全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(12): 21742179 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30771362 和 30800692)，教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(200803071018)，江苏省自然科学基
金项目(BK2008334)和南京农业大学青年创新基金项目(KJ08002)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 喻德跃, E-mail: dyyu@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: fhuang@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2009-04-23; Accepted(接受日期): 2009-07-21.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.02174
大豆 GmTINY1基因的克隆与表达分析
黄 方 何 慧 迟英俊 盖钧镒 喻德跃*
南京农业大学国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 采用基因芯片技术, 从大豆中鉴定了一个荚优势表达基因。利用生物信息学的方法, 拼接了该基因的全长序
列, 并通过 RT-PCR 克隆了该基因。Blast 检索分析表明, 该基因编码一个具有 AP2 结构域的转录因子, 且与拟南芥
DREB类蛋白 TINY的氨基酸相似度最高, 将该基因命名为 GmTINY1。GmTINY1包含一个 735 bp的开放阅读框, 编
码 244 个氨基酸残基。GmTINY1 与拟南芥 TINY 和 TINY2 蛋白的相似度分别为 59%与 62%。系统发生分析表明,
GmTINY1、TINY和 TINY2位于一个分支, 且同属于 DREB亚家族。实时定量 RT-PCR检测表明, GmTINY1基因在
荚中高丰度表达, 在花中的表达量也较高, 在根中的表达量较低, 而在叶片中未检测到表达。基因芯片信息分析结果
表明, GmTINY1在种子发育的子叶期的种脐部分高丰度表达。由此推论, GmTINY1基因在大豆生殖器官发育中可能发
挥调控作用, 可能与种子发育过程中种脐的形成有关。
关键词: 大豆；转录因子；AP2；TINY；DREB
Cloning and Characterization of GmTINY1 Gene in Soybean (Glycine
max)
HUANG Fang, HE Hui, CHI Ying-Jun, GAI Jun-Yi, and YU De-Yue*
National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural Univer-
sity, Nanjing 210095, China
Abstract: Plant reproductive development involves the coordination of a lot of genes encoding transcription factors. The AP2
domain transcription factors have been proved with critical roles in plant reproductive development. By microarray analysis, we
identified a gene which showed higher expression in pod as 500 folds as that in leaf of soybean. The Blast searches indicated this
gene encodes a dehydration responsive element binding protein (DREB)-like protein showing highest similarity to Arabidopsis
TINY, therefore named as GmTINY1. By searching soybean genome and EST databases, the putative full-length cDNA sequence
for GmTINY1 was in silico assembled. The GmTINY1 gene was cloned from soybean seeds at 15 DAF (days after flowering) by
RT-PCR. GmTINY1 contained a complete open reading frame (ORF) of 755 bp which encoded a peptide of 244 amino acids. The
predicted molecular mass and isoelctric point of GmTINY1 are 26.76 kD and 5.12, respectively. An AP2 domain and a Ser-rich
domain were identified in GmTINY1 amino acid sequence by Motif Scan server. The GmTINY1 encoding product showed 59%
and 62% sequence similarities with Arabidopsis TINY and TINY2, respectively. Multiple sequences alignment revealed that a
highly conserved AP2 domain was present in each AP2 domain transcription factor. In this AP2 domain, it was found that a Ser66
was specifically present in GmTINY1, DREB1B, TINY and TINY2 proteins but a Cys66 in DREB1A and DREB1C proteins, in-
dicating, like Arabidopsis TINY, TINY2 and DREB1B, GmTINY1 might be able to bind both the dehydration responsive ele-
ment(DRE) and ethylene responsive element (ERE) motifs while DREB1A and DREB1C only bind DRE motif. Besides, it was
found that a Ser-rich domain probably involving translational modification on GmTINY1 protein was located close to AP2 do-
main. The neighbor-joining phylogenetic tree showed that the AP2 domain transcription factors were grouped into four subfami-
lies: DREB, ERF, AP2, and RAV; and GmTINY1, TINY, and TINY2 were grouped into a branch which attributed to the DREB
subfamily. With an attempt to understand the biological role for GmTINY1 and to verify the microarray result, we used the
Real-time quantitative PCR approach to analyze the expression pattern of GmTINY1 in various soybean organs. We found that
expression of GmTINY1 was the highest in pod, relatively lower in flower and root, but undetectable in leaf, indicating that
GmTINY1 may play some roles in soybean reproductive organs and root, but not in leaf. The Blast search results against soybean
第 12期 黄 方等: 大豆 GmTINY1基因的克隆与表达分析 2175
EST database also supported the specific expression of GmTINY1 in soybean pod and root. We analyzed GmTINY1 expression
during the course of seed development based on publicly available microarray data and found that GmTINY1 was expressed with a
low level at the globular stage and heart stage but highly expressed in hilum at the cotyledon stage embryos. Taken together, it is
suggested that GmTINY1 may play some regulatory role in soybean reproductive development, such as the formation of hilum in
soybean.
