全 文 ：植物种质资源超低温保存概述*
文摇 彬
(中国科学院西双版纳热带植物园, 云南 勐腊摇 666303)
摘要: 简要回顾了植物种质资源超低温保存的历史, 说明了超低温保存植物材料的多样性, 阐述了超低温
耐性的生物学基础及超低温伤害产生的原因和类型, 介绍了各种常用超低温保存方法的技术要点, 并对生
产顽拗性种子的植物种质资源的超低温保存作了专门的论述, 分析了生产顽拗性种子的植物种质资源超低
温保存的潜力、 现状和困难, 指出顽拗性种子的超低温保存是植物种质资源超低温保存的重点和难点, 而
真正实现用超低温保存技术贮藏顽拗性植物种质资源还有很长的路要走。
关键词: 种质资源; 超低温保存; 超低温耐性; 超低温伤害; 顽拗性种子
中图分类号: Q 945. 79摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)03-311-19
An Introduction to Cryopreservation of Plant Germplasm
WEN Bin
(Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Mengla 666303, China)
Abstract: This paper recited the history of plant germplasm cryopreservation, exhibited the diversity of cryopreser鄄
vated plant materials, analysed biological foundation of plant cryotolerance, causes and types of cryo鄄injury, de鄄
scribed the key techniques of frequently鄄used cryopreservation methods, and paid special attention to cryopreserva鄄
tion of plant germplasm of species producing recalcitrant seeds. Based on analysis of potential, status and difficul鄄
ties, the author thought that regard to cryopreservation of plant germplasm of recalcitrant鄄seeded species there are
much to do, for it was the keystone and difficult part of plant germplasm cryopreservation.
Key words: Germplasm; Cryopreservation; Cryotolerance; Cryo鄄injury; Recalcitrant seeds
1摇 植物种质资源超低温保存概况
超低温保存 (cryopreservation) 是指在-100益
及更低温度下保存生物材料, 也有些研究者把超
低温的温度限定在 - 130益 及以下 ( Withers,
1986; Fuller, 2004), 但无论如何, 在-80益以
上保存的材料是不稳定的。 虽然-80益保存能够
保持材料的冻结状态, 短期内对细胞的活力没有
太大的影响, 但细胞内会发生水分转移和重结晶
现象, 最终导致细胞结构的破坏和死亡。 因为液
态氮化学性质稳定而价格又比较便宜, 使得液态
氮成为超低温保存中最常用的冷冻介质。 当材料
悬挂在液氮上方气相介质中时温度约为-130益,
而当材料浸没在液氮中时温度为-196益。 因为
在超低温下, 活细胞内的物质代谢和生命活动几
乎完全停止, 生命物质处于非常稳定的生物学状
态, 故贮藏期间不可能发生遗传状态的改变或形
态潜能的丧失, 因此超低温保存被认为是 “永
久冶 保存生物样品的理想方法。 由于在生物圈
内找不到自然的超低温条件, 可以想见, 超低温
保存是随着制冷技术的进步出现的新鲜事物。
人类在 1877、 1898 和 1908 年实现了空气、
氢气和氦气第一次液化, 并相应的获得了-192益、
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (3): 311 ~ 329
