全 文 ：Vol. 30 , No. 12
pp. 1254 - 1258 　Dec. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 12 期
2004 年 12 月 　1254～1258 页
影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素
高三基1 　陈如凯1 　马宏敏2 Ξ
(1 福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室 ,福建福州 350002 ;2 福建省农业科学院稻麦研究所 ,福建福州 350019)
摘 　要 　以优良籼稻品种的成熟胚为材料 ,探讨不同浓度 ABA、愈伤组织继代次数、培养时间以及干燥处理等因素对籼
稻成熟胚愈伤组织再生能力的影响。结果表明 : (1)在分化培养基上添加 3. 0～5. 0 mgΠL ABA 对促进胚性愈伤组织的形
成及胚状体发生 ,提高植株再生能力有显著作用。(2)继代 3 次、培养 20～30 d 的成熟胚愈伤组织质量较好 ,分化率达较
高水平。随着继代次数和培养时间的进一步增加 ,分化率有明显下降的趋势。(3)分化前对愈伤组织进行干燥处理有利
于芽的分化。对于已分化出绿点而难于分化出芽的愈伤组织 ,转移至壮苗培养基前 ,经过适当干燥处理 ,分化率明显提
高。(4)通过优化以上几个影响因素 ,明恢 81、优 99、R527、N175、航 1 号等 5 个籼稻品种成熟胚愈伤组织的平均分化率可
达 87. 5 %～90. 8 %。
关键词 　籼稻 ( Oryza sativa L. ) ;成熟胚 ;植株再生 ;分化
中图分类号 :S511. 1 ;Q812
Factors Influencing the Regeneration Frequency of Mature Embryo2derived Cal2
lus in Hsien Rice Cultivars ( Oryza sativa L . )
GAO San2Ji1 ,CHEN Ru2Kai1 ,MA Hong2Min2
(1 Key Laboratory of Eco2physiology & Genetic Improvement for Sugarcane , Ministry of Agriculture , Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou
350002 , Fujian ;2 Institute of Rice and Wheat , Fujian Academy of Agricultural Sciences , Fuzhou 350019 , Fujian , China)
Abstract The effects of different ABA concentration , subculture passages , incubation time and partial desiccation of cal2
lus on plant regeneration capacity of mature embryo2derived callus in hsien rice cultivars were investigated. The results
showed as follows. (1) The addition of 3. 0 - 5. 0 mgΠL ABA in differentiation medium contributed to embryogenesis and
organogenesis , then enhanced significantly the plant regeneration frequency. (2) Superior embryogenic callus after three
subculture passages and 20 - 30 days incubation were with higher plant regeneration frequency. However , with the further
increase of subculture passages and incubation time , plant regeneration frequency would be decreased step by step . (3)
Embryogenic callus partially desiccated before transferring to differentiation medium benefited shoot differentiation , and the
differentiation frequency of callus with green2spot that could not regenerate into shoot would be increased when the callus
had been desiccated properly before transferring to the 1Π2 MS medium. (4) Plant regeneration frequency of the five hsien
rice cultivars Minghui 81 , You 99 , R527 , N175 , and Hang No. 1 reached from 87. 5 % to 90. 8 % by optimizing the mea2
sures above1
Key words Hsien rice ( Oryza sativa L1) ;Mature embryos ;Plant regeneration ;Differentiation
　　由于多数籼稻品种愈伤组织分化率很低 ,又高
度依赖于水稻基因型和外植体来源[1 ,2 ] ,所以转基因
水稻育种的前提和基础是建立供试品种相应外植体
高效稳定的组织培养再生体系。目前用于转基因的
外植体主要有胚性悬浮细胞系、原生质体、成熟胚愈
伤组织、幼穗、幼胚及其愈伤组织。胚性悬浮细胞系
和原生质体的培养时间长、操作困难、细胞无性系变
异频率高 ;幼穗和幼胚取材受季节限制 ,在操作中易
污染、工作量大 ;成熟胚有来源不受生长季节限制、
取材方便、外植体均匀、灭菌容易、重复性好等优点 ,Ξ 基金项目 :福建农林大学青年教师科研基金 (02B01)项目资助。
作者简介 :高三基 (1973 - ) ,男 ,助理研究员 ,在职博士生 ,研究方向 :甘蔗遗传育种与植物基因工程。E2mail :gsanji @163. com
Received(收稿日期) :2003207225 ,Accepted(接受日期) :2003212202.

