全 文 ：大型经济真菌的 DNA条形码研究———以我国剧毒鹅膏为例*
蔡摇 箐, 唐丽萍, 杨祝良**
(中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学院重点实验室, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 鹅膏属 (Amanita) 部分物种为重要食用真菌, 而另外部分物种则是剧毒的, 在我国及其他许多国
家, 每年都有因误食剧毒鹅膏而导致中毒甚至死亡的事件发生。 DNA 条形码是用一段或几段短的 DNA 序
列来对物种进行快速、 准确鉴定的方法。 本研究选取三个候选片段, 即核糖体大亚基 (nLSU)、 内转录间
隔区 (ITS) 和翻译延长因子 1鄄a( tef1鄄琢), 使用真核生物通用引物, 测试我国已知的 7 种剧毒鹅膏及 2 种
易混的可食鹅膏, 并将欧美分布的但与黄盖鹅膏 (A. subjunquillea) 亲缘关系密切的绿盖鹅膏 (A. phal鄄
loides) 纳入分析中。 nLSU的 PCR扩增和测序成功率均为 100% , 但种内和种间遗传变异偶有重叠。 ITS
的 PCR扩增和测序成功率分别达到 100%和 85. 7% , 且具有高的种间变异和低的种内变异。 tef1鄄琢的 PCR
扩增和测序成功率分别达到 85. 7%和 100% , 种间和种内遗传分化均高于 ITS和 nLSU。 三个片段的物种分
辨率均较高, 但与 nLSU相比, ITS和 tef1鄄琢具有更为明显的 barcode gap。 鉴于 ITS可能会成为真菌界的通
用条码, 故建议将 ITS作为鹅膏属的核心条形码, tef1鄄琢和 nLSU作为该属的辅助条形码。
关键词: DNA条形码; 食用野生蘑菇; 真菌; 毒蘑菇; 物种识别
中图分类号: Q 523, Q 949摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)06-614-09
DNA Barcoding of Economically Important Mushrooms:
A Case Study on Lethal Amanitas from China
CAI Qing, TANG Li鄄Ping, YANG Zhu鄄Liang**
(Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: Some species of the genus Amanita are economically important gourmet mushrooms, while others cause
dramatic poisonings or even deaths every year in China and in many other countries. A DNA barcode is a short seg鄄
ment or a combination of short segments of DNA sequences that can distinguish species rapidly and accurately. To
establish a standard DNA barcode for poisonous species of Amanita in China, three candidate markers, the large
subunit nuclear ribosomal RNA (nLSU), the internal transcribed spacer (ITS), and the translation elongation fac鄄
tor 1鄄alpha ( tef1鄄琢) were tested using the eukaryotic general primers for their feasibility as barcodes to identify sev鄄
en species of lethal fungi and two species of edible ones which can easily be confused with the lethal ones known
from China. In addition, A. phalloides—a European and North American species closely related to one of the seven
taxa, A. subjunquillea was also included. PCR amplification and sequencing success rate, intra鄄 and inter鄄specific
variation and rate of species identification were considered as main criteria for evaluation of the candidate DNA bar鄄
codes. Although the nLSU had high PCR and sequencing success rates (100% and 100% respectively), occasional
overlapping occurred between the intra鄄 and inter鄄specific variations. The PCR amplification and sequencing success
rates of ITS were 100% and 85. 7% respectively. ITS showed high sequence variation among species group and low
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (6): 614 ~ 622
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 12140
*
**
基金项目: 国家科技部科技基础工作专项项目; 国家高科技研究发展计划 (863 计划) (2012AA021801); 中国科学院大科学装
置开放研究项目 (2009鄄LSF鄄GBOWS鄄01)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: fungi@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2012-11-05, 2012-11-09 接受发表
作者简介: 蔡摇 箐 (1986-) 女, 在读博士生, 主要从事大型经济真菌的多样性与分子进化研究。 E鄄mail: caiqing223@ yahoo. com. cn
variation within a given species. There was a relatively high PCR amplification and sequencing success rate for tef1鄄
琢 (85. 7% and 100% respectively), and its intra鄄 and inter鄄specific variation was higher than that of ITS or nLSU.
