全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(5): 814−819 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08001-001)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 林拥军, E-mail: yongjunlin@mail.hzau.edu.cn
Received(收稿日期): 2011-08-29; Accepted(接受日期): 2012-01-19; Published online(网络出版日期): 2012-03-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120305.1036.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00814
连续回交对消除农杆菌介导转化引起水稻体细胞变异的影响
杨 宙 1,2 陈 浩 1 唐 微 3 林拥军 1,*
1 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 / 国家植物基因研究中心, 湖北武汉 430070; 2 江西省农业科学院水稻研究所, 江西南
昌 330200; 3 湖北医药学院生物化学系, 湖北十堰 442000
摘 要: 农杆菌介导的转化引起许多体细胞变异, 影响了转基因植物的农艺性状。因此, 转基因作物的培育需要大量
的 T0代再生植株。在本研究中, 我们将转基因水稻株系与原始品种连续回交, 然后评价其回交后代的表现, 消除体
细胞变异, 恢复转基因亲本的农艺性状。回交的供体亲本是 3 个转基因水稻株系, 分别带有来自于苏云金芽胞杆菌
(Bt)的抗虫基因。与原始品种连续回交至 BC3F1代, 每代 BCnF1单株再自交两代, 同时对各个世代进行抗虫性选择。
通过发芽试验获得转基因纯合的 BCnF3株系, 在室内抗性试验中, 所有的 BCnF3纯合株系都能杀死 100%的幼虫。在
田间试验中, 这些株系的单株产量明显高于供体亲本, 大部分农艺性状与原品种没有显著的差异。这些结果说明连续
回交能够在很大程度上恢复转基因水稻株系的农艺性状, 从而减少转基因育种过程中所需的工作量。
关键词: 连续回交; 体细胞变异; 农杆菌介导转化; 转基因水稻; 抗虫性; 农艺性状
Effect of Successive Backcrossing on Eliminating Somaclonal Variation Caused
by Agrobacterium-Mediated Transformation in Rice
YANG Zhou1,2, CHEN Hao1, TANG Wei3, and LIN Yong-Jun1,*
1 National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Centre of Plant Gene Research, Huazhong Agricultural University, Wuhan
430070, China; 2 Rice Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 3 Biochemistry Department, Hubei
University of Medicine, Shiyan 442000, China
Abstract: Somaclonal variation caused by Agrobacterium-mediated transformation influences some agronomic traits of trans-
genic plants. As a result, a large number of T0 regenerated plants are required in the development of transgenic crop. Here, we
successively backcrossed transgenic rice (Oryza sativa L.) to progenitor variety and evaluated agronomic performance of progeny,
with the objective of eliminating somaclonal variation and recovering agronomic traits of transgenic parent. Three transgenic lines
possessing different insect-resistance genes from Bacillus thuringiensis (Bt) were used as donor parents. They were backcrossed
successively to the progenitor variety, and the individuals of each BCnF1 generation were then selfed twice, with selection for in-
sect-resistance. BCnF3 homozygous lines, which were selected by a germination assay, caused an insect mortality of 100% in
laboratory bioassay. In the field evaluation, these lines showed obviously higher yield than the donor parents and no significant
differences from the progenitor variety in most agronomic traits. These results indicate that successive backcrossing can to a large
extent recover agronomic traits of transgenic rice and reduce the workload required in transgenic breeding program.
Keywords: Successive backcross; Somaclonal variation; Agrobacterium-mediated transformation; Transgenic rice; Insect-
resistance; Agronomic trait
随着植物基因工程的发展, 许多外源基因被克
隆出来转入作物, 用于改良各种遗传性状。农杆菌
介导的转化法是一种重要的植物转基因技术, 在多
种作物上都得到了应用。与其他的转化方法, 如基
因枪和电转化相比, 农杆菌转化法具有以下的优点:
(1)外源基因能够稳定有效地表达, 较少发生基因沉
默; (2) T-DNA以单拷贝或较低的拷贝数插入[1-2]; (3)
操作过程花费少, 转化效率高[3]。
但是, 农杆菌介导转化的植株会出现普遍的表型
变异。Dale等[4]报道转基因土豆(Solanum tuberosum L.)
第 5期 杨 宙等: 连续回交对消除农杆菌介导转化引起水稻体细胞变异的影响 815