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 10191
* 基金项目: 国家自然科学基金 (30571526) 和中国科学院院长基金。 本文系作者博士论文的一部分
收稿日期: 2010-11-02, 2011-02-10 接受发表
作者简介: 文彬 (1967-) 男, 博士, 副研究员, 主要从事种子生物学、 低温生物学和保护生物学的研究。 E鄄mail: wenb@ xtbg. org. cn
-253益和-269益的超低温, 而在 1897 年、 1899
年和 1925 年分别有了用液态空气、 液态氢、 液
态氦处理植物种子的尝试 (转引自 Lockett 和
Luyet, 1951)。 这样的尝试一直延续了几十年,
如 Selby (1901), Lipman 和 Lewis (1934), Lip鄄
man (1936)。 这些实验很大程度上是为了满足
人类的好奇心, 并不是为了利用超低温来实现植
物种质资源的长期贮藏, 还不能算是真正意义上
的超低温保存。
由于最初用超低温处理种子的实验大都比较容
易地取得了成功, 植物种子经超低温处理后发芽率
没有发生明显的改变, 也由于当时还缺乏对顽拗性
种子的认识, 致使人们误以为所有植物种子理所当
然的都能够经受超低温处理, 导致植物种质资源超
低温保存方面的研究长期裹足不前。 虽然很早 Bec鄄
querel (1905) 和 Adams (1905) 就分别报道了用
液态空气处理高含水量种子是致命的, 但直到近
半个世纪后才有人研究种子含水量与超低温处理
后种子存活的关系 (Lockett和 Luyet, 1951)。
现代意义上的植物种质资源超低温保存研究
得益于低温生物学在动物学和医学方面的发展,
同时植物低温驯化和冻害研究方面的工作也功不
可没。 Polge 等 (1949) 采用添加防冻保护剂,
慢速降温, 然后转移到液态氮中的方法, 实现了
人和多种动物精子的超低温保存。 这一技术逐步
发展和完善, 成为超低温保存的传统方法, 也称
作二步法, 这也是植物材料超低温保存最早使用
的方法。 根据材料的特点和研究的目的, 目前植
物超低温保存有如下几个主要方面的研究和应
用: (1) 重要实验用细胞株系的保存, 如放线
菌 (廖爱芳和林永珠, 1999)、 短杆菌 (方呈祥
等, 1996)、 花叶病毒 (宋淑云等, 2005) 等;
(2) 优良农作物品系的保存, 如柿品种 “禅寺
丸冶 (艾鹏飞和罗正荣, 2004)、 “品丽珠冶 葡萄
(赵艳华和吴永杰, 2001)、 马哈利樱桃 (赵艳
华等, 1999) 等; (3) 遗传育种材料的保存, 如
水稻胚性悬浮细胞 (王君晖等, 1996a; Wang
等, 1998 )、 野生稻愈伤组织 (殷晓辉等,
1996)、 杂交水稻恢复系花粉 (胡晋和郭长根,
1996)、 水稻单倍体不定芽 (章志宏和胡中立,
2000)、 烟草悬浮细胞 ( Kobayashi, 2005) 等;
(4) 保护生物学方面植物多样性种质资源的保
存, 如杜仲和秤锤树的花粉 (陈品良等, 1990)、
银杏的胚和花粉 (徐刚标等, 2000a, b) 等。
2摇 植物种质资源超低温保存的材料类型
经过几十年的探索和发展, 超低温保存已经
被尝试用于几乎所有类型的植物材料并取得了不
同程度的成功, 积累了非常丰富的资料。 这里,
笔者根据植物材料的来源与超低温保存的难度,
划分为 4 个类型并分别说明。
2. 1摇 繁殖器官
正常性种子因为在种子发育后期存在成熟脱
水过程, 种子脱落后还可以进一步脱水, 不含或
只含有很少的可冻结水, 是最早也是最容易成功
实现超低温保存的生物材料 (Selby, 1901; Lip鄄
man和 Lewis, 1934; Lipman, 1936)。 关于正常
性种子超低温保存的研究很多, 直到上世纪 90
年代还一直有这方面的报道。 Sakai 和 Noshiro
(1975) 报道了 5 种农作物种子超低温保存的研
究; Stanwood和 Roos (1979) 报道了 14 种蔬菜
和花卉种子超低温保存的研究; Stanwood和 Bass
(1981) 做了 120 种农作物、 蔬菜、 花卉和林木
种子的超低温保存研究, 除亚麻 (Linum usitatis鄄
simum) 和胡麻 ( Sesamum indicium) 外都取得