因此 ,现在越来越多研究者采用成熟胚愈伤组织作
为遗传转化的受体。
水稻愈伤组织培养成功率的大小是对水稻离体
组织进行遗传操作的关键。影响水稻愈伤组织培养
成功率的因素很多 ,主要是品种的基因型、外植体来
源和外界培养条件等因素。本研究拟从添加不同
ABA 浓度、愈伤组织继代次数、培养时间及部分干
燥处理等方面探讨它们对籼稻成熟胚愈伤组织再生
能力的影响 ,从而进一步优化实验条件 ,以期建立一
套籼稻成熟胚高效绿苗再生体系 ,提高水稻外源基
因遗传转化的效率 ,同时也为水稻成熟胚愈伤组织
高频植株再生体系的研究提供借鉴。
1 　材料与方法
111 　供试材料
　　选用由福建省三明市农业科学研究所提供的明
恢 81、明恢 86、优 99、R527 以及由福建省农业科学
院稻麦研究所提供的 N175、航 1 号等 6 个优良籼稻
恢复系作为培养材料。
将成熟种子除去颖壳 ,在 70 %乙醇中浸泡 1
min ,然后在 20 %次氯酸钠溶液 (滴加数滴 Tween 20)
中 ,磁力搅拌 30 min。经无菌水冲洗 3～5 次 ,用无
菌滤纸吸干后 ,接种于诱导培养基上。每个品种接
种 360～400 粒。
112 　培养基
诱导、继代和分化培养基均以 NB (N6 培养基的
大量元素 ,加 B5 培养基的微量元素和有机物) 为基
本培养基 ,添加 0103 % ( WΠV ) 水解酪蛋白、0105 %
( WΠV)L2脯氨酸、01025 %( WΠV)L2谷氨酰胺、0175 %
( WΠV)琼脂粉以及 3 %( WΠV ) 蔗糖。诱导和继代培
养基另加 2 mgΠL 2 ,42D ;分化培养基另加 315 mgΠL
KT、110 mgΠL NAA 和 510 mgΠL ABA。壮苗培养基为
不含任何激素的 1Π2 MS培养基 ,添加 1 gΠL 活性碳。
113 　培养条件
将成熟胚置 25 ℃恒温培养箱暗培养 7～10 d 后
计算诱导率。从种子胚盾片部位切下诱导出的愈伤
组织接种于新鲜的继代培养基上暗培养 ,每隔 15～
20 d 继代 1 次。每品种挑选 100～110 粒胚性愈伤
组织 , 接种于分化培养基上 , 于 16 hΠd , 80～ 100
μmol·m22 ·s21 光照条件下再生植株 , 培养温度为
28 ℃。培养 35 d 后统计分化率。愈伤组织分化率
= 出现绿苗的愈伤组织数Π接种的愈伤组织数 ×
100 %。待幼苗在分化培养基上长到 2～3 cm 时 ,转
移到壮苗培养基上 ,培养 15～20 d 后进行移栽试验。
114 　试验处理
11411 　ABA 浓度试验 　　设置 0、110、310、510、710
mgΠL 浓度梯度。
11412 　继代次数试验 　　选用直接诱导出的愈伤
组织 (初始愈伤组织)及继代 1、3、5、7、9 次后的愈伤
组织。
11413 　培养时间试验 　　选用培养 20、30、40、50、
60 d 的愈伤组织。
11414 　部分干燥处理试验　　将愈伤组织置铺有 3
层无菌滤纸的培养皿中 ,于光照或黑暗培养条件下
分别干燥 2、4 d 后转移到分化培养基上。
有的愈伤组织分化 35 d 后 ,仅分化出绿点但难
于分化出芽 ,将这部分带绿点的愈伤组织适当干燥
(2 d) ,然后接种于壮苗培养基上 ,15 d 后统计分
化率。
11415 　高效植株再生体系的验证试验 　　优化影
响分化频率的几个因子 ,建立籼稻品种成熟胚愈伤
组织模式化的高频植株再生体系流程。其操作程序
如下 :挑选继代 3 次、培养 20～30 d 的胚性愈伤组
织 →部分干燥 2～3 d (表面干缩 ,稍变白) →接种于
分化培养基上 (NB + 510 mgΠL ABA + 315 mgΠL KT +
110 mgΠL NAA) →当分化苗长至 2～3 cm ,转移至壮
苗培养基 (1Π2 MS + 1 gΠL 活性碳) →培养 15～20 d
→移栽成活。按照这个实验程序验证该再生体系
的有效性和稳定性。
11416 　统计分析 　　方差分析选用双因素无重复
观测值统计分析模型 ,均值多重比较采用 Student2
Newman2Keuls 检验法 ( q 检验法) ,所有统计分析应
用 SAS软件完成[3 ] 。
2 　结果
211 　不同 ABA浓度对愈伤组织分化率的影响