在田间开花期的株高、块茎数量和重量等性状方面
的表现都比非转基因植株差。Wang 等[5]用 RFLP、
RAPD 和微卫星 DNA 标记调查了转基因杨树
(Populus nigra L.)叶形的改变, 结果表明这些变异
与基因组的变化有关。以下因素被认为是引起转基
因植株表型变异的原因: (1)转基因插入导致的内源
基因失活[6]; (2)外源基因在植物中的多效性[4]; (3)转
基因过程引起的植物体细胞变异[7-8]。
水稻(Oryza sativa L.)是最重要的粮食作物之一,
但是经常遭受鳞翅目钻心虫和卷叶螟的严重危害。
为了有效地防治鳞翅目害虫, 许多来自于苏云金芽
胞杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称 Bt)的抗虫基因
已经被转入了水稻。Hiei 等[9]首次建立了农杆菌介
导的水稻遗传转化体系 , 在目前的大部分报道中 ,
Bt 水稻都是通过这种方法培育的。水稻的遗传转化
须要经历一个长时间的组织培育过程, 增加了体细
胞变异的可能性, 会影响再生植株的性状表现。通
过 AFLP和 RAPD标记的检测, Labra等[10]发现农杆
菌转化法得到的水稻植株比基因枪和电击法获得的
植株具有更多的基因组变异。Shu等[3]研究了转基因
Bt 水稻的农艺性状和形态学性状的变化, 证明 2 个
高代纯合株系中的变异是由体细胞变异引起的。
水稻中与体细胞变异相关的突变表型有很多 ,
包括株高、叶色、穗长、分蘖能力、产量组成和各
种抗性[3,11-13]。绝大部分的变异并不是人们所期望的,
它们使 T0代再生植株失去了在育种中的应用价值。
因此, 如果育种工作者想要获得理想的转基因材料,
特别是对于那些转化效率很低的物种, 就必须进行
大量的转化工作来产生足够的T0代转基因植株以供
选择。
回交可以将来源于供体亲本的一个或多个目的
基因导入受体亲本。Sundaram等[14-15]借助分子标记
对前景和背景的选择 , 通过回交育种将 3个白叶枯
病抗性基因导入 2 个印度的水稻品种 Samba Mahsuri
和Triguna, 获得的株系对白叶枯病原菌有良好的抗性,
产量也明显高于受体亲本。另外, 也有利用回交方法
培育抗病性的大豆(Phaseolus vulgaris L.)株系的报
道[16]。理论上, 连续回交能够将转基因导回起始亲本,
同时保证遗传背景几乎不发生改变, 从而极大地减少
转化所需的工作量。目前, 已经有一些通过回交改良
转基因作物株系性状的报道[17-18]。
在本研究中, 我们将 3个转 Bt基因水稻株系与
原始品种连续回交 3次, 然后将每代的 BCnF1 (n = 1,
2, 3)自交 2次, 同时每代进行抗虫性选择。最后, 评
价 BCnF3 纯合株系的性状表现, 期望消除体细胞变
异, 恢复转基因水稻的农艺性状。
1 材料与方法
1.1 水稻株系
回交的供体亲本是 3个纯合的转基因株系, 是通
过农杆菌介导的转化将Bt基因导入籼稻恢复系明恢
63 (MH63)获得的。3个纯合株系在这里分别被命名
为 1Ac-1、1C-19 和 2A-1, 导入的分别是 Bt 基因
cry1Ac、cry1C和 cry2A。之前的报道已证明这些株
系是转基因单位点插入的, 对三化螟和卷叶螟具有
优良的抗性[19-21]。本研究中所用的起始材料是 T7代
植株, 它们的部分农艺性状与原始品种有明显的差
异。MH63 被用来作为回交的轮回亲本和评价的对
照材料。
1.2 回交与选择
分别以 1Ac-1、1C-19 和 2A-1 为供体亲本, 与
MH63连续回交至 BC3F1代, 从每代 BCnF1中选出多
个转基因单株自交 2 次获得 BCnF3群体。每个世代
的植株都种植在田间, 不喷洒杀虫剂, 选择没有受
到卷叶螟危害的植株用于下一代的回交或自交, 没
有对农艺性状进行选择。
成熟后将 BCnF2群体中选出的抗性单株分开收
种, 用发芽试验筛选 BCnF3纯合株系。操作步骤为:
将种子去壳, 用 0.15%的 HgCl2消毒 15 min, 接着用
无菌水清洗 3次后接到 Basta浓度为 10 mg L−1的 1/2
MS培养基上[22], 7 d后统计出芽率。膦丝菌素抗性
基因(bar)是转化过程中使用的选择标记基因, 能对
Basta产生抗性[23], 因此 BCnF2纯合单株的所有种子
都会在培养基上正常发芽。
1.3 室内抗虫性试验
从附近的水稻田间收集三化螟 (Scirpophaga
incertulas Walker)的卵块, 在室内人工孵化出幼虫。
来自相同回交程序的 3 个 BCnF3纯合株系一起进行
检测, 以相应的供/受体亲本作为抗性/敏感对照。取
拔节期水稻新鲜的茎秆, 切成 10 cm 长的茎段。每
个养虫管(长 12 cm, 直径 2 cm)中放入相同的茎秆和
20 头一龄幼虫作为一个重复, 每种材料 3 个重复。
养虫管用棉塞和黑布密封, 置于温度 28℃, 相对湿
度 80%的条件下, 6 d后统计幼虫的死亡率。
1.4 田间农艺性状评价
为了评价回交后代的农艺性状, 我们将 BCnF3
816 作 物 学 报 第 38卷