了成功; Styles 等 (1982) 报道了 24 种植物种
子保存 600 天的超低温保存的研究; Stanwood
(1985) 报道了 155 个种 455 个批次的种子成功
超低温保存的实验; Pence (1991b) 报道了用液
氮保存俄亥俄州 237 种乡土植物 527 个批次种子
的研究, 约 80%的种类不受液氮处理的影响;
Iriondo等 (1992) 报道了 14 种农作物和野生植
物种子超低温保存的研究; Touchell ( 1993 ),
Touchell和 Dixon (1994) 做了 90 种澳大利亚本
土植物种子的超低温保存研究, 2 / 3 以上的物种
超低温处理后有存活的种子, 并且认为 40%以
上的澳大利亚稀有濒危植物可以用超低温的方法
长期保存; 张北壮等 (1990) 报道了 25 种农作
物及蔬菜种子的超低温贮存研究, 除苦瓜外, 其
余种子的发芽率和活力与未用液氮处理的对照没
有明显的不同; 刘燕等 (2001) 报道了 47 种园
林花卉植物种子超低温保存研究等。 耐脱水的细
菌和各个门类植物的孢子也是比较容易被超低
温保存的材料, 解冻后可以通过萌发、 生长, 建
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成新的植株体, 如放线菌 (廖爱芳和林永珠,
1999)、 短杆菌 (方呈祥等, 1996)、 牟氏角剌藻
和新月菱形藻 (王起华等, 1999)、 盐生杜氏藻
和青岛大扁藻 (王起华等, 2000a)、 小球藻 (蔡
小宁等, 2004 )、 大叶黑桫椤孢子 (徐艳等,
2006) 等。 被子植物的花粉大都是比较耐脱水
的, 经适度的人工干燥后可以成功超低温保存,
待需要时解冻用于人工授粉或组织培养, 如杜仲
和秤锤树 (陈品良等, 1990)、 紫苔菜 (梁立
等, 1993)、 油菜 (Xu 等, 1997)、 柿 (艾鹏飞
和罗正荣, 2004 ) 和梅花 (刘燕和张亚利,
2004)。 也有超低温保存不成熟的繁殖器官, 解
冻后通过组织培养方法培养成苗, 如大麦幼穗
(王君晖等, 1996b)。
2. 2摇 营养器官
植物的一些幼嫩组织, 如分生组织、 茎尖、
根尖、 节间等, 主要由分化程度低、 分裂能力强
的分生细胞组成, 这些细胞具有体积小、 形状规
则、 细胞质浓、 液泡少等特点, 因而具有比较高
的超低温耐性, 常常用作超低温保存的材料, 解
冻后可以作为外植体, 通过组织培养恢复成植
株。 生产上, 有性繁殖常常导致果树的品质退
化, 因此优良的果树品种都需要以营养体进行无
性繁殖以保持果树的品质, 超低温保存就可以用
来保存这些植株的营养繁殖体, 如甘蔗的茎尖
(Gonzalez鄄Arnao等, 1993; Paulet等, 1993)、 苹果
离体茎尖 (赵艳华等, 1998; 吴永杰等, 1999)、
柿休眠芽茎尖 (艾鹏飞和罗正荣, 2003)、 柑橘茎
尖 (王子成和邓新秀, 2001)、 猕猴桃的茎段 (简
令成和孙龙华, 1989) 等。 低等植物如坛紫菜的
自由丝状体 (王起华等, 2000b)。
另外, 一些温带植物的小枝, 在完成低温驯
化后可以被成功的超低温保存, 解冻后可以通过
扦插或嫁接恢复成苗, 如杨 (Populus maximowi鄄
chi, P. simonii, P. nigra, P. glaubka)、 柳 (Salix
sachalinensis, S. yezoensis, S. koriyanagi, S. siebold鄄
iana)、 桦 (Betula taushii, B. eymani)、 松 (Pi鄄
nus pumira) ( Sakai, 1966 )。 另据报道, 豌豆
(Sun, 1958) 和拟南芥 (Liu 等, 1999) 的幼苗
被成功的超低温保存并在解冻后恢复生长。
2. 3摇 组织培养物
植物外植体, 无论来自营养器官还是繁殖器
官, 经过一定的组织培养后, 脱分化为各种超低
温耐性较高的组织, 再用于超低温保存将有更高
的成功机会, 解冻后可以继续进行组织培养恢复
成完整的植株。 可用于组织培养的外植体是具有
较高脱分化能力的植物组织和器官, 如分生组
织、 茎尖、 根尖、 节间, 子房、 胚珠、 花药等。
用于超低温保存的组织培养物有悬浮培养细胞、
原生质体、 胚性愈伤组织、 体细胞胚、 小孢子胚
