全 文 ：Vol. 29 , No. 5
pp. 693～696 　Sept. , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 5 期
2003 年 9 月 　693～696 页
棉花恢复系的恢复力与花药谷胱甘肽 S 转移酶活性的关系
朱云国　王学德 3 　赵佩欧　倪西源 Ξ
(浙江大学农学系 ,浙江杭州 310029)
摘 　要 　转 gst 基因棉花恢复系“浙大强恢”克服了传统恢复系的恢复力不够强的缺陷 ,用此种恢复系配制的杂种 F1 ,其
花粉育性强 ,杂种优势明显。进一步研究的结果表明 :在造孢细胞增殖、小孢子减数分裂和花粉成熟 3 个时期 ,转基因恢
复系花药中谷胱甘肽 S转移酶 ( GST)活性比受体恢复系花药中的都有极显著提高。与受体恢复系配制的 F1 相比 ,转基
因恢复系配制的 F1 花药中 GST酶活性也有极显著提高。相关性分析表明 ,以“浙大强恢”和“DES2HAF277”为父本配制的
F1 ,其可育花粉率与其小孢子减数分裂时期和花粉成熟时期花药中 GST酶活性呈极显著正相关 ,显示 GST酶对棉花花粉
育性有明显的促进作用。
关键词 　陆地棉 ;细胞质雄性不育 ;转基因恢复系 ;花粉育性 ;谷胱甘肽 S转移酶 ( GST)
中图分类号 : S562 　文献标识码 : A
Relationship between Glutathione S2Transferase Activity of Restorer Anthers and
Pollen Fertility of F1 Hybrid in Upland Cotton
ZHU Yun2Guo 　WANG Xue2De 　ZHAO Pei2Ou 　NI Xi2Yuan
( Department of Agronomy , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 310029 , China)
Abstract 　“Zheda Strong Restorer”, a transgenic restorer developed by transferring Glutathione S2Transferase ( GST) gene
into a restorer DES2HAF277 , had overcome the defect of weak restorability in restorers to cytoplasmic male sterility. When
this transgenic restorer was used as a male parent and crossed with female sterile lines , its hybrids (F1 ) had stronger pollen
fertility and recorded high heterosis. Further study indicated that the GST activity in the anther of the transgenic restorer
and its hybrids were higher obviously than that in the recipient restorer at the stage of sporogenous cell division , microspore
meiosis and pollen maturation. There was a highly significant relationship between the percentage of viable pollens and the
GST activity in the anther of F1 hybrid at microspore meiosis phase and pollen maturation phase , which confirmed that GST
over expression in anther could enhance pollen fertility of F1 hybrid in upland cotton.
Key words 　Upland cotton ; Cytoplasmic male sterility ; Transgentic restorer ; Pollen fertility ; Glutathione S2transferase
( GST)
　　棉花细胞质雄性不育植株自身不能产生花粉
粒 ,但雌配子正常可育。利用棉花细胞质雄性不育
的“三系”配套系统 ,通过蜜蜂等媒介传粉进行棉花
杂种种子的生产 ,可省去人工“去雄”和“授粉”,在棉
花杂种优势利用中具有重要价值。20 世纪 70 年代
美国育成具有哈克尼西棉细胞质的雄性不育系
“DES2HAMS277”,但由于其恢复系“DES2HAF277”的
恢复力不够强 ,一直未能在生产上应用[1 , 2 ] 。王学
德用根癌农杆菌介导法 ,将一个具有抗逆性能的谷
胱甘肽 S 转移酶 ( Glutathione S2transferase , GST) 基因
( gst)导入恢复系“DES2HAF277”,从转化棉株后代中
筛选到一个对不育系具有强恢复力的恢复系 ,命名
为“浙大强恢”。“浙大强恢”对不育系的恢复力比受
体恢复系“DES2HAF277”提高 2518 % ,从而使杂种 F1
单株结铃数多 316 个 ,不孕籽率降低 1011 % ,皮棉产Ξ基金项目 :国家高技术研究发展计划 (863 计划 , 2001AA212081) ,国家转基因植物研究与产业化开发专项 (J002B2002210) 和国家教育部科研
基金 (重大 0114)资助项目。
作者简介 :朱云国 (1977 - )男 ,浙江长兴人 ,博士生 ,主要从事棉花遗传育种方面的研究。3 通讯作者 :王学德 ,E2mail :xdwang @zju. edu. cn
Received(收稿日期) :2002206206 , Accepted(接受日期) :2003202216.

