全 文 ：第28卷 第2期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 2
2002 年3月　 282～ 285页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 282～ 285　M ar. , 2002
玉米自交系愈伤组织的诱导、RAPD 分析及扫描电镜观察Ξ
杜　娟　常国权　季　静　王　罡
(中国人民解放军军需大学植物基因工程研究中心, 吉林长春, 130062)
摘　要　以玉米不同自交系的幼胚为材料, 用诱导培养基进行培养, 以获得愈伤组织。结果发现所有自交系幼胚均可
诱导出白色或黄白色的愈伤组织, 但其再生能力差异显著, 这主要取决于基因型和培养基种类。自交系7922、340幼胚
的再生频率高达85. 5% 和78%。植株再生途径也有所不同, 8902、M o17、4112和846以器官发生途径为主, 340、7922、
921、853和835以体胚发生途径为主。经长期继代的愈伤组织失去再生能力。通过RA PD 方法发现不同愈伤组织的基因
组之间存在差异。通过扫描电镜观察发现玉米体胚发生有两种情况: 一是直接诱导产生胚性愈伤组织和胚状体; 二是
经过多次继代获得胚胎发生。
关键词　玉米自交系; 组织培养; 再生植株; RA PD; 扫描电镜
中图分类号: S513　　　文献标识码: A
Observa tion with Scann ing Electron M icroscope and Ana lysis of RAPD on Tissue
Culture and Embryogenesis of Inbreds of Zea m ays L.
DU Juan　CHAN G Guo2Q uan　J I J ing　WAN G Gang
(R esearch Center f or P lant Genetic E ng ineering , T he Q uarterm aster U niversity of PL A , 130062, Changchun, J ilin, China)
Abstract　 Imm ature em bryos of differen t m aize inbreds w ere cultured in induced m edium. A ll types fo rm ed
pale2yellow to yellow callus on the m edium. R esults indicated that p lan t regeneration w as ch iefly con tro lled by
geno types and k inds of m edium. T he rate of regeneration fo r inbreds 7922 and 340 w as 85. 5% and 78%
respectively. T here are differen t w ays in the regeneration, and 8902, M o17, 4112 and 846 tended to
regenerate via o rganogensis, w h ile 340, 7922, 921, 853 and 835 w ere likely to regeneration via som atic
em bryogenesis. Som e calli lo st their capacity of em bryogenesis during long2tim e subculture. T he results of
random ly amp lified po lymorph ic DNA (RA PD ) show ed that the genom ic DNA w as modified in tissue culture.
Two patterns of m aize som atic em bryogenesis w ere found by observation w ith scann ing electron m icroscope.
O ne w as induced directly from imm ature em bryo, and the o ther p roduced em bryo ids after subculturing several
tim es.
Key words　M aize; Inbred line; T issue culture; P lan t regeneration; RA PD; E lectron m icroscope
　　1975年, Green 和 Ph illip s[ 1 ]用玉米幼胚做外植
体, 诱导出二倍体愈伤组织, 首次获得再生植株。
随着体细胞培养技术的不断改进, 目前已经能从幼
穗[ 2 ]、芽顶端分生组织[ 3 ]、叶片[ 4 ]、花药[ 5 ]等诱导愈
伤组织并再生植株, 其中幼胚是最易诱导也是目前
使用最多的外植体[ 6～ 8 ]。本研究的目的是利用优良
玉米自交系的幼胚, 试图筛选出高频再生的自交系
做为转基因的受体材料。用RA PD 方法分析玉米愈
伤组织培养过程中基因组DNA 的变化, 并采用电
镜技术对玉米体细胞胚胎的形成过程和形态特征进
行研究, 为建立玉米自交系组织培养高效再生及转
化体系提供理论依据。
1　材料和方法
1. 1　实验材料
取授粉 12～ 14 d 的玉米自交系 340、7922、Ξ 基金项目: “国家植物转基因中试及产业化基地”专项课题 (项目编号 J992B2001)。