等。 如: 毛地黄悬浮细胞系 ( Diettrich 等,
1982)、 大白菜悬浮细胞系 (罗美中等, 1990)、
海带雌性配子体克隆细胞 (刘涛等, 2006), 新
疆紫草的愈伤组织 (李国凤等, 1992)、 猕猴桃
愈伤组织 (李嘉瑞等, 1996)、 凹叶厚朴愈伤组
织 (刘贤旺和杜勤, 1996)、 糜子的愈伤组织
(孙德兰等, 1988)、 玉米的愈伤组织 (孙龙华
等, 1989)、 杏的愈伤组织和原生质体 (马锋旺
和李嘉瑞, 1998, 1999)、 柑橘的原生质体 (王
子成和邓新秀, 2002)、 水稻原生质体细胞团
(唐定台等, 1988)、 铁皮石斛的原球茎和类原球
茎体 (王君晖等, 1999)、 油菜 (Brassica napus)
的小孢子胚 (Brown 等, 1993)、 油棕的体细胞
胚 (Dumet 等, 1993)、 咖啡的体细胞胚 ( Se鄄
naratna等, 1991; Hatanaka等, 1994) 等。
保存组织培养物是植物种质资源超低温保存
早期工作的主要内容, 最早是由 Quatrano 在
1968 年首次报道。 现在, 一些重要的细胞学实
验材料仍需要用这种方式保存原生质体、 悬浮细
胞或者愈伤组织。 一些顽拗性种子超低温保存胚
或胚轴很难成功, 转而保存组织培养物常常可以
获得比较好的结果, 如芒果 (Wu等, 2003)、 龙
眼和荔枝 (郭玉琼, 2007)。 但必须指出的是,
一粒种子 (或者胚 /胚轴) 包含的遗传资源跟一
棵参天大树等同, 一批种子就是一片沉睡的森
林, 而组织培养物的遗传多样性是很贫乏单一
的。 因此, 以生物多样性保护为目的的超低温保
存, 应该尽可能保存完整的种子或离体胚 /胚轴。
2. 4摇 顽拗性 /中间型种子
这里, 笔者将顽拗性 /中间型种子从前文的
繁殖器官中分离出来单独作为一类, 是因为顽拗
性 /中间型种子的超低温保存所要求的技术难度
大, 成功的机会小, 是低温生物学需要研究的重
点和难点。 顽拗性种子对低温和脱水都敏感, 而
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且在种子的发育和萌发之间没有明显的静止期,
被认为是萌发中的 “正常性种子冶。 部分吸涨的
正常性种子被用来模拟顽拗性种子对超低温处理
的反应, 如土豆 (Grout, 1979)、 莴苣 (Kaurin
和 Stushnoff, 1985 )、 玉米 ( Boucaud 和 Cam鄄
becedes, 1988)。 顽拗性种子的超低温保存一般
都是以离体胚或胚轴为材料, 成功保存完整的顽
拗性种子的报道很少见到。 中间型种子既有保存
完整种子的, 也有保存离体胚或胚轴的, 依种而
论。 如番木瓜 (Becwar 等, 1983; Chin 和 Krish鄄
napillay, 1989)、 柑橘类 (Hor 等, 2005) 的种
子可以完整保存, 咖啡 (Abdelnour鄄Esquivel 等,
1992; Vasquez 等, 2005 ) 和油棕 ( Engelmann
等, 1995) 既可以保存离体胚也可以保存完整的
种子, 但离体胚超低温处理后的存活率远高于整
粒种子。 Grout 等 (1983) 发现油棕的离体胚比
完整的种仁具有高得多的脱水耐性, 并首先成功
的实现了油棕胚的超低温保存, 其后, 南洋杉
(Pritchard和 Prendergast, 1986)、 橡胶 (Normah
等, 1986)、 可可 (Pence, 1991a)、 椰子 (Assy鄄
Bah和 Engelmann, 1992a, b)、 菠萝蜜 ( Tham鄄
masiri, 1999; Krishnapillay, 2000)、 咖啡 ( Ab鄄
delnour鄄Esquivel 等, 1992 )、 茶 ( Chandel 等,
1995)、 野生稻 (Zizania palustris) (Touchell 和
Walters, 2000)、 银杏 (徐刚标等, 2000a) 及若
干温带顽拗性植物 (Pence, 1990, 1992; 郑郁善
等, 2002) 的胚 /胚轴被成功的超低温保存。
3摇 植物的低温耐性
在长期的进化过程中, 植物形成了许多适应
低温环境的习性, 如冬季落叶、 休眠、 降低含水
量、 积累糖份和胁迫相关蛋白以及抗冻蛋白。 如
前所述, 很早就有人注意到高含水量是导致超低