量提高 1016 %[3 ] 。以基因 gst 作为探针进行的
Southern 和 Northern 核酸杂交分析表明 ,“浙大强恢”
中含有外源基因 gst ,并有高的表达水平[3 ] 。转基因
恢复系“浙大强恢”的育成 ,在理论研究和生产实践
中都具有重要意义。为进一步研究“浙大强恢”外源
gst 基因对不育系育性恢复力提高的作用机制 ,本文
以受体恢复系及其 F1 为对照 ,对转基因强恢复系及
其 F1 花药中的 GST酶活性进行了测定 ,并对其可能
的作用机制进行了探讨。
1 　材料与方法
111 　材料
　　具有哈克尼西棉 ( G. harknessii Brandegee) 细胞
质的雄性不育系 3 个 :DES2HAMS277、中 12A 和抗
A ;恢复系 2 个 :转基因恢复系“浙大强恢”和受体恢
复系“DES2HAF277”;以及用上述不育系和恢复系配
制的杂交组合 6 个。以转基因恢复系“浙大强恢”及
其所配的 F1 的造孢细胞增殖、小孢子减数分裂和花
粉成熟 3 个时期的花药为材料 ,以受体恢复系“DES2
HAF277”及其所配的 F1 相同时期的花药为对照 ,测
定花药中 GST 酶活性。酶活性测定在紫外分光光
度计 BECKMAN DU640 上进行 ,所需的 12氯22 ,42二
硝基苯 (12chloro22 ,42dinitrobenzene ,CDNB) 和还原型
谷胱甘肽 ( Glutathione2SH ,GSH) 等试剂购自 Sigma 公
司。
112 　方法
11211 　GST酶液的制备
早上 6 :00～7 :00 ,摘取转基因恢复系“浙大强
恢”、受体恢复系“DES2HAF277”以及所配的 6 个杂
交组合 (F1 ) 的不同发育时期的花蕾 ,镜检区分出造
孢细胞增殖、小孢子减数分裂和花粉成熟 3 个时期
的花蕾。称取 1 g 花药 ,在液氮中磨碎后 ,加 10 mL
预冷的提取液 [ 011 molΠL Tris2HCl pH 718、015
mmolΠL EDTA、015 mmolΠL 巯基乙醇和 1 % 聚乙烯吡
咯烷酮 (PVP) ]。匀浆 ,于 4 ℃下以 2000 ×g 离心 10
min ,取上清液 ,再以 12000 ×g 离心 10 min ,所得的
上清液供 GST酶活性测定。
11212 　GST酶活性的测定
以 CDNB 为底物 ,按 Habig 等[4 ] 的方法测定 GST
酶活性。反应体系包括 : 30μL 酶提取液 , 019 mL
313 mmolΠL GSH ,1197 mL 100 mmolΠL 的磷酸钾盐缓
冲液 (pH 615) 和 100μL 30 mmolΠL CDNB (溶解在无
水乙醇中) 。加入 CDNB 于波长 340 nm 处读取反应
开始后 90 s 至 120 s 间的光密度增加量。以未加酶
液的为对照。酶活性以每分钟形成 1μmol 产物为
一个酶单位表示。
2 　结果与分析
2. 1 　转基因恢复系与受体恢复系对不育系恢复力
的比较
　　以受体恢复系“DES2HAF277”为对照 ,“浙大强
恢”分别与 DES2HAMS277、中 12A 和抗 A 等 3 个不
育系杂交 ,用甲奈酚2联苯胺染色法[5 ] 统计 6 个组合
的 F1 可育花粉率的结果 (表 1) 显示 ,以“浙大强恢”
为父本与不育系杂交的 F1 的可育花粉率平均达
91132 % ,比 DES2HAF277 为父本的 F1 的平均可育花
粉率高 25185 % ,差异达极显著水平。这与王学德
等报道的结果[1 ]基本一致。“浙大强恢”的恢复力比
受体恢复系有极显著的提高 ,表明 gst 基因对不育
系的育性有促进作用。
表 1 转基因恢复系和受体恢复系在恢复力上的比较
Table 1 Comparison of restorability of transgenic restorer
with recipient restorer
杂交组合
Combinations
总观
察数
Total
可育花
粉粒数
Viable
pollens
可育花
粉率
Viable
pollens
( %)
DES2HAMS277 ×浙大强恢
DES2HAMS277 ×Zheda Strong Restorer 2877 2598 90130
中 12A ×浙大强恢
Zhong 12 A ×Zheda strong restorer 2659 2431 91143
抗 A ×浙大强恢
Kang A ×Zheda Strong Restorer 2977 2745 92121
DES2HAMS277 ×DES2HAF277 2599 1675 64145
中 12A ×DES2HAF277
Zhong 12 A ×DES2HAF277 2914 1913 65165
抗 A ×DES2HAF277
Kang A ×DES2HAF277 2789 1847 66122
浙大强恢所配制的组合 (F)