All three candidate markers showed hight species resolution. ITS and tef1鄄琢 had a more clearly defined barcode gap
than nLSU. Our study showed that the tef1鄄琢 and nLSU can be proposed as supplementary barcodes for the genus
Amanita, while ITS can be used as a primary barcode marker considering that the ITS region may become a univer鄄
sal barcode marker for the fungal kingdom.
Key words: DNA barcoding; Edible wild mushrooms; Fungi; Poisonous mushrooms; Species recognition
摇 DNA条形码 (DNA barcoding) 是一种基于
DNA序列进行生物物种鉴定的技术, 即利用标
准化的一个或几个 DNA 片段进行序列分析, 根
据核苷酸序列差异, 实现快速和准确地鉴定物
种 (Hebert 等, 2003a; Kress 和 Erickson, 2007;
Hollingsworth, 2011; Schoch 等, 2012)。 该技术
已被用于物种的鉴定和新种的发现 (Hebert 等,
2004; Newmaster 等, 2008; Liu 等, 2011) 以及
生物多样性评估和植物群落监测 ( Lahaye 等,
2008; Valentini等, 2009) 等领域。 DNA 条形码
具有以下优点: (1) 生物体各个发育阶段的组织
块都可用于鉴定, 而不需要传统分类学要求的
“典型标本冶; (2) 不受生态环境引起的形态差
异影响; (3) 不太多依赖分类学专家对专科专属
长期积累的实践经验; (4) DNA 核苷酸序列易
于数字化和构建数据库, 能提供明确的信息, 也
便于网络化和大众化 ( www. barcoding. si. edu /
PDF / TenReasonsBarcoding. pdf)。
与动植物相比, 真菌的 DNA 条形码研究起
步相对较晚 (Eason 等, 2004; Seifert 等, 2007;
王文婧等, 2009; 刘淑艳等, 2012)。 筛选通用性
高、 序列质量好、 物种分辨率高的 DNA 条形码
候选片段是问题的关键, 已成为真菌条形码研究
的首要任务之一。 在真菌中, ITS 序列被广泛应
用于系统发育研究中。 基于真菌的特点和研究现
状, Rossman (2007) 总结了 ITS 序列在真菌
DNA条形码中应用的可能性, 并建议在真菌
DNA条形码研究中采用多片段联合分析的方法,
以 ITS进行初步鉴定, 再结合其他基因序列进行
进一步的准确鉴定。 Seifert (2009) 还对其它
DNA片段作为条形码的可能性进行了探讨。 最
近, 多国研究人员合作, 对真菌各大类群 6 个
DNA片段的综合分析发现, 在真菌中 CO1 常含
有大的内含子而不易扩增, 因此不宜作为候选片
段; 与核糖体候选片段相比, 蛋白质编码区
(protein鄄coding gene regions) 虽常具有更高的鉴
定准确率, 但由于 PCR扩增和测序成功率较低,
难以成为真菌的通用条码, 而 ITS 适宜的真菌类
群范围最广, 鉴定的准确率相对较高, 正式建议
将 ITS作为真菌的核心条形码, 而对于某个具体
类群则可加用辅助条形码来鉴定物种 ( Schoch
等, 2012), 但也有学者提出 ITS 有其一定的局
限性 (Kiss, 2012)。
在国际上, 大型经济真菌的 DNA 条形码研
究起步不久 (Mouhamadou 等, 2008; Xu, 2010;
Dentinger等, 2011; Du等, 2012)。 在我国, 真菌
DNA条形码的研究刚刚开始 (Zhao 等, 2011;
Zeng等, 2012)。 鹅膏属 (Amanita Pers. ) 全球已
描述且被承认的有近 500 种, 我国有 80 余个分类
单元 (杨祝良, 2005; Zhang等, 2010)。 该属中既
包括了一些著名的食用菌, 如红黄鹅膏 [A. hemi鄄
bapha (Berk. & Broome) Sacc. ]、 黄棱鹅膏 (俗称
“黄罗伞冶) (A. aff. javanica)、 大白鹅膏 (俗称
“白罗伞冶) (A. aff. princeps)、 隐花青鹅膏 (俗称
“草鸡枞冶) [A. manginiana sensu W. F. Chiu]、 袁
氏鹅膏 (A. yuaniana Zhu L. Yang) 等, 也有一些
