全 文 ：V o l. 29, N o. 3
pp. 345—348　M ay, 2003
作　物　学　报
A CTA A GRONOM ICA S IN ICA
第 29 卷 第 3 期
2003 年 5 月　345—348 页
甘薯体细胞胚状体及其在脱毒、扩繁中的应用
王关林　方宏筠　李洪艳Ξ
(辽宁师范大学生命科学学院, 辽宁大连 116029)
摘　要　通过甘薯徐薯 18 茎尖体细胞培养诱导胚性愈伤组织和胚状体, 建立了体细胞无性系。胚性愈伤和胚状体诱导
培养基为M S 附加 015～ 210m göL 2, 42D、015m göL NAA、011m göL BA 及 100m göL HL。研究结果表明: 采用茎尖体细
胞胚胎发生途径能够同时实现试管苗的深度脱毒及大幅度提高扩繁量, 脱病毒率达 95% , 扩繁量达 38219 倍。田间种植
该脱病毒种苗能使甘薯产量比茎尖培养试管苗提高 50%～ 100%。
关键词　甘薯; 体细胞胚胎发生; 脱病毒; 快繁
中图分类号: S531　　　文献标识码: A
Soma tic Em bryogenesis of Sweetpota to and Its Appl ica tion in V irus-free and
Propaga tion
WAN G Guan2L in　FAN G Hong2Jun　L I Hong2Yan
(Colleg e of L if e S cience of L iaoning N orm al U niversity , D alian,L iaoning 116029, Ch ina)
Abstract　Em bryogen ic callus and som atic em bryogenesis w ere induced from the ap ical m eristem of sw eet2
po tato cu lt ival Xushu 18 ( Ip om oea ba ta tas (L. ) L am. ) in M S m edium supp lem ented w ith 015—210 m göL 2,
42D , 015m göL NAA , 011m göL BA and 100m göL HL. T he resu lts show ed that the m ult ip licat ion rate of
p lan t lets from the em bryogenesis cou ld reach 38219 t im es and the virus2free rate in the p lan t lets w as about
95%. T he field experim ent indicated that the yield of sw eetpo tato from em bryogenesis p lan t lets w ere in2
creased 50% —100% than that direct ly from shoo t t ip cu ltu re.
Key words　Sw eetpo tato; Som atic em bryogenesis; V irus2free; P ropagat ion
　　甘薯 ( Ip om oea ba ta tas L. L am ) 的主要病害是
病毒病。由于甘薯无性繁殖, 带病毒的种苗传播快、
发病严重, 使产量、质量急剧下降[ 1 ]。茎尖培养是目
前防治甘薯病毒病的有效方法。N ielsen [ 2 ]最早采用
茎尖培养方法脱除了甘薯木栓病毒。我国对甘薯茎
尖培养的研究工作开展较晚, 但进展较快, 在 1993
年张慧娟[ 3 ]、杨永嘉[ 4 ]等分别报道了甘薯茎尖培养
和脱毒快繁法及其大幅度增产效应, 并已进入推广
应用阶段。但是至今仍然存在着两个尚需深入解决
的问题: 一是脱病毒程度差。这主要是茎尖培养中,
要把茎尖剥离成为 011mm 以下大小十分困难, 而
且成活率低。也有研究表明茎尖培养不能彻底除去
病毒, 为此把最初叫无毒苗改为脱毒苗[ 5 ]。二是甘薯
茎尖培养扩繁量小, 成本高。为此, 国内外学者对甘
薯的细胞培养及体细胞胚胎发生进行了研究。迄今
已从茎尖、叶片、茎段及块根等外植体培养诱导出体
细胞胚[ 6 ]。刘庆昌等 (1993) [ 7 ]在对甘薯茎尖的组织
培养中实现了高频率的体细胞胚胎发生和植株再
生。1996 年他们又建立甘薯胚性细胞悬浮培养系,
并植株再生率达到 100% [ 8 ]。但是上述研究尚未进
行脱毒效果的系统分析及向生产实践转化。本研究
着重于以细胞培养及体细胞胚胎发生途径, 同时实
现深度脱病毒和大幅度提高扩繁量, 并应用于生产
实践。Ξ基金项目: 辽宁省科技厅攻关项目 (990805)。