平均 Combinations with
Zheda Strong Restorer
2837167 2591133 91132
Mean DES2HAF277 所配制的组合 (CK) 2767133 1811167 65147
Combinations with DES2HAF277
F1 - CK - - 25185 3 3
2. 2 　转基因恢复系与受体恢复系花药中 GST酶活
性的比较　
从表 2 可以看出 ,在花药发育过程中 ,转基因强
恢复系“浙大强恢”和受体恢复系“DES2HAF277”花
496 　　　作 　　物 　　学 　　报 29 卷 　

药中 GST酶活性 ,呈先上升后下降的变化趋势。在
小孢子减数分裂时期和花粉成熟时期“浙大强恢”花
药 中 GST 酶 活 性 , 分 别 为 012929 和 011899
μmolΠmin·g FW ,是造孢细胞增殖时期 (01141μmolΠ
min·g FW) 的 2108 和 1135 倍。而“DES2HAF277”花
药 GST酶的活性 ,则分别为 011731 和 010991μmolΠ
min·g FW ,是造孢细胞增殖时期 (011089μmolΠmin·g
FW)的 1159 和 0191 倍。从表 2 还可以看到 ,转基因
恢复系“浙大强恢”花药中 GST酶活性 ,在造孢细胞
增殖、小孢子减数分裂和花粉成熟时期比受体恢复
系的分别提高 29148 %、69121 %和 91162 % ,都达到
了极显著水平。这表明在花药发育过程中“浙大强
恢”和“DES2HAF277”的花药中 gst 基因的表达量是
先上升后下降。与受体恢复系“DES2HAF277”相比 ,
在造孢细胞增殖、小孢子减数分裂和花粉成熟 3 个
时期“浙大强恢”花药中 gst 基因的表达量 ,都有极
显著提高 ,且提高的幅度呈递增趋势。
表 2 转基因恢复系与受体恢复系花药间 GST酶活性的比较
Table 2 Comparison of GST activity in the anthers of
transgenic restorer with recipient restorer
恢复系
Restorer
不同发育时期花药中的 GST酶活性
GST activities of anthers at different
developmental stages (μmolΠmin·g FW)
造孢细胞
增殖时期
Sporogenous
cell division
stage
小孢子减数
分裂时期
Microspore
meiosis
stage
花粉成熟时期
Pollen
maturation
stage
浙大强恢
Zheda Strong Restorer
01141 012929 011899
DES2HAF277(CK) 011089 011731 010991
比 CK增加 ( %)
Increase based on CK 29148 3 3 69121 3 3 91162 3 3
2. 3 　转基因恢复系与受体恢复系所配制的 F1 花药
间 GST酶活性的比较
以转基因恢复系“浙大强恢”和受体恢复系
“DES2HAF277”为父本分别与 3 个不育系 DES2
HAMS277、中 12A 和抗 A 杂交 ,测定不同发育时期 6
个 F1 组合花药中 GST酶活性的结果表明 ,与它们的
父本一样 ,在花药的发育过程中 F1 花药的 GST酶活
性呈先上升后下降的趋势。其中 ,以“浙大强恢”为
父本的 F1 花药的 GST 酶活性在小孢子减数分裂和
花粉成熟时期平均为 012832 和 011869μmolΠmin·g
FW ,分别是造孢细胞增殖时期 (平均为 01138μmolΠ
min·g FW) 的 2105 和 1135 倍。而以“DES2HAF277”
为父本的 F1 花药的 GST 酶活性在小孢子减数分裂
和花粉成熟时期平均为 011626 和 010936μmolΠmin·
g FW ,分别是造孢细胞增殖时期 (平均为 011061
μmolΠmin·g FW) 的 1153 和 0188 倍。从表 3 中还可
以看到 ,在造孢细胞增殖、小孢子减数分裂和花粉成
熟时期 ,以“浙大强恢”为父本的 F1 花药的 GST酶活
性比以受体恢复系“DES2HAF277”为父本的 F1 花药
的 GST 酶活性分别增加了 30137 %、74117 % 和
99168 % ,都达到了极显著水平。这表明 ,同父本一
样 ,在造孢细胞增殖、小孢子减数分裂和花粉成熟 3
个时期“浙大强恢”的 F1 花药中 gst 基因的表达量
比“DES2HAF277”的 F1 都有极显著提高 ,且提高的
幅度呈递增趋势。从表 2 和表 3 还可看到 , 在造孢
表 3 转基因恢复系与受体恢复系所配
制的 F1 花药间 GST酶活性的比较
Table 3 Comparison of GST activity in the anthers of F1