作者简介: 杜娟 (19662) , 女 (汉) , 吉林长春人, 助理研究员, 学士学位, 专业方向: 植物基因工程。
Received on (收稿日期) : 2000212204, A ccep ted on (接受日期) : 2001203223

8902、4112、M o17、846、吉921、吉853、477和444
幼雌穗, 剥去苞叶, 在超净工作台用75% 的酒精棉
球表面擦洗消毒, 再用0. 1% 氯化汞浸泡消毒10
m in, 无菌水洗3～ 5次, 挑取果穗中部大小约1～ 2
mm 的幼胚接种在诱导培养基上。
1. 2　基因组D NA 的提取
340幼胚诱导的É 型、Ê 型、Ë 型及长期继代失
去分化能力的老化愈伤组织液氮冷冻研磨。参照
L ich ten2stein 和 P raper (1985)方法提取DNA [ 9 ]。
1. 3　随机扩增多态D NA (RAPD )
(1) 随机引物O PC l～ 20 (上海细胞所癌基因研
究所)。 (2) PCR 反应体系: 2 molöL 的 dN T P 1ΛL , 引物2 ΛL , 10×PCR 缓冲液1 ΛL , T aq DAN 聚
合酶0. 5 U , 1 ΛgöΛL 的模板DNA 1 ΛL 加水至反应
总体积25 ΛL。 (3) 扩增反应: 94℃ 3 m in; 94℃ 1
m in; 38℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 45个循环; 72℃ 10
m in。 (4) 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色,
紫外分析。
1. 4　电镜观察
取不同培养时间的愈伤组织和发育时期胚状体
用2. 5% 戊二醛固定24 h, 0. 13 molöL 磷酸缓冲液
冲洗2～ 3次, 每次10分钟, 1% 锇酸固定1 h, 50%、
70%、80%、90%、100% 乙醇系列脱水每次10分
钟, 乙酸异戊脂置换, 真空干燥, 离子溅射镀金,
最后用 S570型扫描电镜在10KV 下观察和摄影。
2　结果与分析
2. 1　不同基因型玉米自交系愈伤组织诱导率比较
340等10种玉米自交系幼胚接种在诱导培养基
上均可以诱导出白色或黄白色初始愈伤组织 (图版
A ) , 两周后统计诱导率为100% (表1)。用同样的培
养基继代结果发现愈伤组织状态不同, 340、7922、
吉921、4112易形成黄色颗粒状的胚性愈伤组织 (图
版 C) , 340、7922胚性愈伤组织诱导率分别为75.
5% 和63. 3%。7922的愈伤组织可以继代一年仍保
持胚性并再生绿苗, 340、8902、4112的愈伤组织可
以继代6～ 8个月, M o17、477、846和吉853的愈伤
组织继代后胚性诱导率分别为56. 3%、58. 5%、
25. 6% 和20. 4% , 继代6个月以上失去分化能力,
吉921的愈伤组织只能继代2个月, 444的初始愈伤
继代一次后就开始褐化死亡 (图版D )。将胚性愈伤
组织转入分化培养基, 7922的再生频率达85. 5% ,
444的再生频率仅为0. 4%。绿芽长成6 cm 左右的小
苗, 将其基部与愈伤组织分离, 移入生根培养基,
植株基部形成发达的根系后, 可移栽入土壤。
表1　不同基因型玉米自交系诱导及再生率比较
Table 1　Compar ison of the induced and regeneration percentages
from immature embryo of ma ize inbreds
基因型
Inbred
接种幼胚数
No. of imm ature
em bryo
出愈率%
Percen tage
of callus
胚性愈伤组织率%
Percen tage of
em brogenic calli
再生频率%
Percen tage of
regeneration
340 200 100 75. 5 78. 0
7922 200 100 63. 2 85. 5
M o17 200 100 56. 3 62. 3
4112 200 100 51. 2 53. 4
8902 200 100 67. 3 57. 4
846 200 100 25. 6 37. 5
477 200 100 58. 5 46. 8
吉853 200 100 20. 4 10. 6
吉921 200 100 43. 4 32. 4
444 200 100 1. 4 0. 4
　注: 诱导及继代培养基: 改良M S (大量) + B 5 (微量) + 2, 42D 2 m göL (单位
下同) + 干酪素500+ 脯氨酸400+ 5%蔗糖+ 7 göL 琼脂; 分化培养基;
N 6+ 2, 42D 0. 25+ NAA 0. 1+ 62BA 1. 0+ IAA 0. 1+ 3% 蔗糖+ 7 göL
琼脂; 生根培养基: 1ö2M S+ 62BA 0. 4+ NAA 0. 4+ IAA 2. 0+ 1. 5%
蔗糖+ 7 göL 琼脂; pH 5. 8, 培养基121℃灭菌20 m in。
2. 2　不同培养基对玉米幼胚愈伤组织诱导和芽苗
形成的影响
将不同玉米自交系诱导的黄白色初始愈伤组织
转接到表2的培养基中, 结果发现在2, 42D 浓度相
等而大量与微量元素改变的情况下, 诱导的愈伤组
织状态截然不同。基本成分采用M S 的培养基诱导
的愈伤组织为白色的É 型愈伤组织, 生长速度慢,
可培养性差 (图版B) ; 部分É 型愈伤组织转入继代
培养基后能分化出绿苗, 但这些多为白化、畸形
苗; É 型愈伤组织转入继代培养基超过一个月后,
这种愈伤组织变成了形似鸡爪或绵软如絮、水积样
失去分化能力的Ë 型愈伤组织。基本成分采用M S
大量和B 5微量的改良培养基为最佳配方, 多数愈伤