　　实验表明 ,未加 ABA 激素的愈伤组织出现绿点
最早 ,分化培养 7 d 左右 ,愈伤组织表面开始出现绿
点 ,随着 ABA 激素浓度的提高 ,出现绿点的时间相
应推迟。未加 ABA 的愈伤组织表面较为湿润、颜色
深黄、愈伤组织增殖较快 ,分化率较低 ,部分绿点不
能分化出苗。而在加有 ABA 的愈伤组织表面较为
干燥、颜色鲜艳、增殖缓慢 ,分化率较高。
从图 1 看出 ,外加一定浓度的 ABA 对促进胚性
愈伤组织的生长和胚状体发生、发育具有一定作用 ,
从而提高成熟胚愈伤组织的分化率 , 特别是添加
5521　12 期 高三基等 :影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素 　　　

图 1 不同 ABA浓度对胚性愈伤组织分化率的影响
Fig. 1 Effect of different ABA concentrations on
differentiation rate of embryogenic callus
310～510 mgΠL ABA 浓度处理 ,比未加 ABA 处理提
高 111～217 倍 ;但过高 ABA 浓度 ( > 710 mgΠL) 反而
会抑制愈伤组织的分化。方差分析结果表明 ,基因
型间差异未达显著水平 ,而不同 ABA 浓度梯度间的
差异却达极显著水平 ( P < 0101 ) 。q 测验表明 ,在
分化培养基上添加 310～510 mgΠL ABA 明显提高胚
性愈伤组织的分化能力 (表 1) 。
表 1 ABA浓度对胚性愈伤组织分化率的影响
Table 1 Effect of ABA concentration on differentiation
rate of embryogenic callus
ABA 浓度
ABA concentration
(mgΠL) 分化率Differentiation rate ( %)明恢 81
Minghui 81 N175
航 1 号
Hang No11 均值 3Average( %)
010 3518 2118 2515 2717 d
110 5416 5210 4713 5113 b
310 7410 8019 6614 7318 a
510 7518 7118 7515 7414 a
710 5110 3810 3316 4019 c
　注 : 3 平均数间相同字母表示差异未达显著水平 ( P > 0105) ,下同。
Notes : 3 Means that the figures with the same letter are not significantly
different1 The same below1
212 　不同继代次数对愈伤组织分化率的影响
方差分析表明 ,不同继代次数对愈伤组织分化
率有极显著影响 ( P < 0101) ,而基因型间差异不显
著。从表 2 看出 ,初始愈伤组织分化率较低 ,约
34 % ;经过 3 次继代培养 ,愈伤组织分化率达最高
值 ,约为 77 % ;随着继代次数进一步增加 ,分化率逐
步降低。初始愈伤组织在分化过程中 ,愈伤组织不
断增殖膨大 ,多数愈伤组织表面出现绿点 ,但部分绿
点未能分化出芽 ,每块愈伤组织分化出的丛生芽较
少 ,一般为 1～3 芽。
表 2 继代次数对胚性愈伤组织分化率的影响
Table 2 Effect of subculture passages on differentiation
rate of embryogenic callus
继代次数
Subculture
passage
分化率
Differentiation rate ( %)
明恢 81
Minghui 81 N175
航 1 号
Hang No11 均值Average( %)
0 3515 3415 3019 3316 c
1 5316 4316 3217 4313 b
3 7415 7812 7713 7617 a
5 7316 7614 7515 7512 a
7 6812 7019 6217 6713 a
9 4911 5118 3911 4617 b
　　本研究认为 ,籼稻成熟胚愈伤组织随着继代培
养次数的增多 ,颗粒状胚性愈伤组织的形成量迅速
增加。经过 3 次继代以后 ,愈伤组织已调节到较佳