hybrid from produced by transgenic restorer with recipient restorer
杂交组合
Combination
不同发育时期花药中的 GST
酶活性 (μmolΠmin·g FW)
GST activities of anthers at
different developmental stages
造孢细胞
增殖时期
Sporogenous
cell division
stage
小孢子减数
分裂时期
Microspore
meiosis
stage
花粉成
熟时期
Pollen
maturation
stage
DES2HAMS277 ×浙大强恢
DES2HAMS277 ×Zheda Strong Restorer 011377 01283 011867
中 12A ×浙大强恢
Zhong12 A ×Zheda Strong Restorer
011378 012832 011868
抗 A ×浙大强恢
Kang A ×Zheda Strong Restorer
011385 012834 011871
DES2HAMS277 ×DES2HAF277 011059 011625 010934
中 12A ×DES2HAF277
Zhong12 A ×DES2HAF277 01106 011626 010935
抗 A ×DES2HAF277
Kang A ×DES2HAF277 011064 011627 010938
浙大强恢所配制的组合 (F1)
Combinations(F1) with Zheda
Strong Restorer
01138 012832 011869
平均
Mean
DES2HAF277 所配制的组合 (CK)
Combinations(CK) with
DES2HAF277 011061 011626 010936
F1 比 CK增加 ( %)
F1 increases over CK
30107 3 3 74117 3 3 99168 3 3
596　5 期 朱云国等 : 棉花恢复系的恢复力与花药谷胱甘肽 S转移酶活性的关系 　　　

细胞增殖、小孢子减数分裂和花粉成熟 3 个时期父
本花药中 gst 基因的表达量虽然比它们同时期 F1
花药中 gst 基因的表达量高一些 (平均高出
3156 %) ,但都没达到显著水平。相关分析表明 ,以
“浙大强恢”和“DES2HAF277”为父本配制的 F1 ,其可
育花粉率与其造孢细胞增殖、小孢子减数分裂和花
粉成熟 3 个时期花药中的 GST酶活性的相关系数分
别为 01871、01994 和 01926 与 01860、01980 和 01918 ,
达显著或极显著水平。这表明 ,以“浙大强恢”和
“DES2HAF277”为父本配制的 F1 ,其可育花粉率与其
小孢子减数分裂时期和花粉成熟时期花药中的 GST
酶活性极显著正相关 ,与其造孢细胞增殖时期花药
GST酶的活性显著正相关。
3 　讨论
正常情况下 ,生物体内活性氧的产生和清除呈
平衡状态 ,活性氧维持一个很低的浓度水平。已有
报道指出 ,植物细胞质雄性不育与线粒体基因的突
变有关[6 ,7 ] ,线粒体基因突变常会引起线粒体呼吸电
子传递链的结构与功能异常 ,以致活性氧大增。过
量的活性氧对生物体有一系列的毒害作用 ,如进攻
多聚不饱和脂肪酸可引起脂质过氧化 ,导致生物膜
结构和功能的改变 ;损伤蛋白质的巯基 (2SH)和氨基
可使蛋白质变性、交联 ,使酶的活性丧失 ;损伤 DNA
可导致细胞突变。活性氧还会损伤线粒体的结构和
功能 ,引起线粒体结构迅速膨胀 ,氧化磷酸化效率降
低和细胞色素氧化酶 (COD) 活力下降。在植物不同
细胞中 ,雄性细胞 (花粉) 对线粒体结构和功能失调
的反应最为敏感 ,故线粒体结构和功能的失调常会
导致花粉育性下降 ,乃至不育。
谷胱甘肽 S 转移酶 ( GST) 具有多种生理功能 ,
它在植物解毒和防御活性氧伤害中有重要作用 ,其
主要功能之一是能提高植物细胞膜的修复能力 ,在
基因工程中常用于提高植物的抗逆能力[8 ] 。棉花细
胞质雄性不育系的线粒体基因也会发生突变[9 ,10 ] 。
以前的细胞形态学观察表明 ,棉花细胞质雄性不育
系的败育是在造孢细胞增殖至减数分裂时期[10 ] 。
本文结果再次表明 ,在造孢细胞增殖、小孢子减数分
裂和花粉成熟 3 个时期 ,“浙大强恢”花药的 GST酶
活性比“DES2HAF277”有提高 ,以“浙大强恢”为父本
的 F1 花药中 GST酶活性也比以“DES2HAF277”为父
本的 F1 有所增加。这表明 gst 基因在转基因强恢
复系及其 F1 的花药中呈高效表达。因此可以推测 ,
转 gst 基因恢复系“浙大强恢”对不育系育性恢复力
的提高 ,是通过提高杂种 F1 花药中 gst 基因表达来
增加杂种 F1 花药中 GST 酶活性的 ,因而杂种 F1 花
