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第 28 卷 第 2 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 2
2002 年 3 月 167～ 169 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 167～ 169　M ar. , 2002
甘薯线虫病品种抗性的 PCR 检测Ξ
郭金平　潘大仁3
(福建农林大学农业部甘蔗遗传育种重点开放实验室, 福建福州, 350002)
摘　要　根据甜菜抗线虫病基因序列, 人工合成了三条上游引物和三条下游引物, 从中筛选出一对引物, 对 11 份经抗
线虫病常规鉴定的甘薯品种 (包括 6 份高抗, 2 份抗病, 3 份感病)进行了 PCR 检测。结果表明: 6 份高抗品种和 1 份抗
病品种出现了一条 630 bp 左右大小的特异片段, 而 3 份感病品种未出现任何条带。这与常规鉴定的结果基本吻合, 证
明分子检测的可行性。
关键词　甘薯; 抗线虫病; PCR 检测
中图分类号: S531　　　文献标识码: A
PCR D etection of Nema tode Resistance in Sweet Pota to
GUO J in2P ing　PAN D a2R en
(T he K ey L aboratory of S ugarcane Genetics and B reed ing , the M inistry of A g riculture, Fuzhou, Fuj ian, 350002, China)
Abstract　A ccording to the sequence of nem atode resistan t gene in sugar beet, th ree fo rw ard p rim ers and th ree
reverse p rim ers w ere p roduced by syn thetic. A pair of p rim ers w ere selected among them. 11 sw eet po tato
cultivars ( including 6 nem atode h igh resistan t, 2 resistan t and 3 sensitive cultivars by conven tional
iden tification)w ere detected by PCR. T he results show ed that a special fragm en t of about 630 bp appeared in 6
h igh resistan t and 1 resistan t cultivars, and no th ing in 3 infected cultivars. T he result w as in co rrespondence
w ith that of conven tional iden tification, and suggested the feasibility of PCR detection.
Key words　Sw eet po tato; N em atode resistance; PCR detection
　　线虫病 (N em atode) 是我国农作物上主要病害
之一, 胞囊线虫危害包括糖料作物甘蔗、甜菜、十
字花科作物、果树、甘薯、马铃薯、豆科作物、蔬菜
等八大类几十种作物, 据统计, 全世界每年因植物
线虫危害而造成的经济损失超过 1000 亿美元[ 1 ]。
鉴定各种作物的抗线虫病种质资源可为作物抗线虫
病育种提供前提和基础。常规鉴定时间长, 有时受
到种种条件的限制, 效果并不显著。本文根据抗线
虫病基因序列H S1p ro21[ 2 ]设计引物, 筛选出一对特异
引物, 通过 PCR 扩增, 能快速准确地检测甘薯种质
资源对线虫病的抗性情况。
1　材料和方法
1. 1　植物材料
共 22 份甘薯品种, 其中 11 份是经过常规鉴定
的, 另外 11 份未经过常规鉴定 (见表 1) , 来自福建
农业大学甘薯教研室资源圃。
1. 2　D NA 提取
甘薯基因组DNA 从 10～ 20 mm 长的幼叶中提
取, 采用CTAB 法[ 3 ]。每 5 g 叶片加入 1 g PV P, 在
液氮中研磨成粉末, 再加入 15 mL 含 0. 4% Β2巯基
乙醇的 2% CTAB 提取液 (0. 2 molöL ) ED TA , 0. 1
molöL T ris2HC l(pH 8. 0) , 1. 4% molöL N aC l, 2%
CTAB ) , 匀浆, 在 65℃水浴中保温 1 h, 然后冷却
至室温加入等体积的氯仿与异戊醇混合物 (24∶1) ,
混匀溶液。混合液在 3400 röm in 离心 15 m in, 上清
液转移至 50 mL 的离心管中, 加入 2～ 3 倍体积的
20℃乙醇。轻轻往复倒转试管, 直至DNA 沉淀, 把
DNA 挑出, 用 76% 乙醇 (含 0. 2 molöL 醋酸钠) 溶
液洗20m in , 然后用76% 乙醇 (含0. 01molöL 醋酸Ξ 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39870545) ; 福建省国际科技资助项目 (20001004)
作者简介: 郭金平 (19722) , 男, 江西吉安人, 助教, 硕士生, 研究方向, 分子生物学和生物工程。　　3 通迅作者。
Received on (收稿日期) : 2000210208, A ccep ted on (接受日期) : 2001203217

表 1　　供试甘薯材料
Table 1　　The tested sweet potato mater ia ls
样品号
Samp le
num ber
品种名
Cultivar
线虫病抗性3
Resistance to
nem atode
样品号
Samp le
num ber
品种名
Cultivar
线虫病抗性
Resistance to
nem atode
1 金山 908 高抗 1′ 美国红 待测定
2 金山 25 高抗 2′ 澳洲黄 待测定
3 AB9407821 高抗 3′ 黄金千贯 待测定
4 AB9400128 高抗 4′ 日清 1 号 待测定
5 P616223 高抗 5′ 南瑞苕 待测定
6 福建 9721909 高抗 6′ 胜利百号 待测定
7 福建 9621193 抗病 7′ 南薯 88 待测定
8 福建 1885 抗病 8′ 湘薯 待测定
9 苏渝 76 高感 9′ 新种花 待测定
10 苏薯 2 号 感病 10′ 夏引 1 号 待测定
11 栗子香 高感 11′ 金山 57 待测定
　　注: 3 : 经常规鉴定, 线虫病抗性常规鉴定的结果由徐州甘薯
中心提供。
　　Note: 3 : The resistance of nem atode has been identified, the
results of nem atode resistance w ere p roduced by sw eet
po tato center in xuzhou.
