全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1188−1192 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30671166)
作者简介: 孔芳(1973–), 女, 博士研究生。
*
通讯作者(Corresponding author): 王幼平, 男, 博士生导师, 教授, 主要从事油菜遗传和生物技术育种研究。Tel: 0514-87997303;
E-mail: wangyp@yzu.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-11-23; Accepted(接受日期): 2008-02-01.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01188
利用原位杂交及 CAPS标记分析芸薹属 A、B和 C基因组间的关系
孔 芳 蒋金金 吴 磊 王幼平*
(扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009)
摘 要: 以来源于 Brassica rapa基因组(AA)的重复序列(151 bp)为探针, 分别同二倍体白菜型油菜(AA, 2n=20)、甘蓝
(CC, 2n=18)和异源四倍体芥菜型油菜(AABB, 2n=36)的中期染色体杂交, 白菜型油菜和甘蓝的所有染色体上都有杂
交信号, 芥菜型油菜的染色体上显示出 20个明显的信号, 其余染色体上信号很弱或无, 可以区分出 A和 B基因组。
对来源于油菜 3个基本种与 3个复合种 FAE1基因进行 CAPS分析表明, 3个基本种表现出不同的酶切式样, 用 Mbo I
和 Msp I 酶切表现出多态性, 基因组 A 和 C 非常相似, 而基因组 B 与 A、C 关系较远, 同时 3 个复合种也并不是 2
个基本种的简单相加, 表明异源四倍体在长期进化过程中可能发生了重排和重组。
关键词: 芸薹属; 荧光原位杂交; 重复序列; CAPS标记; 亲缘关系
Relationships among Genome A, B, and C Revealed by FISH and CAPS
KONG Fang, JIANG Jin-Jin, WU Lei, and WANG You-Ping*
(College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China)
Abstract: Physical localization of repetitive DNA sequence from genome A (151 bp) was carried out on the chromosomes of the
selected Brassica species by FISH (fluorescence in situ hybridization). The signals distributed on all the chromosomes of A
(Brassica rapa, 2n=20) or C genome (B. oleracea, 2n=18). For B. juncea (AABB, 2n=36), the signals were found on all the
chromosomes of genome A and the strength of signal varied among different chromosomes, while the chromosomes of genome B
showed weak or no signals. FAE1 gene is a rate-limiting gene for erucic acid synthesis in Brassica. The genes from six Brassica
species of U-triangule were cloned by PCR. These PCR products were digested with different restriction endonucleases. Mbo I
and Msp I were found to produce informative CAPS patterns of FAE1 gene. Three diploids displayed different patterns, the pat-
terns of genome A was very similar to that of genome C, while the patterns of genome B was the most diverged out of the patterns
of the A and C genomes. Three amphidiploids generally exhibited additive patterns of the progenitors, but not strictly in all cases,
indicating that rearrangements and recombinations did occur in the formation and evolution of amphidiploids. Genetic relation-
ships among Brassica species could be demonstrated through CAPS analysis of FAE1 gene and FISH method when repetitive
DNA sequence (not ribosomal RNA genes) was used as a probe.
Keywords: Brassica; Fluorescence in situ hybridization (FISH); Repetitive DNA sequence; Cleaved amplified polymorphic se-
quences (CAPS); Relationship
芸薹属(Brassica)是十字花科植物中较大且具有
重要经济价值的属。组成芸薹属 3个二倍体种(白菜
型油菜, B. rapa, 2n=20, AA; 黑芥, B. nigra, 2n=16,
BB; 甘蓝, B. oleracea, 2n=18, CC)和 3个异源四倍
体种(甘蓝型油菜, B. napus, 2n=38, AACC; 芥菜型
油菜, B. juncea, 2n=36, AABB; 埃塞俄比亚芥, B.
carinata, 2n=34, BBCC)之间的关系被称之为禹氏三
角[1]。大量的实验也表明, 3个异源四倍体物种分别
由各自不同二倍体种相互杂交通过自然选择后进化
而来[2-5]。
已有报道通过原位杂交方法研究上述 6 个种间
的亲缘关系。李宗芸等[6]以 C 基因组 DNA 为探针,
对芸薹属 5 个种进行基因组原位杂交(genomic in
situ hybridization, GISH), 结果 A、C基因组不能被
第 7期 孔 芳等: 利用原位杂交及 CAPS标记分析芸薹属 A、B和 C基因组间的关系 1189