Keywords: Soybean; Transcription factor; AP2; TINY; DREB
植物生殖器官的发育是一个非常复杂的、由多
基因协调控制的过程。目前的研究表明植物中多种
转录因子参与了生殖器官的发育过程, 如 MADS-
box转录因子, AP2类转录因子、锌指蛋白等。植物
AP2 类转录因子得名于花发育过程中起重要作用的
转录因子基因 AP2[1-2]。植物 AP2类转录因子具有众
多的家族成员, 根据其结构和功能可分为 5 个亚家
族, 如 AP2 亚家族, 含有 2 个 AP2 结构域, 在植物
的生殖发育过程中发挥着重要作用；RAV 亚家族,
含有 AP2和 B3 2个不同的 DNA结合结构；DREB
亚家族, 含有 1 个 AP2 结构域, 与植物的抗逆反应
密切相关；ERF 亚家族, 含有 1 个 AP2 结构, 作为
乙烯响应因子参与了植物的抗病反应等多种生命活
动[3-4]。然而有些 AP2类转录因子同时参与了植物的
抗逆反应以及生殖器官的发育过程 , 比如拟南芥
DREB 亚家族成员 TINY, 不仅通过脱水应答元件参
与了拟南芥的抗逆反应 , 也通过控制细胞的大小 ,
控制花丝和雌蕊的长度[5-6]。
目前对植物生殖器官发育分子机制的研究多集
中在拟南芥等模式植物和一些园艺植物中, 对于农
作物也多集中在单子叶植物, 如水稻, 而对豆科植
物的研究很少。但豆科植物在世界范围内的农业重
要性仅次于禾本科作物。大豆作为重要的豆科植物,
其高蛋白、高油含量一直在人类和动物的营养中占
有特殊而重要的地位, 而有关其生殖器官发育的分
子基础研究还相对滞后。大规模基因芯片分析技术
加速了大豆生殖器官发育的分子生物学研究。
Haerizadeh 等[7]利用基因芯片技术分析了大豆花粉
的转录组, 表明 7.87%的大豆基因在花粉中优势表
达。本实验室通过基因芯片技术分析了大豆荚的转
录组, 揭示 2.30%的大豆基因在荚中优势表达(未发
表资料)。本研究通过基因芯片技术结合 RT-PCR, 分
离了一个大豆荚优势表达的拟南芥 TINY 转录因子
同源基因 GmTINY1。检测了 GmTINY1 基因在根、
叶、花以及荚中的表达, 并分析了该基因在大豆种
子发育过程中的表达特征。
1 材料与方法
1.1 试验设计
大豆[Glycine max (L.) Merr.]品种 Jackson由南
京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供,
于正常季节种植于南京农业大学网室。参考 Huang
等的方法[8], 种植和收获试验材料。分别收集大豆六
复叶期的根和叶, 大豆盛花期(R1)花和花芽的混合
物, 大豆初荚期(R3)的荚立即以液氮速冻, 于–80℃
冰箱中保存备用。
1.2 RNA提取与 cDNA第一链合成
采用 Trizol试剂(Invitrogen, USA)提取大豆不同
组织总 RNA, 经过 DNase I (TaKaRa, 大连)处理后
进行 cDNA第一链的合成(Promega, USA)。
1.3 GmTINY1基因的克隆
利用大豆基因芯片探针 GmaAffx.18649.1.S1_at
的核苷酸序列搜索大豆基因组数据库(http://www.
phytozome.net/soybean)。将匹配的基因组序列利用
FGENESH 程序(http://www.softberry.com/)进行开放
阅读框的预测。以预测产物为探针, 搜索大豆 dbEST
数据库, 验证预测的准确性。最后利用 BioXM(Ver.