剧毒的种类, 如黄盖鹅膏 (A. subjunquillea S. Imai)、
致命鹅膏 (A. exitialis Zhu L. Yang & T. H. Li)、 鳞
柄鹅膏 (A. virosa Bertillon)、 灰花纹鹅膏 [A. fulig鄄
inea Hongo]、 绿盖鹅膏 [A. phalloides (Fr. ) Link. ]
等。 世界各地每年都有因误食毒菌而中毒死亡的
事件发生, 其中绝大部分是因误食剧毒鹅膏而引
起的 (Bresinsky和 Besl, 1985)。 在我国, 因蘑菇
中毒导致死亡的毒菌主要是鹅膏属剧毒种类, 如
2000年 3月在广州 9 人误食致命鹅膏, 其中 8 人
死亡 (Yang和 Li, 2001; 谭铭雄等, 2002)。 开展
该属 DNA条形码的研究, 对于食用菌和剧毒菌的
快速准确鉴定、 预防和有的放矢地治疗毒菌中毒
具有重要的现实意义。 我国学者曾利用 ITS 序列
鉴定鹅膏 (李海波等, 2007; 曹杰等, 2009), 但
5166 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 蔡摇 箐等: 大型经济真菌的 DNA条形码研究———以我国剧毒鹅膏为例摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
对其中的剧毒鹅膏尚未开展过系统的研究。
本文选取三个候选片段, 即核糖体大亚基
(nLSU)、 内转录间隔区 (ITS) 和翻译延长因子
1鄄a( tef1鄄琢), 对我国已知的 7 种剧毒鹅膏及 2 种
易混的可食鹅膏 (图 1) 进行研究, 筛选合适的
DNA条形码片段。 为测试各片段的可靠性, 我
们也将与黄盖鹅膏有密切亲缘关系的、 但分布于
欧美的绿盖鹅膏 (A. phalloides) 纳入分析中。
图 1摇 我国 5 种常见的剧毒鹅膏 (A-D, F) 及 2 种与之易混的可食鹅膏 (E, G)
A. 淡粉色鹅膏; B. 鳞柄鹅膏; C. 灰花纹鹅膏; D. 裂皮鹅膏; E. 大白鹅膏; F. 黄盖鹅膏; G. 黄棱鹅膏
Fig. 1摇 Five common species of lethal Amanitas (A-D, F) and two easily confusible species of edible ones (E, G) in China
A. Amanita pallidorosea; B. A. virosa; C. A. fuliginea; D. A. rimosa; E. A. aff. princeps; F. A. subjunquillea; G. A. aff. javanica
616摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
1摇 材料和方法
1. 1摇 研究材料
本研究共选取了鹅膏属 10 个种的 28 份标本, 除拟
灰花纹鹅膏 (A. fuligineoides) 和绿盖鹅膏 (A. phalloides)
每种仅选取 1 份标本外, 剩余的 8 个种每种选取 3 ~ 4 份
标本材料。 凭证标本存放于中国科学院昆明植物研究所
隐花植物标本馆 (HKAS) 和吉林农业大学菌物标本馆
(HMJAU)。 标本鉴定主要依据杨祝良 (2005) 和 Zhang
等 (2010)。 具体研究材料见下表 (表 1)。
1. 2摇 样品 DNA的提取、 PCR扩增和测序
总 DNA的提取采用改良的 CTAB法 (Doyle和 Doyle,
1987)。 nLSU 片段的正向引物为 LROR, 反向引物为
LR5 (Vilgalys 和 Hester, 1990); ITS 正向引物为 ITS5,
反向引物为 ITS4 (White 等, 1990); tef1鄄琢 的引物为
983F和 1567R (Rehner, 2001)。
摇 摇 PCR 反应体系 25 滋L, 包括 10 伊扩增缓冲液 (含
MgCl2) 2.5 滋L, 1.5 滋L牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin:
BSA; 20 mg·mL-1), 2. 5 滋L dNTP (200 Mm), 2 滋L 的
引物 (5 滋M), TaqDNA 聚合酶 0. 3 滋L (2. 5 u·滋L-1 ),
DNA模板 0. 5 ~ 1. 5 滋L, 用 ddH2O 定容至 25 滋L。 nLSU
片段的扩增程序; 94 益, 预变性 4 min; 94 益变性 40 s,
50 益退火 40 s, 72 益延伸 2 min 30 s (进行 35 个循环);
72 益延伸 10 min。 ITS 和 tef1鄄琢 的扩增程序为: 94 益,
预变性 4 min; 94 益变性 40 s, 54 益退火 40 s, 72 益延伸
1 min (进行 35 个循环); 72 益延伸 10 min。