作者简介: 王关林 (19432) , 男, 博士, 教授, 博士生导师。
Received (收稿日期) : 2002203227, A ccep ted (接受日期) : 20022072101

1　材料与方法
111　实验材料
以国内广泛种植的高产品种徐薯 18 为试材, 由
辽宁师范大学生物工程研究所实验基地提供。
112　方法
11211　甘薯茎尖体细胞培养　　甘薯茎尖经常规
消毒后在显微镜下剥离到 012～ 015mm 大小时, 迅
速用解剖刀切取小于 011mm 的茎尖分化组织细
胞, 接种在胚性细胞诱导培养基中。在暗培养条件
下, 待胚性愈伤组织形成后转入胚状体诱导培养基
中。形成的胚状体再转入光培养条件下的绿苗再生
培养基获得丛生试管苗。胚性愈伤组织诱导培养基
为M S 附加 210m göL 2, 42D、110～ 215m göL NAA、
011m göL BA 及 100m göL HL ; 胚状体诱导培养基
为 M S 附 加 015m göL 2, 42D、015m göL NAA、
011m göL BA 及 100m göL HL ; 绿苗再生培养基为
M S 附加 011m göL BA、011m göL IAA。培养温度
25℃, 光照 3000 lx。
11212　病毒检测　　脱毒试管苗筛选: 从试管苗上
剪取适量叶片, 加提取液研磨, 离心后取上清液, 采
用硝酸纤维素膜斑点酶联免疫检测法 (Do t b lo t2
EL ISA ) , 按文献[5 ]进行筛选检测。
指示植物鉴定法: 通过Do t b lo t2EL ISA 筛选出
的脱毒试管苗, 通过嫁接到巴西牵牛 ( Ipm oea
setosa) , 观察病症鉴定脱毒试管苗。
11213　茎尖培养　　茎尖脱毒快繁培养方法按文
献[1 ]进行。以通过Do t b lo t2EL ISA 及指示植物检
测的脱病毒试管苗为试材, 并以未脱病毒种苗为对
照。茎尖培养基为M S 附加 011m göL BA、011m göL
IAA 及 011m göL GA , 生根培养基为 M S 附加
011m göL IBA。
2　实验结果
211　甘薯茎尖体细胞培养诱导胚性愈伤组织、胚状
体及其无性系建立
小于 011mm 的茎尖分生细胞组织, 接种在胚
性愈伤组织诱导培养基上, 暗培养 3～ 5 周后, 可见
到 1～ 5mm 左右大小不等的乳白色致密胚性愈伤
组织 (图 1)。将其转到胚状体诱导培养基上培养 4～
6 周后, 在胚性细胞团的边缘诱导出许多颗粒状结
构, 用立体显微镜观察时可辨认出球形胚、鱼雷胚和
子叶胚 (图 2)。当胚状体细胞团转入相同的培养基
中继代培养时可不断扩繁, 从而产生大量的胚状体。
这些胚状体细胞团转入绿苗生长培养基中培养 3～
4 周可生长发育出许多丛生试管苗 (图 3)。再将这些
试管苗分离单独进行茎尖扩繁培养, 又可产生许多
第二、三、四代 (S2、S3、S4) 试管苗, 形成一个克隆群
体, 从而建立体细胞胚状体无性系。
图 1　从茎尖分生组织诱导的胚性愈伤组织
F ig11　Em bryogenic callus from ap ical m eristem
图 2　不同发育时期的体细胞胚
F ig12　Som atic em bryo s at differen t developm ental stages
图 3　从体细胞胚分化丛生试管苗
F ig13　P lan tlets from som atic em bryo s
212　三种扩繁途径的扩繁量比较
为了观察体细胞胚状体途径的扩繁能力, 以茎
尖培养和微型扦插繁殖为对照进行比较实验。分别
各接种 20 个茎尖外植体, 微型扦插成活率最高达
90% , 后两者的成活率很低, 茎尖培养成活 6 个, 而
胚状体途径成活 5 个。但当扩繁培养 3 代后 (S3) , 三
者已发生极大的差异, 统计结果列表 1。
643 　　　作　　物　　学　　报 29 卷　

表 1　　胚状体途径、茎尖培养途径及微型扦插途径扩繁量比较
Table 1　　Compar ison of propagation quan tity among 3 propagtion methods: somatic embryogenesis, shoottip culture and m icrocutting
扩繁途径
M ethod of
p ropagation
茎尖外植体
N o. of exp lan ts of shoo t
试管绿苗扩繁量 (株)及倍数
N o. of p lan tlets and p ropagation tim es
接种数 (个)
N o. p lan ted
成活数 (个)
N o. of
survival
诱导率 (% )
Induced
rate
S0 S1 S2
S3
数量
N o.