2.6)设计覆盖完整开放阅读框的引物序列 GmT5:
5-ATGAGAGTTTCCACCCAGAA-3, GmT3: 5-T
CAGTAGTCCCACAGAAAAC-3。利用大豆开花后
15 d的嫩种子 cDNA为模板进行 PCR扩增, 程序为
95℃变性 4 min, 94℃变性 50 s , 56℃复性 50 s, 72℃
延伸 1 min, 共计 30个循环, 最后 72℃延伸 10 min。
PCR 产物经胶回收后连接至 pGEM-T 载体, 进行序
列测定。
1.4 实时定量 RT-PCR
以大豆组成型表达 Actin基因(GenBank登录号为
V00450)为内部参照, 参考Huang等[9]的步骤进行实时
定量 RT-PCR。通过比较 CT的方法进行基因表达水平
的相对定量分析。以 GmTINY1基因为目标基因(target
gene), 它在花、根和荚中相对于叶组织的相对表达量
fold change = 2–△△CT, 此处∆∆CT = (CT, GmTINY1 – CT, actin)
flower or root or pod – (CT, GmTINY1 – CT, actin)leaf。
1.5 GmTINY1基因表达的基因芯片分析
利用已经公布的大豆种子发育过程中的基因芯
片数据(http://estdb.biology.ucla.edu/seed/; http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/geo), 搜索大豆 GmTINY1 基因(探
针号为 GmaAffx.18649.1.S1_at)在大豆发育 3个阶段
(球形胚期、心形胚期和子叶期)中的基因表达数据。
2176 作 物 学 报 第 35卷
1.6 生物信息学分析
GmTINY 蛋白的分子量和等电点由 BioXM 程序
(Ver. 2.6, http://home.njau.edu.cn/~bioxm)预测；Motif
Scan 程序(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)用于
搜寻 GmTINY1 序列中的可能基序；多序列比对由
Clustalx程序(Ver. 1.83)和 GeneDOC程序(Ver. 2.6)进
行；MEGA程序(Ver. 4.0)用地系统发生分析。
2 结果与分析
2.1 大豆 GmTINY1基因的克隆与序列分析
为了研究大豆荚的转录组组成, 通过基因芯片
技术比较大豆叶片和荚的基因表达差异并从中鉴定
了一个新的大豆 AP2 类转录因子基因(探针编号为
GmaAffx.18649.1.S1_at), 其在大豆荚的表达量为叶
的 500 倍。以该探针序列搜索已经公布的大豆基因
组数据库, 并将匹配的基因组序列通过 FEGENESH
图 1 大豆 GmTINY1基因的扩增结果
Fig.1 PCR amplified products of GmTINY1
1~2: PCR产物；M: 分子量标准 DL2000；箭头示 PCR产物条带。
12: PCR products; M: molecular marker DL2000. Arrow indicates
the PCR band.
图 2 GmTINY1与拟南芥 AP2蛋白的多序列比对
Fig. 2 Amino acid alignment of GmTINY1 with several Arabidopsis AP2 proteins
下画线处为保守的 AP2结构；星号表示 AP2结构内存在差异的位点；加框处表示 TINY蛋白特有的富含丝氨酸区。用于多序列
比对的 AP2蛋白分别为大豆 GmTINY1，拟南芥 TINY[5-6]和 TINY2[10]，拟南芥 DREB1A、DREB1B和 DREB1C[11-12]。
The AP2 domains and TINY protein-specific Ser-rich regions are underlined and boxed, respectively. The differential sites within AP2 do-
main are marked by stars. The proteins used for alignment are soybean GmTINY1, Arabidopsis TINY, TINY2[5-6], DREB1A, DREB1B, and
DREB1C[11-12].