摇 摇 PCR扩增产物用多功能 DNA 纯化回收试剂盒 (北
京百泰克生物技术有限公司) 进行纯化。 PCR 产物经纯
化后直接送出测序, 测序仪为 ABI3730, 所用引物同扩增
表 1摇 研究鹅膏材料信息表
Table 1摇 Specimens of Amanita used in the analyses and their GenBank accession numbers
分类单元 Taxon 凭证标本 Voucher
GenBank号码 GenBank accession
nLSU ITS tef鄄1琢
致命鹅膏 A. exitialis1 HKAS75774 JX998052 JX998027 JX998001
致命鹅膏 A. exitialis2 HKAS75775 JX998053 JX998026 JX998002
致命鹅膏 A. exitialis3 HKAS75776 JX998051 JX998025 JX998003
灰花纹鹅膏 A. fuliginea1 HKAS75782 JX998049 JX998022 JX997996
灰花纹鹅膏 A. fuliginea2 HKAS75780 JX998048 JX998023 JX997995
灰花纹鹅膏 A. fuliginea3 HKAS75781 JX998050 JX998021 JX997994
拟灰花纹鹅膏 A. fuligineoides HKAS52727 JX998047 JX998024 ———
淡红鹅膏 A. pallidorosea1 HKAS75786 JX998054 JX998037 JX998011
淡红鹅膏 A. pallidorosea2 HKAS75783 JX998055 JX998035 JX998010
淡红鹅膏 A. pallidorosea3 HKAS75784 JX998056 JX998036 JX998009
绿盖鹅膏 A. phalloides HKAS75773 JX998060 JX998031 JX998000
裂皮鹅膏 A. rimosa1 HKAS75779 JX998046 JX998020 JX998004
裂皮鹅膏 A. rimosa2 HKAS75777 JX998044 JX998018 JX998005
裂皮鹅膏 A. rimosa3 HKAS75778 JX998045 JX998019 JX998006
黄盖鹅膏 A. subjunquillea1 HKAS75770 JX998062 JX998034 JX997999
黄盖鹅膏 A. subjunquillea2 HKAS75771 JX998063 JX998032 JX997997
黄盖鹅膏 A. subjunquillea3 HKAS75772 JX998061 JX998033 JX997998
鳞柄鹅膏 A. virosa1 HKAS75790 JX998057 JX998028 ———
鳞柄鹅膏 A. virosa2 HKAS56694 JX998058 JX998030 JX998007
鳞柄鹅膏 A. virosa3 HMJAU20396 JX998059 JX998029 JX998008
黄棱鹅膏 A. aff. javanica1 HKAS56957 JX998068 JX998039 JX998017
黄棱鹅膏 A. aff. javanica2 HKAS56863 JX998071 JX998040 JX998014
黄棱鹅膏 A. aff. javanica3 HKAS52668 JX998069 JX998038 JX998015
黄棱鹅膏 A. aff. javanica4 HKAS53281 JX998070 JX998041 JX998016
大白鹅膏 A. aff. princeps1 HKAS59780 JX998064 KC006435 ———
大白鹅膏 A. aff. princeps2 HKAS59777 JX998066 KC006434 ———
大白鹅膏 A. aff. princeps3 HKAS75787 JX998065 JX998042 JX998012
大白鹅膏 A. aff. princeps4 HKAS75788 JX998067 JX998043 JX998013
Herbarium acronyms: HKAS=Herbarium of Cryptogams, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences;
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 HMJAU=Herbarium of Mycology of Jilin Agricultural University
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引物 (测序由上海生工生物工程测序有限公司完成)。