区分开, 但 B 基因组可以和 A、C 基因组区分。
Hasterok等[7]用 5S rDNA和 45S rDNA作探针, 发现
3 个异源四倍体种中的 rDNA 位点并不是各自二倍
体种简单相加。Lim等[8]利用 45S rDNA和 5S rDNA
并结合两种不同着丝粒重复序列(CentBr1, CentBr2,
176 bp)作探针, 对 B. rapa的所有 10条染色体进行
区分, 并发现重复序列主要分布在着丝粒区域, 同
时在染色体臂上也有很少的结(knob)。
通过分子标记方法研究芸薹属不同种基因组之
间关系表明, 芸薹属基因组进化过程中可能发生了
染色体融合或裂变, 导致染色体数目的变化, 同时
也可能伴随着大片段染色体的易位和倒位[2,9-12]。酶
切扩增多态性序列(CAPS)是将特异引物 PCR 与限
制性酶切相结合而产生的一种DNA标记技术, 已被
广泛用于植物的突变检测[13], 新分子标记开发[14]、
分子标记辅助育种[15]、遗传作图[16-17]和基于图谱的
基因克隆[18]。脂肪酸延长酶基因(FAE1)是调控油菜
芥酸合成的关键基因 , James 等 [19]率先从拟南芥
(Arabidopsis)中克隆出 FAE1基因并在多种芸薹属物
种中克隆。本文从芸薹属 6种植物中克隆 FAE1基因,
通过 CAPS 分析, 并结合着丝粒重复序列作探针进
行原位杂交, 来研究油菜基因组 A、B 和 C 之间的
相互关系。
1 材料与方法
1.1 植物材料
白菜型油菜(Brassica rapa var. chinensis L. AA,
2n=20), 甘蓝(B. oleracea var. botrytis L. CC, 2n=18),
黑芥[B. nigra (L.) Koch BB, 2n=16], 甘蓝型油菜(B.
napus L. “国审油 2004026”, AACC, 2n=38), 埃塞俄
比亚芥(B. carinata A. Br., BBCC, 2n=34) 和芥菜型
油菜 [B. juncea (L.) Czern., “胜利油菜 ”, AABB,
2n=36]种子由江苏里下河农科所提供。
1.2 试验方法
1.2.1 染色体制片 种子放在湿润滤纸上 25℃下
发芽, 待根长 2~3 cm时经 2 mmol L−1的 8-羟基喹啉
25℃处理 2 h, 再 10℃处理 2 h。根尖用乙醇-冰醋酸
(3 1)∶ 固定液固定 24 h, 若暂时不处理, 可换至 70%
的乙醇溶液中保存。制片前先用蒸馏水冲洗根尖 2~3
次 , 洗去残留的固定液。用 2%(W/V)纤维素酶
(cellulase), 20%(V/V)果胶酶(pectinase)混合酶液处理
根尖 2 h(37 )℃ ; 接着用 75 mmol L−1 KCl低渗溶液处
理 45 min, 取单个的根尖置预冷载玻片上 , 后用
60%冰醋酸去除细胞质; 最后用预冷的固定液进行
展开, 晾干。于 37℃放 15 min后用。Olympus相差
显微镜镜检, 选出染色体分散良好的载玻片。因油
菜的染色体较小(1.5~4.5 μm), 两臂的重复序列较少,
通常我们选用较长的前中期染色体作为研究对象。
1.2.2 基因组 DNA的提取 取上述 6种植物的幼
叶 1~2 g ,于研钵中用液氮速冻, 迅速研磨。采用
CTAB法[20]提取叶片总 DNA, 并保存于 50 μL TE溶
液中, 并用分光光度计进行定量, 稀释到 10 ng μL−1。
1.2.3 探针的制备 根据 GenBank(CW978699)
设计引物 5′-ATCCTGGTTTGATTGGAACG-3′, 5′
-TGGATACATAAAGTGGTGGAGAA-3′。以 B. rapa
基因组 DNA 为模板, 20 μL 体系含 1 mmol L−1
MgCl2、1 U Taq酶(Hotstar)、800 μmol L−1 dNTP、
0.2 μmol L−1引物、模板DNA 10 ng。反应程序为 95℃
变性 15 min; 94℃变性 45 s, 50℃退火 1 min, 72℃延
伸 45 s, 30个循环; 72℃延伸 10 min。
重复序列探针采用 DIG-11-dUTP经缺口平移法
标记 , 按照试剂盒 (Catalogue No. 11745816910,
Roche, 瑞士)说明进行, Mix 10 μL, 蒸馏水 20 μL,
PCR产物 20 μL, 15 , 2 h℃ 。
1.2.4 原位杂交 染色体制片上加 200 μL去离子
甲酰胺(formamide deionized), 80℃变性 3 min; 接着
用乙醇梯度脱水 70%、90%和 100%(V/V), 空气晾干;
每张制片 30~40 μL 杂交液[50%(V/V)去离子甲酰胺,
10%(W/V)硫酸葡聚糖, 10 μL标记的探针, 0.5 μL变性
鲑鱼精子 DNA和 5 μL 20×SSC]。加盖玻片, 封片。
80℃变性 10 min; 在保湿盒中 37℃杂交过夜; 杂交后
制片经 2×SSC, 0.4×SSC在 40℃条件下冲洗各 2次。
1.2.5 信号检测和图像处理 按照试剂盒
(Catalogue No. 11745816910, Roche, 瑞士)说明进行
杂交信号的放大和标记。然后每张制片用 10 μL PI
(propidium iodide)复染。使用 Olympus BX51荧光显
微镜观察染色体和杂交信号, 每个材料至少观察 5
个细胞, 对于分散较好的细胞加不同的滤光片进行
拍照, 用 Image-Pro Plus Version 5.0软件进行图片合
成和处理。
1.2.6 FAE1基因的克隆和 CAPS分析 从 6种材
料中克隆 FAE1基因, 根据 Gupta等[21]提供的序列设
计引物, PCR总体积为 20 μL, 含 10 ng基因组DNA、
2.5 mmol L−1 MgCl2、0.2 mmol L−1 dNTP、0.2 μmol
L−1引物、1 U Taq酶(Hotstar)。PCR扩增程序为 95℃
变性 15 min; 94℃变性 30 s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸
1190 作 物 学 报 第 34卷