铵) 溶液清洗 10 s, 再用 70% 乙醇清洗 30 m in, 最
后凉干, DNA 溶解在 300 ΛL 的 T E (0. 01 molöL ,
T ris2HC l (pH 8. 0) , 1 mmolöL ED TA ) 缓冲液中。
置于- 20℃冰箱中保存待用。测定提取 DNA 的
OD 280 nm 和OD 260 nm 值, 并结合琼脂糖凝胶电泳
来判断DNA 的含量与质量。最后将样品的DNA
浓度稀释成 50 ngöΛL , 作为 PCR 扩增的样品。
1. 3　引物设计[4 ]
根据线虫病基因H S1p ro21序列, 设计了 6 条用于
扩增抗线虫病基因类似序列的寡聚核苷酸引物[ 5, 6 ] ,
引物由上海生工 (Sangon)生物工程公司合成, 序列
如下: 上游引物: P1: 5′2GGGCGCGT T GGA T T23′,
P2: 5′2TCCT TCCGA GGT TA GCCA CGT23′, P3:
5′2TA GT T T GGGCCT T GGT GA GC23′; 下游引物:
P4: 5′2CTCCA TAA CCTCCCTA TCGC23′, P 5: 5′2
CA GT T GCGTCT TCA GA T GCA 23′, P6: 5′2
CAA CT GA GCCAA CAAA TCCG23′。
1. 4　PCR 扩增和电泳
dN T P, T aq 酶均为上海生工 (Sangon) 生物工
程公司产品。反应体积为 20 ΛL , 其中包含 10
mmolöL T ris2HC l (pH 8. 3) , 50 mmolöL KC l, 2. 0
mmolöL M gC l2, 100 ΛmolöL dN T P, 0. 3 ΛmolöL 引
物浓度, DNA 模板 50 ng, T aq 酶 1. 5 U。
将样品放入 PE29600 型 DNA 扩增仪中进行
PCR 扩增。反应程序为: 94℃ 5 m in, 1 个循环;
94℃ 40 s, 55℃ 50 s, 72℃ 90 s, 35 个循环; 72℃
延伸 10 m in。
扩增产物经含有 0. 5 ΛgömL 溴化乙锭的 1. 5%
琼脂糖凝胶电泳 90 m in ( 5 V öcm ) 后在 V ilber
L ourm at VD S 凝胶成像系统上观察并照相记录。
2　结果与分析
2. 1　通过对 PCR 技术各种影响因素的研究, 结果
发现: 在 20 ΛL 的反应体系中, 2. 0 mmolöLM gC l2,
100 ΛmolöL dN T P, 0. 3 ΛmolöL 引物浓度, 50 ng
植物基因组DNA , 1. 5 U 的 T aq 酶, 比较适合甘薯
总DNA 的特异扩增。
2. 2　按照以上 PCR 扩增的条件, 以高抗品种金山
25 为模板DNA , 根据排列组合的原理, 对由上海
生工合成的三条上游引物和三条下游引物进行排列
组合, 共产生 9 对引物组合, 分别为 P1P4、P1P5、
P1P6、P2P4、P2P5、P2P6、P3P4、P3P5、P3P6, 从中筛
选出 P1P4 这对特异引物。
2. 3　用 P1P4 这对特异引物对 8 个抗病品种 (其中
包括 6 个高抗品种和 2 个抗病品种) 和 3 个感病品
种 (包括 2 个高感品种和 1 个感病品种) 的基因组
DNA 进行 PCR 扩增后, 6 个高抗品种均产生一条
630 bp 左右的DNA 特异片段, 在另外两个抗病品
种中, 福建 9621193 出现了该特异片段, 福建 1885
则无任何条带; 而三个感病品种未出现任何条带
(见图 1)。
2. 4　用 P1P4 这对特异引物对另外 11 个未知抗性
的甘薯品种 (编号为 1′～ 11′) 进行抗线虫病 PCR 检
测, 结果发现有 8 个品种 (分别为澳洲黄、日清 1
号、南瑞苕、南薯 88、湘薯、新种花、夏引 1 号、金山
57)出现了 630 bp 的特异DNA 片段, 另外 3 个品