对 PCR产物直接测序失败的样品, 通过克隆后进行
测序。 克隆的过程包括 LB 培养基的配制, 感受态细胞
的制备, 链接 (采用 Takara 公司的 pMD18鄄T 载体), 大
肠杆菌的转化, 菌落 PCR的克隆检测, 菌液的培养和测
序。 本研究克隆所得的序列共四条, 均为 ITS 序列, 其
它序列则为直接测序的结果。
1. 3摇 数据分析
测序后所得峰图采用 DNASTAR软件包中的 SeqMan进
行校对拼接, 拼接后所得序列采用 MUSCLE ver. 3. 8. 3. 1
(Edgar, 2004) 进行比对, 并利用 BioEdit ver. 7. 0. 9
(Hall, 1999) 进行手工调整以保证对应碱基的同源性。
衡量 DNA条形码的一个重要指标是 Barcoding gap是
否存在, 即序列的种内变异要足够小而种间变异要足够
大, 从而在中间形成一个明显的间隙 (Meyer 和 Paulay,
2005)。 本文利用 MEGA (version 4. 0) 软件, 采用 Kimu鄄
ra鄄2鄄parameter distance (K2P) 模型计算各物种的种内、
种间遗传距离。 再利用 Microsoft Office Excel 构建能体现
种间、 种内遗传距离的分布柱形图。 通过 Wilcoxon 秩和
检验来检验各片段序列之间的变异性差异。
衡量 DNA条形码的另一个重要指标是片段对物种
的准确鉴定率, 即物种分辩率。 利用 MEGA软件构建单
个片段的邻接树 ( neighbor鄄joining, NJ), 建树时采用
Kimura2鄄parameter模型, 所有对位排列结果中的空位
(gaps) 或缺失数据 (missing data) 作完全删除 ( com鄄
plete deletion) 处理, 系统树的每个分支的支持率以自展
法 (bootstrap) 进行检验, 重复次数为 5 000 次 (Tamura
等, 2007)。 若每个种的所有个体都聚为一个单系分支则
认为该物种鉴定正确 (Hollingsworth等, 2009)。
2摇 结果
2. 1摇 PCR扩增和测序成功率
本研究选取 nLSU、 ITS 和 tef1鄄琢 三个 DNA
候选片段进行扩增和测序, 三个候选片段的长度
为 538 ~ 834 bp, 各片段 GC 含量不同, 以 tef1鄄琢
的 GC含量最高, 为 49. 2%, 具体情况见如表 2。
PCR的扩增效率和测序成功率是评价 DNA条
形码序列的一个重要标准, 各候选片段的 PCR 扩
增效率, tef1鄄琢较低, 为 85. 7%, nLSU和 ITS片段
均为 100%。 测序成功率以 ITS 最低, 为 85. 7%,
nLSU和 tef1鄄琢 均为 100% 。 综合 PCR 扩增效率
和测序效率, 以 nLSU片段最优, 均为 100% 。
2. 2 摇 Barcode gap 的评估及种间和种内遗传差
异的统计学检验
从三个片段种内和种间遗传变异的分布图可
以看出 (表 3, 图 2), 虽 nLSU 片段在遗传距离
0. 001 ~0. 002处有重叠, 但仍表现出一定的 barcode
gap, 而 ITS和 tef1鄄琢存在明显的 barcode gap。
表 2摇 条形码候选片段序列及扩增、 测序效率信息表
Table 2摇 PCR amplification and sequencing success rate
of DNA barcoding candidate segments
分项 item
候选片段 Candidate segment
nLSU ITS tef1鄄琢
长度 Length / bp 834 594 538
GC含量 GC content / % 48. 2 41. 9 49. 2
PCR扩增效率
PCR success / % 100 100 85. 7
测序成功率
Sequencing success / % 100 85. 7 100
图 2摇 三个候选条形码片段的种内和种间遗传变异分布
频率比较 (x轴: 遗传距离; y轴: 分布频率)
Fig. 2摇 Comparisons of frequency distribution of intra鄄 and inter鄄specific
pairwise distances among three barcoding candidate segments
(x鄄axis: pairwise distance; y鄄axis: frequency distribution)
816摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
摇 摇 利用 Wilcoxon秩和检验对不同序列种内和种
间的变异进行统计分析, 结果表明三个片段的种内
变异率无明显差别 (表 4)。 种间变异率则表现出
一定的差异, 以 tef1鄄琢 的种间变异最大, 而 nLSU