倍数
T im es
总扩繁量 (W )
To tal N o. of
p ropagation
M icrocu ttage cu ltu re 20 18 90 36 72 216 648 18 m (2n～ 3n)
Shoo tt ip cu ltu re 20 6 30 15 54 189 945 63 m (3n～ 5n)
Som atic em bryogenesis 20 5 25 58 960 16512 22213 38219 m (10n～ 20n)
　　W : 总扩繁量 (To tal N o. of p ropagation)　　　　　　　m : S0 的试管苗数量 (N o. of S0)
n: 继代培养次数 (T im es of subcultu re)　　　 扩繁倍数= S3öS0 (P ropagation tim es= S3öS0)
　　表 1 说明三代扩繁后, 微型扦插只扩繁了 S0 的
18 倍, 茎尖培养扩繁了 63 倍, 而胚状体途径扩繁了
约 38219 倍, 微型扦插的扩繁系数为 2～ 3, 茎尖培
养为 3～ 5, 而胚状体为 10～ 20, 当扩繁培养 1 年后
按W = m p n 计算 (n 为 12 代, p 为扩繁系数) , 三者
的差异十分巨大。由此可见, 产生胚状体是一条理想
的扩繁途径。
213　三种扩繁途径的脱病毒作用比较
图 4　Do t b lo t2EL ISA 病毒检测结果
F ig14　T he resu lts of virus detection by dt b lo t2EL ISA
11 带病毒甘薯苗
21 胚状体途径的试管苗
31 茎尖培养的试管苗
41 微型扦插的试管苗 　　11P lan t w ith virus21P lan tlets from em bryo id31P lan tets from shoo tt ip cu ltu re41P lan tlet from m icrocu tt ing
为分析胚状体途径扩繁试管苗的脱病毒作用,
实验中与茎尖脱毒培养进行比较, 并且以微型扦插
培养为阳性对照 (微型扦插不能脱病毒)。对徐薯 18
的种苗进行了检测, Do t b lo t2EL ISA 方法和指示植
物检测都确认为带病毒植株, 主要病毒为甘薯羽状
斑驳病毒 (SPFM V )和甘薯潜隐病毒 (SPLV )。带病
毒苗分别进行了茎尖体细胞诱导胚状体培养、茎尖
培养及直接进行试管内微型扦插培养, 获得的 S1 代
的试管苗分别进行Do t b lo t2EL ISA 检测及巴西牵
牛指示植物鉴定。从图 4 结果明显可见未脱毒徐薯
18 种苗呈阳性反应, 胚状体诱导的试管苗及茎尖培
养的试管苗都呈阴性反应, 而微型扦插繁殖的试管苗
仍然呈阳性反应。该实验结果进一步证实不能把微型
扦插苗作为脱毒苗使用。将阴性反应和阳性反应的植
株分别嫁接到指示植物巴西牵牛上, 培养 1 个月后可
观察到带病毒试管苗致使牵牛发病而死亡, 而脱毒试
管苗未使牵牛发病, 生长健壮 (图 5)。这一结果也进
一步表明Do t b lo t2EL ISA 方法是可靠的。 图 5　指示植物巴西牵牛病毒检测结果F ig15　T he resu lts of virus detectionon the Ip om oea setosa p lan ts为了定量比较体细胞胚发生途径与茎尖培养途径脱病毒的效果, 分别取 100 株第三代的试管苗 (S3) 进行了Do t b lo t2EL ISA 病毒检测, 统计结果列表 2。表 2　　茎尖培养和胚状体培养的脱病毒率比较Table 2　　Compar ison of v irus-free rates betweenshoottip and embryogenesis cultures扩繁途径P ropagationm ethods 检测苗数N o. ofp lan tstested 阴性苗数N o. ofnegativep lan ts 阳性苗数N o. ofpo sitivep lan ts 中性苗数N o. ofneu tralp lan ts 脱病毒率 (% ) 3V irus2free rate(M eans±SD )Shoo ttipcu ltu re 100 62 21 17 62±014Em bryo2genesis 100 95 0 5 95±015
　　3 3 次重复检测结果　M eans from 3 rep licates.