45 s, 35个循环; 72℃延伸 10 min, 10℃保存。PCR产
物经 7种不同的限制性核酸内切酶(Alu I, Hpa I, Hinf
I, Mbo I, Mse I, Msp I, Taq I)于 37℃条件下酶切 2~3
h, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳 2~3 h/20 W, 银染。
2 结果与分析
2.1 原位杂交分析
来源于 B. rapa基因组的重复序列(151 bp)的杂交
信号分布如图 1, 杂交信号在二倍体种 B. rapa (AA)
和 B. oleracea(CC)上所有染色体上均有分布, 但主
要分布在染色体的着丝粒部位; 对于异源四倍体种
芥菜型油菜 B. juncea(AABB), A 基因组的染色体上
均有杂交信号, 分布在(近)着丝粒区域, 信号强度在
不同的染色体上不同, B 基因组染色体上的杂交信
号弱或无。
2.2 FAE1基因的克隆和 CAPS分析
所试 6个种 PCR产物均可扩增出约 1 500 bp的
产物(图 2-A), 当这些 PCR 产物经过不同的限制性
核酸内切酶单酶切后, 在 7 种供试酶中, 均表现出
不同的多态性。如图 2-B所示, Mbo I消化后基因组
B 总共出现 4 条带, 基因组 A 和 C 出现 5 条带, 而
且基因组 A与 C的带型一致。3个双二倍体种中, 它
们的带型效果一般来说是祖先种各自的 CAPS 标记
多态性的叠加, 例如 AABB分别是基因组 AA与 BB
的 CAPS多态性的叠加。但是 BBCC和 AACC却不
是基因组条带的简单叠加, 它出现了一条新的特异



图 1 重复序列作探针和 3种不同油菜杂交结果
Fig. 1 FISH analysis to mitotic chromosomes of three different Brassica species when repetitive sequence used as a probe
A: 白菜型油菜(AA); B: 甘蓝(CC); C: 芥菜型油菜(AABB)。探针用地高辛标记, 黄色; 染色体用 PI负染, 红色。
A: B. rapa (AA, 2n=20); B: B. oleracea (CC, 2n=18); C: B. juncea (AABB, 2n=36).
The chromosomes were counterstained by PI in red, and probe was labeled by anti-mouse-Ig-DIG in yellow. Bar=3 μm.



图 2 6个种 FAE1基因的 CAPS分析
Fig. 2 CAPS analysis of FAE1 genes in six Brassica species
A: PCR产物; B: Mbo I酶切 PCR产物; C: Msp I酶切 PCR产物
(箭头示新的条带)
A: PCR products; B: PCR products digested with Mbo I; C: PCR
products digested with Msp I (novel band indicated by arrow)
BB: B. nigra; CC: B. oleracea; AA: B. rapa; BBCC: B. carinata;
AABB: B. juncea; AACC: B. napus; M: molecular weight marker.
性条带(如箭头所示)。PCR产物经 Msp I消化后, 表
现出不同的限制性片段模式(图 2-C), AA与 CC出现
同样的带型, BB有 2条完全不同于 AA、CC的片段,
双二倍体中总体来说还是出现祖先种条带的总和 ,
但 AACC出现了 1条新带, 而在 AA、CC中却无(如
箭头所示); AABB 和 BBCC 带型相似, 只出现 1 条
位置不同于它们祖先种的条带。表 1 是 4 种内切酶
CAPS统计分析结果。
3 讨论
用 A 基因组的重复序列作探针 , 杂交信号在
A 、C基因组所有染色体上均有分布, B基因组染色
体上的杂交信号弱或无。这说明在长期的进化过程
中, 甘蓝与白菜型油菜的亲缘关系较近, 基因组的
分化程度较小, 而甘蓝与黑芥的亲缘关系较远, 基
因组的分化程度高。在实验中 AABB用该探针就可
第 7期 孔 芳等: 利用原位杂交及 CAPS标记分析芸薹属 A、B和 C基因组间的关系 1191