的种间变异最小, 即 tef1鄄琢>ITS>nLSU (表 5)。
2. 3摇 物种分辨率
在基于三个候选片段所构建的邻接树上, 本
研究所选取的样品均聚为 A、 B、 C 三大支。 其
中 B、 C两支为可食用鹅膏, 与 A支所代表的剧
毒鹅膏明显区分开。 在分支 A 中, 各物种均以
较高的支持率聚为单系分支。 分布于欧美的绿盖
鹅膏和东亚的黄盖鹅膏亲缘关系密切, 在三个片
段分别构建的邻接树上均构成一单系分支并得到
较高的支持, 二者互为姐妹群关系 (图 3, 4)。
3摇 讨论
3.1摇 DNA条形码引物通用性与 barcode gap的评价
DNA条形码筛选的三个主要标准包括: 引
物通用性高; DNA 序列的可读性好, 且具有较
高的序列质量; 物种分辨率高 ( CBOL Plant
Working Group, 2009), 而且 DNA条形码长度合
适, 在 300 ~ 800 bp 之间 (Kress 等, 2005)。 本
研究所选取的三个候选序列, 序列长度为 538 ~
834 bp, 满足 DNA 条形码的基本需要。 在引物
通用性方面, nLSU 片段的扩增及测序成功率最
高, 均为 100% , ITS 的扩增效率虽然很高, 但
测序成功率相比较低, 部分序列需要克隆测序获
得, 可能是由于 ITS在基因组中存在多个拷贝有
关, 在种子植物中的一些属中也存在相似的情况
(Li等, 2011)。 tef1鄄琢 为低拷贝的蛋白质编码基
因片段, 可能在 PCR 扩增的过程中对总 DNA,
即标本质量的要求比较高, 所以扩增效率较其
他两个片段低, 为 85. 7% , 但测序成功率高达
100% , 具有较高的应用性。 综合来看, 三个
DNA条形码候选片段均具有较高的 PCR 扩增和
测序成功率。
Barcode gap 也是评价 DNA 条形码的标准之
一, 理想的条形码其种内的遗传变异应该小于种
表 3摇 候选条形码片段的种内和种间变异分析
Table 3摇 Intra鄄 and inter鄄specific variation of DNA barcoding candidate segments
分项 Item
候选片段 Candidate segment
nLSU ITS tef1鄄琢
种内变异 Intra鄄specific variation 0. 0003 依 0. 0007 0. 0006 依 0. 0008 0. 0027 依 0. 00243
种间变异 Inter鄄specific variation 0. 0725 依 0. 0614 0. 1245 依 0. 1037 0. 1630 依 0. 1012
种间最小变异 Minimum intra鄄specific variation 0. 001 0. 006 0. 016
种内最大变异 Maximum inter鄄specific variation 0. 002 0. 002 0. 006
表 4摇 种内遗传变异的Wilcoxon检验
Table 4摇 Wilcoxon test of pairwise intra鄄specific variation
W+ W- 种内变异相关性Correlation of intra鄄specific variations
N值
N value
P值
P value 摇 摇 摇 摇 摇 结果 Result
tef1鄄琢 nLSU W+=0, W-=15 8 0. 031 差异不显著 No significant difference
nLSU ITS W+=1. 5, W-=4. 5 8 0. 375 差异不显著 No significant difference
ITS tef1鄄琢 W+=0, W-=15 8 0. 31 差异不显著 No significant difference
表 5摇 种间遗传变异的Wilcoxon检验
Table 5摇 Wilcoxon test of pairwise inter鄄specific variation
W+ W- 种间变异相关性Correlation of interspecific variations
N值
N value
P值
P value 结果 Result
tef1鄄琢 nLSU W+=666, W-=0 36 P臆0. 001 tef1鄄琢>nLSU
tef1鄄琢 ITS W+=468, W-=0 36 P臆0. 001 tef1鄄琢>ITS
ITS nLSU W+=999, W-=10 45 P臆0. 001 ITS>nLSU
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图 3摇 基于 nLSU和 ITS片段构建的邻接树, 分枝上的数值为靴带值
Fig. 3摇 Neighbor鄄joining trees based on nLSU and ITS sequence data respectively.