从表 2 可见胚状体途径的脱病毒率可达 95%。
茎尖培养脱病毒率为 62%。茎尖培养的脱病毒效果
与茎尖剥离大小有关, 剥离越小, 脱毒效果越好。
214　三种扩繁途径生产的试管苗的增产效应比较
本研究自 1998 年以来在相同的栽培和管理条
件下, 连续 3 年对胚状体途径生产的脱病毒试管苗
743　3 期 王关林等: 甘薯体细胞胚状体及其在脱毒、扩繁中的应用

进行了田间栽培实验, 并以茎尖培养途径、微型扦插
繁殖的试管苗及非脱毒试管苗 (常规种苗)进行对比
实验。每年实验材料均为原种苗, 种植面积不断扩
大, 1999 年 3133hm 2, 2000 年 2017hm 2, 2001 年
3617hm 2。非脱毒试管苗对照组每年 0167hm 2。其产
量统计结果如图 6 所示。
图 6　不同扩繁途径甘薯试管苗的增产效应比较
F ig16　Comparison of yield among various p ropagation m ethods
在 3 年实验中 2000 年大连地区干旱, 3 种扩繁
途径的试管苗的产量都明显下降, 但 3 年平均, 徐薯
18 的茎尖培养脱毒苗平均 667m 2 产 3500kg, 比未
脱毒苗增产 36% , 此结果与邢继英等 (1993) [ 9 ]报道
相似。胚状体途径扩繁的试管苗 667m 2 产达到约
5000kg, 增产 88146%。最高产量达约 6000kg, 增产
126149%。微型扦插扩繁的试管苗平均 667m 2 产
2800kg, 增产 0107%。由此可见胚状体快繁途径具
很大增产潜力, 如果全部采用该途径生产脱毒试管
苗, 可使甘薯产量在现有水平上再上一个台阶。
215　茎尖体细胞胚状体发生途径试管苗的无性系
变异初步分析
微型扦插和茎尖培养一般不会发生无性系变
异, 遗传稳定性好。在茎尖体细胞培养诱导胚性细胞
及胚状体的过程中, 细胞经历了脱分化和再分化过
程, 因此可能发生变异。实验中选择两个比较稳定的
性状薯皮颜色和薯肉颜色进行观察。连续 3 年都未
观察到薯皮颜色变异株。薯肉颜色在 1 万余植株中
仅发现 1 株从白色变成黄色。茎尖培养和微型扦插
繁殖的试管苗则未观察到变异。
3　讨论
茎尖分生细胞是分化未决定细胞, 顶芽和花芽都
由其分化发育而成, 因此茎尖分生细胞列入种质细
胞[ 10 ]。从理论上看, 通过茎尖分生细胞培养诱导胚性
细胞团和胚状体是一条理想的快繁途径, 可获得大量
的胚状体及再生植株。本研究表明该途径具有如下特
点: (1) 试管苗扩繁增殖量大, 比茎尖快繁增加很多
倍。(2) 脱毒效果好, 能较彻底的去除原品种的内源病
毒。其原因可能是 011mm 以下的茎尖分生细胞即可诱
导胚性细胞, 或在细胞的脱分化和再分化过程中再次
脱病毒, 或胚状体是单细胞起源, 而不是多细胞起源,
脱病毒较彻底。 (3) 嵌合体少, 生产的试管苗整齐。
(4) 高产稳定, 用该途径生产的种苗可提高产量
50%～ 100%。(5) 无性系变异不明显。所以茎尖体细
胞培养诱导胚性细胞和胚状体途径能同时解决甘薯目
前试管苗生产中存在的脱病毒率低及扩繁量小两大难
题, 使甘薯从组织器官快繁水平提高到细胞水平。该途
径在甘蔗的脱毒试管苗生产中已得到应用[ 11 ]。
References
[ 1 ] 　Zhu D 2W (朱德蔚 ). P lan t T issue Culture and V irus2free
P ropagation (植物组织培养与脱毒快繁技术). Beijing: Sci2
ence and T echno logy P ress, 2001, 252—264
[ 2 ]　N ielsen LW. E lim ination of in ternal co rk virus by cultu re ap i2