温保存过程中种子死亡的重要原因 (Becquerel,
1905; Adams, 1905; Lockett和 Luyet, 1951), 水
分含量及水的相变关系到植物能否经受低温的考
验, 冷冻前降低材料的含水量具有重要意义。 温
带植物在冬季来临前都会出现含水量降低、 胞质
浓度升高的现象, 这可能是细胞脱水和积累保护
性物质两个过程的共同结果。 正常性种子在发育
过程的末期也都有一个主动脱水的过程 (成熟
脱水)。 自然界的水在零度附近结冰, 但为什么
温带植物能够经受冬天零下几十度的低温却并没
有被冻死呢? 这是因为许多情况下水分在植物细
胞中并没有结冰, 而是处于过冷却状态。 自然界
的水因为含有丰富的结晶核, 因此在降温过程中
水分子首先在结晶核周围结成冰晶, 然后逐渐向
外围扩展, 最后整个水体结冰。 这一过程称为异
核结冰。 植物细胞内因为缺少这样的结晶核, 因
此胞内水分并不会在零度附近结冰, 但当温度降
低至-30益附近时, 水分子可以以自身为结晶核
结成冰晶。 这一过程称为同核结冰。 植物细胞同
核结冰的温度因细胞胞质的浓度而异, 胞质浓稠
的细胞, 过冷却的温度会低一些, 添加低温保护
剂会使得过冷却温度降得更低。 同时, 植物器官
的一些特殊结构可以把细胞内液与细胞外液分隔
开, 有效的防止胞外冰晶向胞内生长, 保持细胞
的过冷却状态, 如梨的花芽 (Ashworth, 1982)
和葡萄的芽心 (Jones等, 2000)。 存在机械损伤
的种子容易被冻死, 是因为这样的结构被破坏,
不能有效的阻止冰晶向器官内部生长, 导致胞内
结冰而造成的 (Keefe和 Moore, 1981)。
细心的观察者还发现, 严冬季节活植物体内
会发生结冰现象, 但冰晶只出现在细胞间质, 细
胞质内并没有冰晶。 这是因为细胞质内溶解了许
多的可溶性物质, 导致细胞质的结冰温度远低于
细胞间质的结冰温度, 因此在降温过程中, 细胞
间质先结冰, 胞间质结冰后细胞间的水汽压降
低, 于是细胞内的水分向细胞间质移动, 细胞质
的可溶性物质浓度逐渐增高, 进一步降低细胞质
的过冷却点, 细胞质继续保持过冷却状态, 这一
过程称为冷冻脱水。 细胞外结冰虽然可能通过冰
压、 冰冻窒息和冰冻脱水等次生胁变对植物产生
间接伤害, 但常常是非致命的, 其伤害程度远不
及因细胞内结冰造成的伤害严重, 因此温带植物
能够经受低温的考验正是因为冰冻脱水和过冷却
这两个机制在发挥作用。 这也正是传统的超低温
保存方法的工作原理。
超低温保存的传统方法 (二步法) 保存植
物材料的基本步骤是添加低温保护物质, 采用慢
速降温, 诱导细胞外结冰, 通过冰冻脱水降低原
生质的含水量, 原生质过冷却, 然后迅速转入液
氮中, 为此, 超低温保存过程中降温的速度是个
关键。 Mazur等 (1972) 根据中国仓鼠组织培养
413摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
细胞的超低温保存研究首次提出了冷冻伤害的二
因素假说, 该学说认为, 冷冻伤害来自两个独立
的因素: 一是胞内冰伤害 ( intracellar ice dam鄄
age), 这是由于降温速度过快导致细胞内冰晶生
成, 破坏了细胞的膜系统引起的, 因此, 冷冻速
度越快, 此种伤害越大; 另一个是溶质伤害
(solute damage) 或称溶液伤害 ( solution dam鄄
age), 这是由于降温速度太慢造成的。 如前所
述, 降温会引起细胞冷冻脱水和过冷却, 细胞质
内的水分向细胞间质移动, 细胞质的可溶性物质
浓度逐渐增高。 但细胞质浓度过高对细胞有是害
的, 特别是盐浓度过高会导致蛋白凝聚、 变性。
降温速度越慢, 细胞在高浓度盐溶液中暴露的时
间就越长, 这种伤害也就越大。 由于受这两种因
素的共同作用, 必然存在着一个最佳冷冻速度,
对应于超低温保存的最高存活率, 因此降温速度
与冻存细胞的存活率之间是一条倒 U 型曲线
(Karlsson和 Toner, 2000)。
可见, 控制降温速度实际上还是调节细胞的
水分含量, 其作用效果跟温带植物在寒冷天气来
临前降低体内水分含量是一样的。 一定限度的脱
水是必需的, 但过度脱水又会导致脱水伤害。 这
说明, 细胞内的水分至少有两种存在形式, 一种
是可冻结的, 一种是不可冻结的, 称为可冻结水
和不可冻结水, 需要脱除的只是可冻结的部分。
示差热分析 ( Differential Thermal Analysis,