Bootstrap support values are indicated above the branches
间的遗传变异 (Meyer和 Paulay, 2005)。 在本研
究中, 三个候选条形码片段种内和种间遗传距离
分析表明, tef1鄄琢片段的种间遗传变异最大, 其
次是 ITS, tef1鄄琢和 ITS均存在明显的 barcode gap
(图 2), 而 nLSU的种内最大变异虽然超过了种
间最小变异, 但仍表现出一定的 barcode gap。
3. 2摇 物种分辨率的评价
基于三个候选片段所构建的邻接树, 均可以
将可食用鹅膏 (分支 B 和 C) 和剧毒鹅膏 (分
支 A) 明显分开 (图 3, 4), 因此, 三个 DNA
条形码侯选片段均可以作为区分可食用鹅膏和剧
毒鹅膏的 DNA 条形码。 在物种鉴定方面, 每个
物种所代表的个体均分别聚为单系分支, 且具有
较高的内部支持率 (图 3, 4), 表明利用三个候
选片段中的任何一个均能将本文所选取的鹅膏属
所有物种成功分辨, 并表现出高的物种分辨能
力。 因此, 本文选用的三个 DNA 候选片段均可
作为鹅膏属物种鉴定的 DNA条形码。
综上分析表明, 在所选取的三个条形码候选
片段中, tef1鄄琢 扩增效率稍低、 但测序成功率
高, 存在明显的 barcode gap, 且物种鉴定率相对
图 4摇 基于 tef1鄄琢片段所构建的邻接树,
分枝上的数值为靴带值
Fig. 4摇 Neighbor鄄joining tree based on tef1鄄琢 sequence data.
Bootstrap support values are indicated above the branches
026摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
较高, 为较优的 DNA条形码候选片段。 nLSU的
PCR扩增和测序效率均为 100% , 表现出了一定
的 barcode gap, 物种鉴定率也相对较高, 可作为
DNA 条形码候选片段。 但考虑到 ITS 可能会成
为真菌界的通用条码 (Schoch 等, 2012), 也考
虑到单一片段在很多情况下并不能区分近缘物种
的实际情况 (Dupuis等, 2012; Kiss, 2012), 故
建议将 ITS作为鹅膏属的核心条形码, tef1鄄琢 和
nLSU作为该属的辅助条形码。 本研究对于解决
鹅膏属食用菌和剧毒菌的快速准确鉴定、 预防和
有效治疗毒菌中毒具有很好的应用前景和较重要
的现实意义。
此外, 作者还对 rpb1、 rpb2、 茁鄄tubulin 等基
因片段进行了测试, 发现这些片段的 DNA 扩增
和测序的成功率相对较低, 引物的通用性较差,
可能不宜作为鹅膏属的 DNA条形码候选片段。
致谢摇 中山大学李方博士、 海南医学院曾念开博士及中
国科学院昆明植物研究所赵琪先生提供部分图片, 特此
感谢。
也参摇 考摇 文摇 献页
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