纯合株系及其亲本种植在位于中国武汉的华中农业
大学试验农场内。试验材料分为独立的 3 组, 每组
材料包括 MH63, 一个供体亲本和对应的 BC1F3、
BC2F3和 BC3F3纯合株系。水稻种子于 5 月 30 日播
在苗床上, 7月 1日移栽到大田中。每组的 5种材料
在田间按随机区组排列, 3个重复。每个小区种植 2
行, 共 24个单株, 株距 20.0 cm, 行距 26.7 cm。整
个试验小区周围种植 4行非转基因的水稻植株。
在水稻的整个生育期喷洒针对鳞翅目害虫的杀
虫剂, 保护所有植株免受危害。水稻成熟后收获每个
小区中间的 20个单株考察株高、穗长、有效穗数、每
穗实粒数、结实率、千粒重和单株产量。用 SPSS 12.0
(SPSS, Chicago, USA)软件进行考种数据的统计分析,
用 LSD法来检验各材料之间性状差异的显著性。
2 结果与分析
2.1 纯合株系的筛选
转基因阳性的种子能在含有 Basta的 1/2 MS培
养基上正常发芽, 阴性种子的生长则受到抑制。理
论上, 阴性株系、杂合株系和纯合株系的发芽率分
别约为 0、75%和 100%。以此为标准, 我们从 3 个
供体亲本的每代回交后代中都筛选到多个 BCnF3纯
合株系(图 1)。这些姊妹株系来自于不同的 BCnF1单
株, 一起用于后续的室内和田间试验。不同供体亲
本的回交后代在这里分别被命名为 BCnF3 (1Ac)、
BCnF3 (1C)和 BCnF3 (2A)。

图 1 BCnF3 (n = 1, 2, 3)株系在发芽试验中的 Basta 抗性
Fig. 1 Basta-resistance of BCnF3 (n = 1, 2, 3) lines in germination assay
A: 纯合株系; B: 杂合株系; C: 阴性株系。A: homozygous line; B: heterozygous line; C: negative line.