形成色泽淡黄、松散、颗粒状的Ê 型愈伤组织 (图
版C) , 愈伤组织表面长出黄色颗粒状的体细胞胚,
从白色盾片下抽出绿芽, 类似于种子萌发的过程;
通过体胚发生途径再生绿苗如340、7922、吉921、
吉853和477等。N 6大量加B 5微量的培养基次之。降
低2, 42D 浓度易产生胚状体 (图版 F)。若去掉2, 42D
附加62BA 愈伤组织表面直接长出绿芽点, 通过器
官发生途径再生绿苗, 如8902、M o17和4112等。改
良M S+ B 5+ 62BA 2～ 4+ NAA 2+ IAA 0. 1胚状体可
分化成完整植株 (图版 E)。
3822期　　　　　　　　　　杜　娟等: 玉米自交系愈伤组织的诱导、RA PD 分析及扫描电镜观察　　　　　　　　　　　

表2　不同培养基对玉米幼胚愈伤组织诱导和芽苗形成的影响
Table 2　Effects of media on cal lus induction
and shoot formation in ma ize
培养基
M edium
愈伤数
No. of callus
incubated
不同愈伤组织比较
Comparison of the
differen t callus
M S+ 2, 42D 2 m göL 150 É、Ë 型愈伤组织长期继代老化死亡
N 6+ 2, 42D 2 m göL 150 Ê 与É、Ë 型愈伤组织混合在一起
N 6 (大量) + B 5 (微量) 150 Ê 与Ë 型愈伤组织Ê 型占大多数
+ 2, 42D 2 m göL
改良M S (大量) + B5 (微量) 150 Ê 型愈伤组织
+ 2, 42D 2 m göL
改良M S (大量) + B5 (微量) 150 胚状体
+ 2, 42D 0. 5+ 62BA 2 m göL
改良M S (大量) + B5 (微量) 150 分化成完整植株
+ 62BA 2～ 4+ NAA
2+ IAA 0. 1 m göL
图1　O PC27、O PC213扩增M. DNA 标准分子量
1, 2, 3, 4: O PC27扩增的É、Ê、Ë 型和老化的愈伤组织;
5, 6, 7, 8: O PC213扩增的É、Ê、Ë 型和老化的愈伤组织。
F ig. 1　Amp lification of genom ic DNA s
using p rim er O PC27, O PC213
M. DNA molecular w eigh t m arker, 1, 2, 3, 4: O PC27:É , Ê , Ë type and A ging em bryogenic callus;
5, 6, 7, 8: the É , Ê , Ë type and A ging em bryogenic
callus amp lified by p rim er O PC213.
2. 3　随机扩增多态D NA (RAPD )
随机扩增多态 DNA (RA PD ) 的方法是由
W illiam s 等[ 10 ] (1990) 建立的一种分析DNA 差异的
方法。本实验从340的É、Ê、Ë 型和继代6个月失
去分化能力的老化愈伤组织中提取基因组DNA ,
用随机引物O PC21～ 20进行扩增, 退火温度38℃,
产生一系列的DNA 指纹, 比较四种扩增产物之间
(扩增产物大小为0. 8～ 2. 0 kb) 的差异, 发现O PC2
7扩增的电泳结果中, É 型愈伤组织四条带、Ê 型
愈伤组织三条带、Ë 型愈伤组织五条带、老化的愈
伤组织六条带。O PC213扩增的电泳结果中, É 型愈
伤组织四条带、Ê 型愈伤组织三条带、Ë 型愈伤组
织四条带、老化的愈伤组织四条带 (见图1)。该结
果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 玉米细胞的
DNA 发生了变异, 而自交系正常再生植株 RA PD
未见异常。
2. 4　不同愈伤组织的电镜观察
本实验的10种玉米自交系均不同程度地获得了
体胚发生和再生植株, 不同自交系之间体胚发生的
能力不同。主要表现在 (1) 直接胚胎发生即在诱导
培养基直接产生胚性愈伤组织和胚状体, 扫描电镜
下观察由多细胞构成、呈圆球状、大小近乎相等的
多细胞团, 细胞之间结合紧密, 几乎看不到空隙—
胚状体 (图版 F ) , 340、7922和M o17的幼胚诱导可
见这种类型的胚状体, 将其转入表1的分化培养基
上, 生长较快, 一端向上伸出胚芽鞘, 一端向下伸
出根, 形成小植株, 通过该途径植株再生频率高、
周期短 (图版É )。 (2) 间接胚胎发生即在诱导培养
基先诱导愈伤组织经过多次继代才获得胚胎发生,
愈伤组织增殖的同时产生球形的胚性细胞 (图版
G) , 随着继代时间的延长, 胚性细胞形成多种类型
的胚状体, 再生频率低、周期长易分化畸形苗。胚
性愈伤组织老化后形成非胚性愈伤组织, 细胞排列
无序, 细胞结构不明显, 无细胞团或球形细胞 (图
版 H )。通过扫描电镜观察我们发现在玉米的组织
培养中, 胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织同时存
在, 诱导的初期这种共存的形式就已形成 (图版
A ) , 由于长期培养非胚性愈伤组织快速增殖会抑
制胚性愈伤组织的生长, 因此在以后的培养中应缩
短继代时间和培养周期。
3　讨论
本试验中10个玉米自交系的幼胚均诱导出初始
愈伤组织, 说明玉米诱导愈伤组织的能力较普遍,
但随着继代时间的延长不少材料愈伤组织褐化死
亡。不同的玉米自交系在同样的培养条件下, 愈伤
组织的诱导和芽苗的形成差异显著。通过改变培养
条件可提高其再生能力。本实验中7922、340的再