cal m eristem of infected sw eet po tatoes. P hy top a thology ,
1960, 50: 840—841
[ 3 ]　Zhang H 2J (张慧娟). A p ical m eristem cultu re of sw eetpo tato.
S hand ong N orm al U niversity A cta (山东师范大学学报) ,
1993, 8 (2) : 60
[ 4 ]　Yang Y2J (杨永嘉) , D iscussion of virus2free of sw eetpo tato
p roduction system. Ch inese Sw eetp ota to (中国甘薯). 1993,
(526) : 29
[ 5 ]　Cao Z2Y (曹孜义) , L uo G2M (刘国民). T ex tbook of p ractical
T echniques on P lan t T issue (实用植物组织培养技术教程).
L anzhou: Ganshou Sci T ech P ress, 19991 295—301
[ 6 ]　L u S2Y (陆漱韵) , L iu Q 2C (刘庆昌) , L iW 2J (李惟基) , Sw eet2
po tato B reeding (甘薯育种学). Beijing: A gricu ltu re P ress,
19981 366—375 ( in Ch inese)
[ 7 ]　L iu Q 2C (刘庆昌) , L uo J2Q (罗建钦) , Zhou H 2Y (周海鹰) et
a l. H igh frequency som atic em bryogenesis and p lan t regener2
ation in sw eetpo tato, Ip om oea ba ta tas (L. )L am. J ou rna l of
A g ricu ltu ra l B iotechnology (农业生物技术学报) , 1993, 1 (1) :
84—89
[8 ]　L iu Q 2C (刘庆昌) , L u D 2H (鲁迪慧) ,M a B (马彪) et a l. Cell
suspension cultu res and efficien t p lan t regeneration in sw eet
po tato. J ou rna l of A g ricu ltu ra l B iotechnology (农业生物技术
学报) , 1996, 4 (3) : 238—242
[9 ]　X ing J2Y (邢继英) , Yang Y2J (杨永嘉) , W u J2Y (邬景禹) et
a l. Studied on virus2free of sw eetpo tato p roduction. Ch inese
Sw eetp ota to (中国甘薯) , 1993, 5—6: 33—39
[ 10 ]　V o isey C R , W h ite D W R , D udes B. A grobacto rum m ediat2
ed transfo rm ation of w h ite clover using direct shoo t o rgano2
genesis. P lan t Cell R ep , 1994, 13: 309—314
[ 11 ]　H e X2M (何新民). Studied on rap id p ropagation of sugarcane
imp roved variet ies. S ug arcane (甘蔗) , 1994, 1 (4) : 3—5
843 　　　作　　物　　学　　报 29 卷