2.2 田间和室内的抗虫性
回交后代在田间对卷叶螟表现出 2种抗性水平,
敏感植株出现大量带有白色条斑的卷叶, 受害严重;
而另一部分为转基因阳性植株, 它们表现出高水平
的抗性, 完全没有受到危害(图 2-A)。在室内接虫试
验中, MH63的茎杆受危害严重, 其中的幼虫死亡率
仅为 21.7%, 有的已发育至二龄。与之相反, 取食各
代 BCnF3纯合株系以及抗性对照亲本的幼虫死亡率
均为 100% (图 2-B)。这些结果说明回交的转基因后
代对钻心虫和卷叶螟保持良好的抗性。
2.3 田间的农艺性状
在第 I组中, 1Ac-1的株高为 101.2 cm, 显著矮
于 MH63。3 个 BCnF3 (1Ac)株系显著高于它们的供
体亲本, 与原始品种之间没有显著差异。在产量组
成性状方面, BC2F3 (1Ac)和 BC3F3 (1Ac)拥有更多的
有效穗数, 但是每穗实粒数较少, 最终它们的单株
产量明显高于 1Ac-1, 达到与 MH63 相当的水平
(表 1)。
在第 II 组中 , 1C-19 也显著矮于 MH63, 而
BC1F3 (1C)则高得多。虽然 BC2F3 (1C)和 BC3F3 (1C)
的株高接近了轮回亲本, 但是另一个形态学性状穗
长经过回交没有得到恢复。3个 BCnF3 (1C)株系的每
穗实粒数都比 1C-19 多, 其中 BC3F3 (1C)的单株产
量达到了与 MH63相当的水平(表 1)。
在第 III组中, 2A-1在穗长、每穗实粒数和单株
产量上的表现都比原始品种差。回交至 BC3F3代, 这
些性状的差异都被消除了, 单株产量甚至比原始品
种略有提高(表 1)。
3 讨论
MH63 以 bar 基因作为选择标记的农杆菌介导
的遗传转化须要经历长时间的组织培育过程。组织
第 5期 杨 宙等: 连续回交对消除农杆菌介导转化引起水稻体细胞变异的影响 817



图 2 回交后代对三化螟(A)和卷叶螟(B)的抗性
Fig. 2 Resistance of backcross progeny against leaffolder (A) and stemborer (B)
NC: 阴性对照; BC: 回交后代。NC: negative control; BC: backcross progeny.

表 1 回交株系和亲本的农艺性状(湖北武汉)
Table 1 Agronomic performance of backcross lines and their parents (Wuhan, Hubei)
组
Group
株系
Line
株高
Plant height
(cm)
穗长
Panicle length
(cm)
有效穗数
Panicles
per plant
每穗实粒数
Grains per
panicle
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weight (g)
单株产量
Yield per
plant (g)
MH63 103.4 ab 25.4 b 15.1 b 133.9 a 88.7 a 27.4 b 49.4 a
1Ac-1 101.2 c 25.5 b 14.6 b 118.4 bc 89.4 a 28.3 a 45.2 b
BC1F3(1Ac) 104.4 a 26.5 a 14.8 b 121.4 b 86.4 b 27.1 b 43.6 b
BC2F3(1Ac) 103.6 a 24.8 b 16.7 a 109.8 c 89.8 a 28.6 a 48.0 a
I
BC3F3(1Ac) 101.9 bc 25.7 b 16.4 a 109.6 c 89.5 a 28.9 a 48.7 a

MH63 104.7 b 26.3 a 14.9 a 123.4 a 90.5 a 29.0 c 50.2 a
1C-19 101.0 c 25.0 c 14.7 a 107.3 b 90.2 a 32.0 a 45.4 b
BC1F3(1C) 108.9 a 25.6 bc 14.9 a 129.5 a 90.1 a 26.9 d 46.0 b
BC2F3(1C) 105.2 b 26.1 ab 14.8 a 125.9 a 90.3 a 29.2 c 47.2 b
II
BC3F3(1C) 102.4 bc 25.5 c 14.8 a 126.3 a 89.2 a 30.9 b 50.8 a

MH63 105.0 a 25.9 a 14.7 a 125.4 a 91.0 a 28.8 ab 47.4 ab
2A-1 105.4 a 25.0 c 13.6 a 116.9 b 88.8 a 29.5 a 42.2 c
BC1F3(2A) 105.1 a 25.7 ab 14.1 a 122.8 a 88.3 a 28.8 ab 44.8 bc
BC2F3(2A) 105.7 a 25.5 b 14.5 a 120.5 a 88.5 a 28.8 ab 45.9 ab
III
BC3F3(2A) 105.7 a 25.7 ab 15.5 a 119.7 a 88.6 a 28.6 b 48.8 a
同一栏中数据后相同字母的数值之间无显著差异(P<0.05)。
Values followed by the same letter in a column are not significantly different at P<0.05.