生频率高达85. 5% 和78% , 且多为体细胞胚发生,
适于用作玉米遗传转化的受体材料。愈伤组织长期
继代后出现了不同类型, RA PD 分析表明其基因组
DNA 发生了变异。F lum inhan 等 (1996) [ 11 ]曾用细
胞学方法观察到玉米愈伤组织在培养过程中有染色
体断裂的现象, 组织培养过程中的自发的体细胞突
变可能与DNA 的甲基化以及染色体重排有关。本
实验初步尝试用 RA PD 的方法研究愈伤组织的基
因组变异现象, 有助于进一步探索植物组织培养和
体细胞分化的分子机理。扫描电镜观察玉米愈伤组
482　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28卷

织主要通过两种方式再生: 一是直接胚胎发生, 通
过该方式可再生完整植株, 再生频率高, 周期短。
二是间接胚胎发生, 其再生频率低于前者且再生绿
苗多数无根, 需要壮苗生根, 周期长并且分化出畸
形、白化苗。
References
[ 1 ] 　Green C E. Phillip s. R I, P lant Regeneration from T issue
Cultures of M aize. C rop S cience, 1975, 15: 417～ 418
[ 2 ]　L i X2Y (李效宇) , Xu L 2Z (徐龙珠) , Zhang G2F (张根发).
H igh frequency induction of som atic em bryogenesis in young
inflo rescences culture of M aize. A cta B otanica B oreali2
O ccid entalia S inica (西北植物学报) , 1997, 17 (3) : 405～ 409
[ 3 ]　L i X2H (李学红) , Zhang J2R (张举仁). Studies on direct
p roduction of m ale and fem ale inflo rescence by stem tip culture
in M aize. S cience China (Series C) [ (中国科学 (C 辑) ], 1999,
29 (2) : 186～ 193
[ 4 ] 　Ray D S, Ghosh P D. Som atic Em bryogenesis and p lant
Regeneration from Cultured leaf Exp lants of Z ea m ay s L.
A nnals of B otany , 1990, 66: 497～ 500
[ 5 ]　Du J (杜　娟) , MU Q 2H (母秋华) , J ia Y2F (贾玉峰). Studies
on increasing the rate of anther culture induction of M aize by
the m ethod of transform breeding, J ournal of M aize S cience
(玉米科学) , 1999, 7 (3) : 16～ 18
[ 6 ] 　Du J (杜　娟) , Yu Y2Z (余云舟) , Zhang L 2B (张领兵).
Initiation and transform ation of callus Ê of M aize inbred line.
J ournal of J i L in A g ricultural U niversity (吉林农业大学学
报) , 2000, 22 (4) : 41～ 44
[ 7 ] 　 P rio li L M , Sondabl M R. P lant Regeneration from and
Recover of Fertile P lants P ro top lasts of M aize. B loöT ech,
1989, 7 (3) : 589～ 594
[ 8 ] 　Du J (杜　娟) , J i J (季　静) , J ia Y2F (贾玉峰). Study on
imp roved em bryo cell line to inducing regenerative p lant,
J ournal of M aize S cience (玉米科学) , 2000, 8 (增刊) : 3, 28
[ 9 ] 　L ich tenstein C, D raper J. Genetic Engineering of P lant. In:
Glover D M ( ed ). DN A C loning. Vol Ê . O xfoford IRL
P ress, 1985, 67～ 119
[ 10 ] 　W illiam s J G K, A R Kubelilk, K J L ivak. DNA
Polymorphism s Amp lified by A rbitrary P rim ers are U seful as
Genetic M arkers. N ucleic A cid s R es, 1990, 18: 6531～ 6536
[ 11 ] 　 F lum inhan A , De A guitar2perecin MLR, Dos Santos JA ,
Evidence for heterochrom atin involvem ent in chromosom e
breakage in m aize callus culture. A nn B ot, 1996, 78: 73～ 82
5822期　　　　　　　　　　杜　娟等: 玉米自交系愈伤组织的诱导、RA PD 分析及扫描电镜观察