
引物扩增 pyr1和日本晴, 76对引物表现出多态性。
其中, RM7202和 RM3825在正常基因池和突变基因
池之间表现差异, 推测可能与 pyr1 位点连锁。另选
取 F2群体中的 10株正常单株和 10株突变单株验证
表明, 2个标记与 PYR1连锁。利用 326株 F2隐性定
位群体将 PYR1定位在第 1染色体 SSR标记 RM7202
和RM3825之间, 遗传距离分别为 2.6 cM和 1.8 cM。
在两标记之间进一步设计合成 12 对 SSR 引物和 5
对 InDel 标记, 最终把 PYR1 基因定位在 RM11722
和 Ind1-1 (GCCCGCTTTCTTCTCTCTCTT, AAGAC
ACAATGTATGTATAACAAGTGGG)之间, 遗传距离
分别为 0.3 cM和 0.4 cM, 其中 RM11722有 2个交换
株, Ind1有 3个交换株, 两标记间没有交叉交换株。
根据日本晴序列, 两标记之间的物理距离约为 92 kb,
此区间包括 AP003371 和 AP003106 2 个 BAC 克隆
(图 3)。根据 gramene 网站提供的基因注释信息
(http://www.gramene.org/Oryza_sativa/Location), 在
定位的 92 kb区域内共有预测基因 14个, 其中有 1
图 2 pyr1突变体和野生型各时期光合色素含量
Fig. 2 Photosynthetic pigments contents of pyr1 mutant and wild type at different stages
A: 苗期 pyr1和野生型(WT)叶片中光合色素含量比较; B~D: 抽穗期 pyr1和野生型(WT)剑叶、倒二叶、倒三叶中光合色素含量比较。
Chl a: 叶绿素 a; Chl b: 叶绿素 b; Total Chl: 叶绿素 a+b的总量; Car: 类胡萝卜素。*表示在 0.05水平上差异显著; **表示在 0.01水平
上差异显著。
A: photosynthetic pigments contents of the pyr1 mutant and the wild type (WT) at seedling stage; B–D: photosynthetic pigments of the flag,
second, and third leaf respectively in the pyr1 mutant and the wild type at heading stage. (Chla is chlorophyll a; Chl b is chlorophyll b; Chl
a+b is content of chlorophyll a and chlorophyll b; Car is Carotenoids). * Significantly different at P<0.05; ** Significantly different at
P<0.01.
图 3 PYR1基因在第 1染色体上的连锁图谱
Fig. 3 Linkage mapping of PYR1 on chromosome 1 of rice
996 作 物 学 报 第 39卷
个转座子和逆转座子蛋白基因、1个假定蛋白基因、
1 个脱羧酶基因、2 个蜡合酶基因、1 个 ABC 转运
蛋白基因、1个与枯草杆菌同源的蛋白酶基因、1个
包含 F-box 结构域的蛋白基因、1 个包含 DUF567
结构域的蛋白基因, 以及 4个未知功能基因。
3 讨论
作物叶色变异往往与产量相关, 通常会影响突
变体的光合效率, 进而减产, 严重时甚至会导致植
株死亡。叶绿素是植物光合作用的必要基础, 叶绿
体发育和叶绿素合成涉及核基因和质体基因共同控
制的复杂的调控过程, 其中任何一个基因发生突变
都有可能导致叶绿体发育缺陷或叶绿素缺乏, 光合
作用受阻 , 表现叶色变异 ; 若是线粒体发育受阻 ,
ATP 合成受阻同样也会造成光合系统及营养运输不
顺畅, 进而表现叶色的突变。目前报道的叶色突变
体种类繁多, Gustafsson[29]根据苗期叶片表型把突变
体分为白化、黄化、浅绿、条纹、斑点 5 大主要类
型。大多数叶色突变体的突变表型在苗期表达, 在
整个生育时期呈现恒定的叶色 , 如黄绿色突变体
chl4、chl6、chl8在整个生育期均呈现黄绿色; 条纹
突变体 st1、st4、st5 在整个生育时期叶片都呈现条
纹状。有些突变体只在苗期表现突变性状, 到了分
蘖期表型基本恢复, 如白化转绿突变体 gra 等[30]。