以将 A和 B基因组分开, 这也进一步表明 B基因组
与 A、C 关系较远。还未见用基因组重复序列(除
rDNA 外)作探针来研究 A、B 和 C 基因组亲缘关系
的报道。目前我们正在寻找更多的重复序列, 特别
是能够和染色体对应的分子标记相结合开展芸薹属
基因组间的相互关系研究。
芸薹属 6个种的 FAE1基因的 CAPS分析的条带
不同, 即酶切位点不同, 说明不同品种中 FAE1的核
苷酸序列不同。FAE1基因是芥酸(C22:1)形成过程中
一种关键酶基因, Das 等[22]研究发现甘蓝型油菜的
FAE1有两个不同等位基因位点, 芥酸含量由种胚基
因型控制, 一个在A基因组, 另一个在C基因组, 呈
加性遗传。本研究也表明 A、B、C基因组具有不同
序列的 FAE1 基因, 同时异源四倍体中存在不同的
等位基因位点。在异源四倍体中发现有新的条带出
现, 即出现了新的酶切位点, 这表明在四倍体的形
成过程中, 来自于 A、B或 C基因组的 FAE1基因发
生了结构的重组或突变。CAPS方法实际反映出来的
是该基因序列的变化, 该方法简单而且稳定, 可以
快速而且直观地对 A、B 和 C 基因组间的相互关系
进行区分和鉴定。
利用芸薹属 6个种的 FAE1基因的 CAPS分析能
清楚、直观地区别基因组 A、B和 C, 以及这 6个种
之间的相互关系, 结合原位杂交更进一步验证了基
因组 A、C 亲缘关系近, 与 B 关系远的结论, 这与
Song 等[2]对 3 个基本种的核基因组, 线粒体和叶绿
体的 RFLP 图谱的比较研究结果一致, 认为二倍体
基本种可能起源于一个祖先的两个分支 , 即 B.
rapa、B. oleracea 分支和 B. nigra 分支。本研究中
CAPS 分析结果还发现异源四倍体的带型是它们祖
先种的带数总和 , 但也出现不同于祖先种的新带 ,
表明在异源四倍体形成过程中可能发生了结构性重
排或基因组间的重组。为了克服核质基因组间不利
的相互作用, 促进新物种的形成, 有些染色体变化
在杂交后迅速产生, 因此在多倍体化的过程中, 基
因组内和基因组间的重新组织是广泛存在的[23-24]。
从表 1也可以看出, 在 3个异源四倍体中, AABB所
形成的带均是双亲二倍体带的总和, 没有出现新的
条带, 而 AACC出现新的条带的次数最多, BBCC次
之。是不是意味着 AACC在形成过程中 A和 C基因
组间发生更多的重组和重排, 目前我们正在对人工
合成的 AACC减数分裂染色体形为进行研究。

表 1 6种芸薹属植物 FAE1基因的 CAPS分析
Table 1 CAPS analysis of FAE1 genes in six Brassica species
限制性内切酶
Restriction endonuclease
带式样
Band pattern
黑芥
B. nigra
甘蓝
B. oleracea
白菜型油菜
B. rapa
埃塞俄比亚芥
B. carinata
芥菜型油菜
B. juncea
甘蓝型油菜
B. napus
总带数
Total bands
4 5 5 7 6 6

Mbo I
新带数
Novel bands*
— — — 1 — 1

总带数
Total bands
3 5 5 8 8 6

Msp I
新带数
Novel bands
— — — — — 1

总带数
Total bands
6 7 8 12 11 10

Alu I
新带数
Novel bands
— — — 1 — —

总带数
Total bands
9 10 10 13 13 11

Hpa I
新带数
Novel bands
— — — — — 1
*：与二倍体进行比较。*: compared with both diploid progenitors.

4 结论
组成芸薹属 3 个基本种和 3 个复合种之间的亲
缘关系不仅可以通过多种分子标记方法加以阐述 ,
而且也可以用重复序列(包括核糖体 RNA基因)作探
针, 通过分子细胞遗传学的方法对基因组 A、B和 C
之间的关系进行研究。A和 C具有很高的同源性, 如
果能够寻找到更多的特异性重复序列, 结合分子标
记对 A 和 C 基因组染色体加以区分, 对油菜基因组
学, 芸薹属物种的形成和进化, 油菜的育种和种质
1192 作 物 学 报 第 34卷

创新等研究均具有重要的意义。
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