状态 ,此阶段的大部分愈伤组织为胚性愈伤组织 ,是
用于遗传转化的理想受体材料。虽然继代 7 次后愈
伤组织仍然保持相对较高水平的分化率 ,但随着继
代次数的增加 ,水稻体细胞无性系的变异率加大 ,这
对转基因植株后代筛选不利。
213 　不同培养时间对愈伤组织分化率的影响
从表 3 可见 ,随着愈伤组织培养时间的延长 ,分
化率呈降低的趋势。培养 20～30 d 的愈伤组织表
面干燥 ,颜色淡黄 ,结构致密 ,颗粒状 ,分化率较高。
随着培养时间的延长 ,愈伤组织开始变得暗淡、褐
化、表面较黏 ,接种到分化培养基上后 ,部分愈伤组
织变褐死亡。培养时间较长的愈伤组织分化出绿点
也较迟 ,有的绿点不能分化成苗。
表 3 培养时间对胚性愈伤组织分化率的影响
Table 3 Effect of incubation time on differentiation
rate of embryogenic callus
培养时间
Incubation
time
(d)
分化率
Differentiation rate ( %)
明恢 81
Minghui 81 N175
航 1 号
Hang No11 均值Average( %)
20 7813 7715 7412 7617 a
30 7518 7617 7510 7518 a
40 5912 6617 6518 6319 b
50 4813 5215 4117 4715 c
60 2617 3313 2510 2813 d
　　方差分析表明 ,基因型间的差异不显著 ,而不同
培养时间处理间的差异则达极显著水平 ( P <
0101) , q 测验说明 ,培养 20～30 d 的愈伤组织分化
率较高 ,与其他培养时间的愈伤组织分化率达显著
差异。因此 ,用于遗传转化的成熟胚愈伤组织受体
应选用培养 20～30 d 的较好。
214 　愈伤组织部分干燥处理对分化率的影响
愈伤组织转入分化培养基前的脱水处理对不同
6521 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

图 2 愈伤组织干燥处理对分化率的影响
Fig. 2 Effect of desiccation of callus on differentiation rate
基因型成熟胚愈伤组织分化率的影响差异较大 (图
2) 。愈伤组织脱水处理 2、4 d 均能提高愈伤组织绿
苗的分化频率 ,对难分化的品种 R527、优 99 和明恢
86 效果更为明显 ,其分化率提高 111～517 倍 ;对未
经过脱水处理就已有较高分化率的品种明恢 81、
N175、航 1 号 ,分化率提高 1017 %～2112 %。光照或
黑暗条件下愈伤组织脱水对促进愈伤组织分化的效
果基本一致。经过脱水处理的愈伤组织比未脱水处
理的愈伤组织较快分化出芽 ,长势较好 ,分化进度更
为一致。
愈伤组织在分化过程中 ,部分分化出绿点 ,但不
能分化出芽。将这部分有绿点的愈伤组织经过适当
干燥处理后 ,移至壮苗培养基 ,约 5～7 d 就分化出
芽 ,植株分化频率达 69 %～80 % ,比未经过脱水处
理的愈伤组织植株再生频率提高 2118 %～11815 %
(表 4) 。绿点愈伤组织在培养过程中 ,脱水处理的
愈伤组织分化出芽的时间比对照早 ,生长速度也较
快。部分绿点愈伤组织仅分化出根 ,不久愈伤组织
变褐 ,死亡。
表 4 绿点愈伤组织干燥处理对分化率的影响
Table 4 Effect of desiccation of callus with green
spot on differentiation rate
处理
Treatment
分化率 Differentiation rate ( %)
优 99
You 99
明恢 86
Minghui 86 R527
未干燥处理
CK 6517 ±1511 3 3114 ±1517 4816 ±1017
干燥处理
Desiccation 8010 ±1613 6816 ±1017 7711 ±1318
　注 : 3 均值±标准差。Note : 3 Mean ±S E (standard error) 1
215 　高频植株再生体系的验证
基因型是决定高效绿苗再生体系的内在因素 ,
挑选生理状况良好的胚性愈伤组织、分化培养基中
添加一定浓度的 ABA、分化前将愈伤组织适当干燥