也有一些突变体在苗期之后表达, 如常绿型突变体
stay green生育末期叶片保绿的时间较长; 阶段性返
白突变体 sgra 苗期叶色正常, 六至八叶期以后新生
叶白化, 随后白化转绿 [31], 而较少报道在整个生育
时期变化叶色的突变体。白化致死突变体 al1、al2、
al3、al4在苗期叶片完全白化, 萌发后只能存活 8~10
d [20], 其中 al2、al3、al4无叶绿体形成。而 pyr1突
变体在苗期呈现灰白色 , 部分致死 , 致死率达到
39.6%, 有叶绿体形成, 在整个生育时期 pyr1叶片呈
现一个变化的过程。这与已报道的白化致死突变体
al1、al2、al3、al4不同。本研究的突变体 pyr1在苗
期植株部分死亡, 叶片呈现灰白色, 分蘖期叶片边
缘出现淡黄色条纹 , 孕穗期叶上部和叶缘呈现黄
色。透射电镜观察表明突变体 pyr1叶绿体内部大量
降解 , 基质片层减少退化 , 不规则地散乱分布 , 叶
绿体已经退化。苗期 pyr1 叶绿素含量极显著降低;
抽穗期 3 片功能叶叶绿素含量也显著降低, 但降低
幅度明显小于苗期。pyr1 与已报道的叶色突变体的
表型不同, 在整个生育期, pyr1 的叶片呈现灰白—
淡黄条纹—黄色的变化过程 , 是一个新的叶色突
变体。
目前报道的水稻叶色突变相关基因已经超过 80
个(http:/www.gramene.org/), 除第 12 染色体外其余
11 条染色体上均有分布。白化转绿突变体是目前研
究最多的, 属于一类特殊的非致死不完全白化突变,
目前已有很多报道。王军等[32]发现白化转绿突变体
v13(t)的前 3 叶表现白色, 以后逐渐转绿, 定位在第
5染色体 Ind5-11与 Ind5-8之间; Chen等[33]通过对水
稻秋丰 M 白化转绿突变体的研究 , 将突变基因
GRA(t)定位在水稻第 2 染色体长臂上 , SSR 标记
RM475和 RM2-22之间, 该突变体前 3叶白化带绿,
第 4 叶及以后叶片均为淡绿色; 郭士伟等[30]将 gra
定位在第 10染色体 RM25522和 RM25535之间, 该
突变体四叶期前叶色为黄绿色白化, 之后逐渐变绿;
张向前等[31]发现阶段性返白突变体 sgra幼苗期叶色
正常, 而 6~8 叶期以后新生叶白化, 随后白化叶转
绿, 定位于水稻第 11 染色体 IDM-2 和 RM26739 之
间。通常情况下, 白化转绿突变体的突变性状只在
苗期表达, 后期可以恢复到正常状态, 光合色素含
量的变化和叶色变化相一致, 因而突变对产量和其
他农艺性状无显著影响 [33]。而本文报道的突变体
pyr1 的叶片呈现一个由灰白转黄的过程, pyr1 的有
效穗、千粒重和株高显著下降, 每穗粒数、每穗实
粒数和结实率极显著减少, 进一步表明 pyr1 与白化
转绿突变体不同。关于水稻第 1 染色体叶色转变的
基因目前未见报道。目前在水稻第 1 染色体上已经
定位的叶色基因很多, 其中 CHL5、CHL6 是叶片黄
化基因; FS2、ST9(t)是条纹叶基因; Z8是斑马叶基因;
AL4、AL8、V6 等是与叶片白化相关的基因[20]。这
些突变体在整个生育时期叶片颜色没有明显变化 ,
而其中 v6 [34]突变体在苗期叶片几乎完全白化, 只有
在移栽后叶片转为白绿色, 中脉和穗子也出现白条
纹, 这和本文研究的 pyr1突变体表型完全不同。pyr1
突变体位于第 1染色体 RM11722与 Ind1之间, 物理
距离为 92 kb, 定位区间内尚未见有叶色突变基因的
定位报道, 更无有关基因的克隆信息, 因此, pyr1不
同于白化及白化转绿突变体, 属于一类新型的突变
体, 可能受一类新基因调控, 这将为基因克隆和水
稻叶色的研究奠定基础, 同时也可将其作为作物遗
传育种的优良种质资源。
第 6期 程 欣等: 水稻叶片灰白转黄突变体 pyr1的鉴定与基因定位 997
4 结论
pyr1 在苗期部分致死, 整个生育期叶片颜色由
灰白渐变最终转为黄色, 光合色素含量下降, 有效
穗、千粒重和株高显著下降, 每穗粒数、每穗实粒
数和结实率极显著减少, 该性状受 1 对隐性基因控
制。PYR1 基因被定位在第 1 染色体 SSR 标记
RM11722和 Ind1之间, 物理距离 92 kb, 尚未见该区
段内有叶色突变体的报道。pyr1 不同于以往报道的
叶色突变体, 是一个新的水稻叶色突变体, 这为下
一步基因的克隆和功能分析奠定了基础, 为水稻叶
色变异的机制研究提供了理想的材料。
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