第 12期 黄 方等: 大豆 GmTINY1基因的克隆与表达分析 2177
程序进行开放阅读框的预测。得到 1个包含 735 bp
的开放阅读框(ORF)。进一步设计 PCR 引物 GmT5
和 GmT3, 通过 RT-PCR的方法从大豆荚中克隆了包
含完整 ORF 的基因产物 (图 1), 将其命名为
GmTINY1。序列分析表明, GmTINY1 基因编码 244
个氨基酸残基, 预测分子量为 26.76 kD, 等电点为
5.12。通过 Motif Scan 程序分析 , 鉴定出了位于
51~110位的 AP2功能域以及 1个富含丝氨酸的区域
(图 2)。
2.2 多序列比对与系统发生分析
以 GmTINY1 的氨基酸序列为信息探针 , 用
Blast程序检索 GenBank的 NR数据库, 从拟南芥、
水稻、大豆、葡萄、紫花苜蓿等植物中鉴定了多个
TINY类似蛋白, 表明 TINY蛋白普遍存在于高等植
物中。将拟南芥的 2 个 TINY 蛋白 TINY[5-6]和
TINY2[10]以及 3个 DREB1蛋白 DREB1A、DREB1B
和 DREB1C[10-11]进行多序列比对, 发现 AP2 结构域
在所有比对的蛋白中高度保守, 但其他区域的氨基
酸序列相似性较低(图2)。GmTINY1 与 TINY 和
TINY2 蛋白的相似性较高, 分别为 59%与 62%；因
同属 DREB 亚家族, GmTINY1 与 DREB1 蛋白的氨
基酸相似度也达到了 41%~42%。在 TINY类蛋白中,
在 AP2 结构后面还存在 1 段富含丝氨酸的区域(图
2)。此外, 在保守的 AP2结构域内, 也存在 7个不同
的氨基酸位点(图 2)。
为了进一步研究 GmTINY1 蛋白与其他 AP2 类
蛋白的亲缘关系 , 利用 MEGA 软件 , 构建了包含
GmTINY1以及其他 AP2蛋白的系统发生树(图 3)。
将用于分析的植物AP2蛋白分为DREB亚家族、ERF
亚家族、AP2亚家族和 RAV亚家族 4类。因为 DREB
和 ERF亚家族均含有 1 个 AP2结构, 将二者并为 1
个大的分支。在 DREB亚家族中, GmTINY1与拟南
芥 TINY 和 TINY2 聚集为 1 个小的分支, 表明它们
具有有较近的亲缘关系, 这与多序列比对的结果是
一致的。
2.3 GmTINY1 基因在大豆不同器官中的表达
分析
利用实时定量 RT-PCR 技术, 检测了 GmTINY1
基因在大豆根、叶、花和荚中的 mRNA水平的表达。
结果表明, 与基因芯片分析的结果一致, GmTINY1
基因在大豆荚中的表达远高于叶片中(图 4-A和 B)。
此外 , GmTINY1 基因在大豆花中的表达量也较高 ,
但在根部的表达量较低(图 4-B)。说明 GmTINY1 基
因主要在生殖器官中发挥作用, 在根部也行使一定
的功能。
图 3 GmTINY1与其他植物 AP2蛋白的系统发生分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of GmTINY1 and other plant
species AP2 domain proteins
邻近法构建的系统发生树由MEGA程序绘制。用于系统发生树构
建的植物 AP2蛋白如下：大豆 GmDREB2[13]、GmDREB3[14]、
GmSGR[15]、GmEREBP1[16]、拟南芥 AtERF1、AtERF2[17]、AP2[1-2]、
SNZ(AT2G39250)、RAV1和 RAV2[18]。
The neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by MEGA
program. The proteins used for tree construction are soybean
GmDREB2[13], GmDREB3[14], GmSGR[15], GmEREBP1[16], Arabidopsis
AtERF1, AtERF2[17], AP2[1-2], SNZ(AT2G39250), RAV1, and RAV2[18].
2.4 GmTINY1 基因在大豆种子发育过程中的表
达分析
由于 GmTINY1基因在大豆荚中高丰度表达, 推
测其可能在种子发育的过程中发生作用。因此利用
已经公布的大豆基因芯片数据, 分析了 GmTINY1基
因在种子发育不同阶段的种子不同部位中的表达
(图 4)。结果表明 GmTINY1 基因在球形胚期和心形
胚期不同器官中的表达量都较低, 但在子叶期的种
脐部位的表达量明显高于其他组织, 表明 GmTINY1
基因在种脐的形成过程中可能发挥了一定的作用。
3 讨论
本研究从大豆中克隆了一个荚优势表达的 AP2
类转录因子基因。其编码产物与拟南芥 TINY 蛋白
相似度最高, 故被命名为 GmTINY1。多序列比对结
果表明, 在 GmTINY1 与拟南芥 TINY、TINY2 和
DREB1转录因子的AP2结构域中存在 7个显著不同
的氨基酸位点。值得注意的是, TINY、TINY2、Gm-
TINY1 和 DREB1B 的第 66 位氨基酸残基都是 Ser,
2178 作 物 学 报 第 35卷
图 4 GmTINY1基因的表达
Fig. 4 Expression analysis of GmTINY1
A: 大豆 GmTINY1基因在叶片和荚中表达的基因芯片数据; B: 以实时定量 RT-PCR技术检测大豆 GmTINY1基因在叶、根、荚
和花组织中的表达; C~E: GmTINY1基因分别在种子发育的球形胚期、心形胚期和子叶期的表达。
A: microarray data for GmTINY1 expression in soybean leaf and pod; B: Real-time RT-PCR analysis of GmTINY1 gene expression in leaf,
root, pod and flower; C–E: expression of GmTINY1 gene at globular embryos stage, heart embryos stage and cotyledon stage during seed
development, respectively.