DTA) 和后来使用更多的示差扫描量热技术
(Differential Scanning Carolemeter, DSC) 是研究
种子水分存在状态的重要手段。 该方法的基本原
理是通过样品在降温过程或升温过程中放热峰或
吸热峰出现时的温度范围判断样品内水分的状态
变化。 Vertucci 等 ( 1991 ) 研究了 Landolphia
kirkii胚轴低温处理过程中生命力与 DSC 放热峰
的关系, 发现在 0益附近的一个放热峰跟该植物
胚轴的生命力有关, 这个放热峰出现胚轴就冻
死, 不出现胚轴就存活。 Pritchard 和 Manger
(1998) 使用该方法研究了欧亚栎胚轴脱水过程
中水分变化与脱水胁迫的关系, 发现对应于两种
状态的水分存在有两种类型的脱水伤害, 一个是
随着自由水移除产生的时间依赖性的、 潜在可修
复的伤害, 接下来是一个因结合水移除产生的不
可修复的伤害。 Vertucci (1989a) 通过对豌豆和
大豆子叶的水热特性研究, 认为种子水分至少有
5 个不同的存在状态。 另外, 核磁共振技术也可
以用来检测种子内部水分的存在状态, 姜孝成等
(1996) 用该方法检测出了正常性种子和顽拗性
种子在脱水过程中水分状态变化的显著差别。
温带植物为了适应低温还普遍表现出细胞内
可溶性糖浓度上升的现象, 而且可溶性糖浓度的
变化与植物的低温耐性呈显著的正相关, 这说明
可溶性糖是植物体内的保护性物质。 海藻糖被认
为是可溶性糖中保护效果最好的植物体内保护性
物质, 对植物抗御低温和脱水胁迫都有益处, 在
低等植物中广泛存在, 但在高等植物体内通常缺
少海藻糖。 而具有类似功能的、 又在高等植物体
内广泛存在的可溶性糖类是蔗糖。 在超低温保存
过程中使用蔗糖预培养也可以提高材料的超低温
耐性。 关于可溶性糖保护作用的机理, 存在水分
替代假说和玻璃化假说两种解释。 糖替代假说认
为, 糖类可以替代膜磷脂和蛋白极性基团周围的
水分, 通过与这些极性基团发生氢键键合保持这
些大分子在无水状态下结构完整, 保持膜和蛋白
具有类似水合状态下的物理结构。 而玻璃化假说
认为, 糖类能够提高溶液的粘滞度, 促进玻璃态
的形成, 并由此保持膜和蛋白的结构稳定。 实际
上, 这两方面的作用并不是互相排斥的, 在冷冻
和脱水的材料中这两方面的作用都可能存在。
耐寒植物的抗冻行为研究给了低温生物学灵
感。 受此启发在超低温保存过程中通过添加高浓
度的低温保护物质, 提高细胞质的溶液浓度, 可
以改变水分的结合状态, 防止其在低温条件下形
成冰晶。 玻璃化法正是基于这个原理。 玻璃化是
指液态物质在降温过程中由于粘度极度增加而呈
无定型态固化, 而非结晶态固化。 在玻璃化过程
中, 溶液被认为是变成了玻璃态物质, 分子的线
性运动显著降低, 生物时间被有效中止, 而不引
起其他的改变 (Fahy 等, 1984)。 玻璃态是普遍
存在的自然现象, 在脱水后的玉米胚中就观察到
了玻璃态 (Williams 和 Leopold, 1989; Sun 和
Leopold, 1994)。 但常规溶液要实现玻璃化需要
具有很高的浓度并降低到很低的温度 (这些都
可以提高溶液的粘度), 而且需要有很快的降温
速度, 因为在快速降温过程中水分子来不及按晶
体规律排列, 也就不能形成冰晶。
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因此, 植物的超低温耐性与其脱水耐性、 过
冷却能力和玻璃化能力密切相关, 而这些又都与
植物体内的水分状态和保护性物质的含量是分不
开的。 在植物细胞中, 这样的保护性物质主要是
可溶性糖和可溶性蛋白。 因为超低温保存与脱水
密切相关, 降温会导致冷冻脱水, 或者超低温保
存前就要进行材料的脱水处理, 因此凡能增强脱
水耐性的化学物质也都同时具有增强超低温耐性
的功能, 如可溶性糖、 胚胎发育后期丰富蛋白
(Lea蛋白)。 可溶性糖, 特别是单糖, 如蔗糖和
棉子糖, 除能通过提高植物的脱水耐性来增强植
物的低温耐性外, 还通过降低过冷却点和增强玻
璃化能力, 提高植物的低温耐性。 植物体内的各
种可溶性蛋白, 包括热稳定蛋白和 Lea 蛋白, 也
都有利于低温耐性的提高。
抗冻蛋白 ( antifreeze proteins) 是一类功能
特殊的蛋白, 最初发现于南极生长的鱼类血液
中。 这些鱼类在平均结冰温度为-1. 9益的海水