种 (美国红、黄金千贯、胜利百号) 则无任何条带 (见
图 1　11 个甘薯品种总DNA 的 PCR 扩增产物 (已通过常规鉴定)
F ig. 1　　PCR p roducts of eleven sw eet po tato to tal DNA
(w ith conventional identification)
1～ 11 分别为 11 份甘薯品种 1～ 11 的 PCR 产物,
12 为 100 bp DNA ladder
L ane 1～ 11: PCR p roducts of sw eet po tato cultivar No. 1～ 11,
respectively, L ane12: 100 bp DNA ladder.
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图 2　11 个甘薯主栽品种总DNA PCR 扩增产物 (未常规鉴定)
F ig. 2　　PCR p roducts of eleven p rincipal cultivars to tal
DNA (w ithout conventional identification)
1～ 11 分别是 11 份待检甘薯品种 1′～ 11′的 PCR 产物, 12 是阳
性对照, 13 是阴性对照, M : 100 bp DNA ladder.
L ane 1～ 11: PCR p roducts of sw eet po tato cultivar No. 1′～ 11′,
respectively, L ane 12: postive contro l, L ane 13: negative
contro l, M : 100 bp DNA ladder
图 2)。表明澳洲黄等 8 个品种可能是高抗或抗线虫
病的, 而美国红等 3 个品种很可能是感病的品种。
3　讨论
3. 1　PCR 技术对甘薯品种抗线虫病基因检测的可
行性
根据多数抗病基因 (R ) 编码蛋白质的核苷酸结
合区 (N ucleus B inding Site. NBS) 和富含亮氨酸重
复 (L eucine R ice R epeat, L RR )保守区特点[ 7 ] , 我们
按照甜菜抗线虫病基因设计了 6 条 PCR 特异引物:
P1、P2、P3、P 4、P5、P6, 将它们组合成 9 对引物。利
用甘薯高抗品种金山 25 的基因组DNA 为模板, 进
行 PCR 扩增, 引物对 P1P4 可获得一条约为 630 bp
大小的 PCR 扩增产物, 然后对已经过常规鉴定的
甘薯品种进行特异扩增, PCR 检测结果与常规检测
相当吻合, 吻合度高达 7ö8。产生误差的原因可能
来自两个方面, 一是在常规鉴定中, 由于环境条件
变化或统计误差等, 使感病品种被误认为是抗病品
种。另一方面可能是在提取DNA 时样品纯化不足,
仍含较多的色素或糖类等抑制性物质, 从而抑制了
DNA 的扩增, 影响检测效果。
3. 2　PCR 引物的特异性
由于甘薯与甜菜属于不同的科, 亲缘关系较
远, 其抗病基因同源序列[ 8 ]的保守区域相对少, 所
　　　
以在甘薯品种中只筛选出一对特异引物, 并获得一
条 630 bp 左右的DNA 特异片段[ 9 ]。此条带能很好
的把抗病品种与感病品种区分开来, 因此利用该对
引物能有效地检测甘薯品种对线虫病的抗性状况。
此片段很可能是一个抗线虫病基因同源序列, 对其
同源性大小, 尚需进一步研究。
3. 3　评价 11 份未常规鉴定的甘薯主栽品种对线虫
病的抗性
本实验对 11 份未经常规鉴定的甘薯主栽品种
的基因组DNA 进行了特异扩增, 结果表明: 其中
有 8 个品种出现了 630 bp 左右的片段, 另外 3 个品
种则未出现任何条带。此结果与常规育种目标的现
实情况相符合。但其最终结果有待于进一步的田间
接种鉴定。
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