处理均为影响高效绿苗再生体系的重要外界因素。
将这些因素综合考虑 ,优化实验条件 ,愈伤组织的分
化率会大幅提高。本研究建立了明恢 81、优 99、
R527、N175、航 1 号等 5 个籼稻品种成熟胚愈伤组织
高频植株再生体系 ,这些品种平均诱导率、分化率和
移栽成活率分别达 90 %、85 %、95 %以上 (表 5) 。该
实验已形成模式化操作程序 ,重演性很好 ,为这 5 个
品种的外源基因遗传转化提供了良好的植株再生体
系。本实验室正沿用此套植株再生体系技术开展水
稻遗传转化研究。
表 5 高效愈伤组织诱导率和植株再生频率
Table 5 High frequency of callus induction and plant regeneration
品种
Cultivar
诱导率
Induction rate
( %)
分化率
Differentiation rate
( %)
成活率
Survival rate
( %)
明恢 81
Minghui 81 9617 ±4108 3 9018 ±9100 9718
优 99 You 99 9410 ±5116 8912 ±7193 10010
R527 9313 ±5156 8815 ±1013 9518
N175 9117 ±6145 8813 ±9137 9617
航 1 号
Hang No11 9217 ±5163 8715 ±8166 9614
　注 : 3 均值±标准差。Note : 3 Mean ±S E(standard error) .
3 　讨论
加入适当浓度的 ABA ,可促进胚性愈伤组织的
形成及胚状体发生 ,还能促进正常胚发育 ,抑制胚的
提早萌发及不正常胚结构的出现 ,提高植株再生
率[4～7 ] 。本试验表明 ,在分化培养基中添加适量的
ABA 能够提高愈伤组织的分化率 ,这与绝大多数学
者研究结果一致[4 ,6 ,7 ] 。有的学者认为 ,在诱导或继
代培养基中加入低浓度的 ABA 对水稻胚性愈伤组
织的诱导及愈伤组织胚性结构的保持有一定促进作
用[5 ,7 ] 。
关于继代次数对植株再生能力的影响 ,许多学
者研究结果有一定差异。本研究结果认为 ,从籼稻
成熟种胚诱导出的初始愈伤组织 ,经过 3 次继代培
养后 ,愈伤组织具有较强的分化能力 ,随着继代次数
的进一步增加 ,分化能力有下降趋势。这与刘传光
等 (2002) [8 ] 研究结果基本一致。但是 ,凌定厚和吉
田昌一 (1987) [5 ] 、马炳田等 (2002) [9 ] 研究报道认为 ,
籼稻成熟胚愈伤组织继代一次分化率最高 ,随着继
代培养时间的延长分化率降低。这种差异可能由于
基因型不同所致 ,或者由于愈伤组织的培养条件不
7521　12 期 高三基等 :影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素 　　　

同 ,导致非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化所需
继代培养时间不同。我们研究发现 ,愈伤组织继代
3 次后 ,颗粒状、质地坚硬的胚性愈伤组织形成量迅
速增多 ,而初始愈伤组织和继代 1～2 代的愈伤组织
成团 ,分散的颗粒状胚性愈伤组织较少。随着继代
次数的增加 ,愈伤组织分化率随之降低。这可能因
为在继代培养过程中 ,愈伤组织的生活力下降 ,具有
体细胞胚发生能力的细胞比例减少 ,导致愈伤组织
分化率的减低[9 ] ;或者由于培养时间延长会使愈伤
组织在细胞分裂进程中发生染色体变异的可能性增
大 ,形态发生潜力减弱甚至丧失[10 ] ;或者因为随着
愈伤组织继代次数的增加 ,二胺 ( PUT) 积累和较高
的二胺与亚精胺 ( PUTΠSPD) 比率使细胞老化 ,未成
熟胚向成熟胚的转变受阻[11 ] 。
本研究结果表明 ,对愈伤组织的干燥处理能够
明显提高愈伤组织分化能力。这与前人研究结果一
致[9 , 12～15 ] 。干燥脱水程度掌握在愈伤组织脱水
50 %左右 ,此时愈伤组织表面干缩 ,稍微变白。愈伤
组织干燥处理促进愈伤组织芽的分化 ,其作用机理
目前尚未清楚 ,有待进一步研究。
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