而 DREB1A和 DREB1C的该位置氨基酸为 Cys。已
有研究结果表明 TINY, TINY2和 DREB1B都可以结
合 DRE和 ERE元件[6], 而 DREB1A和 DREB1C 只
能结合 DRE, 表明第 66位的 Ser对于 ERE元件的识
别具有重要的作用[6], 而GmTINY1也可能同时结合
DRE和 ERE元件。此外, 在 TINY蛋白的 AP2结构
域后还存在 1 个富含 Ser 的区域(图 2), 该区域可能
与 GmTINY1的翻译后修饰有关。
对于植物 TINY 转录因子的生物学功能目前还
知之甚少。在拟南芥中, 发现 TINY转录因子能够结
合脱水应答元件 DRE和乙烯应答元件 ERE, 其表达
受高盐、低温、干旱、乙烯和茉莉酸甲酯的诱导, 且
过量表达 TINY 基因的拟南芥转基因植株能够激活
启动子区域含有 DRE 或 ERE 元件的下游基因的表
达[5-6]。除了参与胁迫响应之外, 人们还发现 tiny 突
变体表现出由于细胞减小而引起的植株矮小、胚轴
缩短、雌蕊和花丝缩短、花药位置低于柱头等性
状[5]。而且施加赤霉素 GA3不能恢复 tiny 突变体的
植株高度, 表明 tiny并没有阻断赤霉素的合成[5]。已
经证实, 拟南芥 TINY能够通过控制细胞的大小, 控
制花丝、雌蕊的长度[5]。GmTINY1 除在生殖器官中
表达外还在根部表达, 但在叶片中没有检测到表达,
表明 GmTINY1基因可能在根部发挥某种功能, 比如
根部的器官发育、根部营养和水分的吸收等。拟南
芥 TINY 能够与脱水应答元件 DRE 结合, 因而推测
具类似序列特征的大豆 GmTINY1 也可能结合脱水
第 12期 黄 方等: 大豆 GmTINY1基因的克隆与表达分析 2179
应答元件 DRE, 因此 GmTINY1 也有可能在根部通
过识别 DRE元件而参与大豆的非生物胁迫应答, 但
需要进一步的研究来验证该假设。通过搜索
GenBank 的大豆 dbEST 数据库 , 发现所有支持
GmTINY1基因的大豆 EST均来自根和荚, 进一步验
证 GmTINY1 基因在生殖器官和根部表达的特征。
GmTINY1 基因在大豆荚、花等器官中高丰度表达,
说明 GmTINY1 基因在大豆生殖器官发育中可能发
挥了重要的调控作用。对 GmTINY1基因上游 1 500
bp 的大豆基因组序列进行分析, 通过 MatInspector
程序检索, 发现 4 个 MADS-box 转录因子识别位点
位于 GmTINY1基因的启动子序列内。本实验室以往
的研究表明, 大豆MADS-box 转录因子 GmSEP1在
大豆花器官的发育以及种子发育过程行使重要的功
能[8]。因此 GmTINY1在大豆生殖器官中发挥作用很
可能受 MADS-box转录因子的调控。GmTINY1在子
叶期的种脐中高丰度表达, 推测 GmTINY1在种脐的
形成过程中可能发挥作用。种脐的分化首先从栅栏
层开始, 依次是脐缝和管胞群, 在子叶期内外栅栏
层已初步形成, 正值管胞群、脐缝开始形成, 表明
GmTINY1的作用可能与管胞群、脐缝的形成有关。
管胞群、脐缝在种子成熟过程中对体内水分蒸发和
阻止外来水分进入可能发挥重要的调控作用 [19],
GmTINY1是否在这个过程中发挥作用需要进一步
研究。
4 结论
从大豆中克隆了 AP2 类转录因子基因
GmTINY1。GmTINY1 在大豆荚中高丰度表达, 在花
中的表达量较高, 在根中的表达量较低, 而在叶片
中未检测到其表达, 在种子发育子叶期的种脐部分
高丰度表达。表明 GmTINY1基因在大豆生殖器官发
育中可能发挥重要调控作用, 可能与种子发育过程
中种脐的形成有关。
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