药细胞 (特别是生殖细胞)中清除活性氧和膜修复能
力提高 ,活性氧对生殖细胞的损伤减弱 ,杂种 F1 花
粉粒的育性提高 ,杂种 F1 的结铃性提高 ,不孕籽率
降低 ,最终促进杂种优势的高效表达。
转基因强恢复系的育成对棉花杂种优势的大面
积利用 ,以及促进棉花种子产业化进程具有重要意
义。转基因恢复系“浙大强恢”对不育系育性恢复力
提高机理的研究 ,不仅可以为“浙大强恢”的田间表
现提供理论依据 ,而且还有助于加深对细胞质雄性
不育机理和恢复机制的认识 ,进而为更好地利用细
胞质雄性不育提供新的思路。
References
[1 ] 　Wang X2D (王学德) , Li Y2Y(李悦有) . Development of transgenic
restorer of cytoplasmic male sterility in upland cotton. Scientia Agricul2
tura Sinica (中国农业科学) , 2002 ,35(2) :137 —141
[2 ] 　Wang X2D(王学德) ,Zhang T2Z(张天真) ,Pan J2J (潘家驹) . Cyto2
plasmic effects of cytoplasmid male sterile upland cotton. Acta Agro2
nomica Sinica (作物学报) ,1997 ,23(4) :393 —399
[ 3 ] 　Yu Z2H(俞志华) ,Wang X2D(王学德) . Study on and improvement of
male sterility in cotton , Acta Gossypii Sinica (棉花学报) , 1999 ,11
(5) :268 —274
[4 ] 　Habig W H , Pabst MJ , Jakoby W B. Glutathione S2transferases. The
first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Bio2
logical Chemistry , 1974 ,249 (22) : 7130 —7139
[5 ] 　Research Group of Cotton and Wheat of Huanggang Campus of Hua2
zhong Agricultural Academy(华中农学院黄冈分院棉麦组) . Men2
suration viability of cotton pollen by different pigmentation methods.
Heredity and Breeding (遗传与育种) ,1977 , (5) :35 —36
[6 ] 　Hanson M R. Plant mitochondrial mutation and male sterility. Annual
Reviews of Genetics , 1991 ,15 :988 —991
[7 ] 　Wang X2D(王学德) , Zhu Y2G(朱英国) . mRNA differential display
between sterile and fertile anther of rice and analysis of cDNA differen2
tial fragments. Science in China (Series C) , 1998 ,41(2) : 217 —224
[8 ] 　Roxas V P. Overexpression of glutathione S2transferaseΠglutathione per2
oxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during
stress , Nature Biotechnology , 1997 ,15 :988 —991
[9 ] 　Wang X2D(王学德) . Analyses of mitochondrial protein and DNA from
cytoplasmic male sterile cotton. Acta Agronomica Sinica (作物学报) ,
2000 ,26(1) :35 —39
[10 ] 　Wang X2D(王学德) ,Zhang T2Z(张天真) ,Pan J2J (潘家驹) . Cyto2
logical observation of microsporogenesis and RAPD analysis of mito2
chondrial DNAs for cytoplasmic male sterile cotton lines. Scientia Ag2
ricultura Sinica (中国农业科学) ,1998 ,31(2) :70 —75
696 　　　作 　　物 　　学 　　报 29 卷