培养总是伴随着体细胞变异, 因此组织培养时间越
长 , 体细胞变异的频率越高 [24]。1Ac-1、1C-19 和
2A-1是来自于MH63的 3个用于水稻抗虫育种的株
系 , 但是出现了一些产量性状和形态学性状的变
异。在我们的研究中, 所有转基因株系的产量随着
回交逐渐增加, BC3F3株系的大部分农艺性状变得与
MH63 没有差异。这些结果表明连续回交能够在很
大程度上消除体细胞变异, 恢复转基因植株的农艺
性状。
如果这一策略成功地应用于作物育种, 更多的
818 作 物 学 报 第 38卷

T0 代转基因植株就可以成为候选材料, 极大地减少
转化所需的工作量和成本。种子提纯也是一种常规
的育种方法, 但是所需的群体规模较大。体细胞变
异存在于水稻的整个基因组, 因此, 单独使用提纯
法只能消除部分的变异。
3个株系中的 Bt基因都是由玉米(Zea mays L.)的
ubiquitin 启动子驱动的, 具有较高的表达量[19-21]。外
源基因的产物会对植物产生多效性, 如引起结构特
点和代谢途径的改变[25-26]。张敏等[27]还证明导入的
Bt基因影响了棉花(Gossypium hirsutum L.)植株对钾
离子的吸收和转运能力。目前虽然没有关于 Bt 蛋白
对水稻植株产生负面效应的报道, 但我们仍然不能
确定转基因水稻植株的变异与 Bt基因表达无关。
在构建转化的表达载体时, 最好用时空、组织
特异型或诱导型的启动子来驱动 Bt基因表达, 减少
因 Bt 蛋白持续产生和浓度过高而引起植株变异的
可能性, 还能够减弱对昆虫的选择压, 延缓其对 Bt
作物抗性的发展[28]。在之前的研究中, 由绿色组织
特异的 rbcS 启动子控制的 cry1C 基因被转入水稻,
获得了 6 个转基因纯合株系, 其中 Cry1C 蛋白含量
最低的株系农艺性状的变异最少[29]。
我们已经分离了这些 T-DNA 插入位点的侧翼
序列, 没有发现有内源基因失活(数据未发表)。这 3
个株系中的 Bt蛋白含量不同, 其中 2A-1的 Bt蛋白
浓度比 1Ac-1 和 1C-19 高得多[19-21]。但是, 2A-1的
表型变异还是很少, 说明这 3个株系的表型变异主要
是体细胞变异引起的, Bt蛋白的多效性没有表现得很
明显。
BCnF3 之前的各代回交群体都包括抗虫和敏感
两种表型的植株, 来自 BCnF3 纯合株系的所有单株
与供体亲本一样, 都对三化螟具有抗性。这些结果
与以前的报道一致, 说明外源基因能够在回交后代
中稳定地遗传和表达[19,30]。
BC3F3 株系的某些性状与原品种仍然存在差异,
如 BC3F3(1Ac)的有效穗数、每穗实粒数和 BC3F3(1C)
的穗长。这些缺陷说明回交方法不能完全消除体细
胞变异, 特别是当重要的体细胞变异正好与 T-DNA
插入位点紧密连锁时。
4 结论
将转基因技术与常规育种方法结合, 培育的 3
个 BC3F3转基因株系的遗传背景与MH63基本一致,
农艺性状良好, 还对鳞翅目害虫和除草剂表现出抗
性, 在水稻生产中具有广泛应用的潜力。
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