中完成生活周期, 这一温度比典型的海洋鱼类体
液的结冰温度还要低约 1益, 因此表现出明显的
低温耐性。 后来在南、 北半球极地和近极地的多
种鱼类、 昆虫、 蜘蛛、 蜈蚣、 螨类和植物体内都
发现了抗冻蛋白。 这些抗冻蛋白结构多样, 不具
有同源性, 抗冻效果相差极大, 但都能够在不改
变融化温度的同时把结冰温度降低到融化温度以
下 0. 5 ~ 1. 0益, 这种现象称为 “热迟滞冶 ( ther鄄
mal hysteresis)。 抗冻蛋白的作用机理目前还不
是很清楚, 一般认为, 抗冻蛋白能够有选择性地
与冰晶的表面接合, 吸附在冰晶上, 阻止冰晶沿
着棱柱侧面的生长, 但容许冰晶沿着基面有限的
生长。 因此, 在有抗冻蛋白存在的情况下, 冰晶
只能长成 “针刺状冶, 降低了冰晶的大小和生长
速度, 并以非依数性的方式迟滞水溶液的冰点。
在细胞水平上, 超低温耐性与细胞的类型、
细胞膜透性和细胞的生理状态有关。 例如, 植物
的分生组织细胞, 因为具有个体小、 胞质浓、 液
泡少、 核 /质比高的特点, 具有较高的超低温耐
性。 而悬浮细胞超低温保存的实验表明, 处于指
数增长期的细胞超低温处理后存活率最高
(Withers和 Street, 1977; Sala等, 1979)。 在器官
和个体水平上, 超低温耐性与个体的大小、 组织
构成、 发育情况、 水合状态有关。 一般说来, 较
小的个体由于细胞组成均一又便于调控含水量,
在升 /降温过程中受热均匀, 因此冻融处理后存
活率较高。 温带植物的一些特殊结构有利于实现
过冷却, 保护植物的一些重要器官免受冻害,
如桃的花芽 ( Ashworth, 1982 )、 葡萄的芽心
(Jones 等, 2000)、 莴苣瘦果的果壳 (Keefe 和
Moore, 1981)。
植物营养器官的低温耐性是动态变化着的,
从秋到冬有一个低温耐性逐步获得和提高的过
程, 从冬到春又是一个低温耐性逐渐丧失的过
程。 同时, 在植物低温耐性变化的过程中, 植物
体内保护性物质的含量, 如可溶性糖和可溶性蛋
白, 也发生着相应的变化 (Siminovitch 和 Briggs,
1949; Guy和 Haskell, 1987; Koster和 Lynch, 1992;
Arora等, 1992)。 一个常见的现象是, 许多越冬
作物可以经受严冬的低温考验, 但却常常被突如
其来的早霜冻死, 或是被严冬过后的倒春寒冻
死。 Sakai (1965) 研究了温带植物低温驯化与
小枝超低温保存后存活率的关系, 发现不同的物
种超低温保存需要的有效预冷温度不一样, 而且
同一种植物的有效预冷温度跟低温锻炼的程度有
关。 没有经过低温锻炼的或低温锻炼不完全的植
株, 需要预冷到更低的温度, 投入液氮后才能存
活; 而经过低温锻炼后的植株, 只需要初步预冷
就可以投入液氮并存活。
与植物营养体低温耐性的获得与丧失类似,
种子的超低温耐性也是变化着的。 在顽拗性种子
的超低温保存方面, 很多学者都指出种子和胚的
发育状态会影响冷冻后的生命力, 强调要选用合
适阶段的个体作为超低温保存的材料。 Abdel鄄
nour鄄Esquivel等 (1992) 选用 3 个发育阶段的咖
啡 (Coffea spp. ) 种子做胚的超低温保存, 发现
从中间发育阶段的种子中取出来的胚具有更高的
超低温耐性。 经过部分脱水并使用低温保护剂处
理后, 未完全成熟的菠萝蜜胚轴可以使用慢速冷
冻的方法成功实现超低温保存, 而使用相同的方
案却不能成功保存完全成熟的菠萝蜜胚轴
(Thammasiri, 1999; Krishnapillay, 2000)。 类似
的情况也出现在椰子离体胚的超低温保存研究中
(Assy鄄Bah 和 Engelmann, 1992a, b)。 笔者分别
以玉米胚和蒲葵胚为材料研究种子发育过程中超
低温耐性的获得, 发现发育早期的玉米胚缺少超
613摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
低温耐性, 不论在什么水分状态胚经过冻融处理
后都无一存活, 发育中期的胚具有了有限的超低
温耐性, 在一个很窄的含水量范围内玉米胚可以
经受超低温处理并存活, 随着种子的发育, 这一
含水量范围逐渐扩大, 到最大并保存到种子成
熟。 蒲葵胚的超低温耐性也是随着种子的发育逐
步获得的, 但最大的超低温耐性出现在种子发育
的中间阶段, 种子成熟时胚的超低温耐性又逐渐
降低 (Wen和 Song, 2007a, b)。
植物的超低温耐性是可以诱导的, 低温预处
理、 渗透胁迫处理、 ABA 预培养处理和蔗糖预
培养处理都可以诱导植物超低温耐性的表达和提
高 (Bagniol 和 Engelmann, 1991; Reed, 1998)。
未成熟的春小麦合子胚经 ABA 预培养 1 ~ 3 周
后, 使用二步法超低温保存, 78% ~ 100%存活,
而对照的存活率均在 20% 以下 ( Kendall 等,
1993); 油棕的体细胞胚使用 0. 75 mol·L-1蔗糖
预培养 7 d后, 再用脱水法超低温保存可以获得
成功 (Dumet 等, 1993); 龙胆 (Gentian scabra)
的腋芽 (Suzuki, 1998)、 咖啡的体细胞胚 (Ha鄄
tanaka等, 1994), 经过梯度蔗糖预培养后, 可
以成功的被超低温保存。 很多植物的悬浮培养细
胞在经过高渗透预培养后, 如溶液中添加甘露糖
醇、 蔗糖、 氨基酸等, 表现出抗冻性提高, 超低
温保存后存活率上升。 Pritchard 等 (1986a, b,
c) 研究了渗透培养对细胞生长和超低温保存的
影响, 在糖槭 (Acer pseudoplatanus) 的细胞悬浮
培养液中分别添加 6%的甘露糖醇或山梨糖醇,
提高培养液的渗透势。 与对照相比, 在高渗透培
养液中细胞分裂次数变少, 细胞伸长生长减小,
细胞体积小而液泡少, 壁薄质浓, 超低温保存后
存活率提高。 此外, 低温驯化、 低温锻炼和
ABA预培养等都同样能导致细胞分裂减少, 胞
内溶质积累, 液胞缩小, 而这些正是植物超低温
耐性增强的生理学基础。 但同样用高渗透预培养
的大豆悬浮细胞却没有发生这样的形态变化, 也
就没有表现出超低温耐性的提高 (Pritchard 等,
1986a, b, c)。
4摇 超低温伤害的研究
Mazur等 (1972) 的二因素假说很好地解释
了冷冻过程中超低温伤害的发生。 然而, 一个完
整的超低温保存方案通常包括植株的调理、 材料
的预处理、 降温、 贮藏、 解冻、 融后处理和恢复
生长等几个阶段, 在任何一个阶段由于选用的方
法不适或操作不当都可能伤害实验样品并导致死
亡。 在超低温保存过程中, 植物材料经常遭受的
胁迫和伤害主要有如下几种类型: 1) 代谢胁迫
冷冻前的脱水处理和玻璃化溶液处理, 都需要把
待保存材料置于亚适宜生长条件下, 可能会导致
对低温和 /或脱水敏感的材料代谢不平衡, 积累
有害的代谢产物, 造成代谢胁迫; 2) 脱水胁迫
冷冻前的脱水处理、 玻璃化处理和慢速冷冻过程
中的冷冻脱水, 都有可能会造成材料过度脱水,
从而引起细胞收缩、 变形, 细胞内外液溶质浓度
升高, pH值发生变化, 胞内生化环境恶化; 3)
结冰伤害摇 在冷冻过程中因为降温速度太快, 或
者解冻过程中因为升温太慢而出现脱玻璃化, 会
导致细胞内冰晶形成, 原生质各组分之间发生分
割, 并伤害质膜和细胞器; 4) 化学毒害摇 长时
间高浓度玻璃化溶液处理和因失水导致的细胞内
盐浓度升高, 可能会引起蛋白质凝聚、 变性, 对
细胞产生化学毒害; 5) 机械损伤摇 冷冻前的材
料脱水和解冻后的细胞吸水可能会导致细胞体积
剧烈变化和质壁分离, 对细胞产生机械损害, 胞
外结冰产生的大块冰晶对细胞的挤压, 还有大块
材料在冻融过程中因受热不均衡也可能产生机械
伤害; 6) 油体损伤摇 油料植物的种子在超低温
保存过程中容易因为油体破裂导致生命力丧失。
这些胁迫和伤害过程并不是相互割裂的, 常常是
互为因果, 伴随出现的。
顽拗性种子因为对脱水高度敏感, 常常在自
由水被脱除前就丧失了生命力, 这类种子冷冻前
脱水不够会招致结冰伤害, 脱水过多又会造成脱
水伤害, 超低温保存非常困难。 Hor 等 (1990)
认为存在一个临界含水量 (下限) 和一个最高
冻结含水量 (上限), 含水量高于最高冻结含水
量的种子遇到零下低温会因胞内结冰遭受伤害,
把种子脱水到临界含水量以下则会导致脱水伤
害。 正常性种子因为最高冻结含水量较高且临界
含水量较低, 二者之间存在一个 “窗口冶, 因此
只要充分干燥就可以顺利实现超低温保存。 顽拗
性种子和中间型种子则没有这样一个含水量
“窗口冶 或 “窗口冶 很小, 因此一般不能耐受零
7133 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文摇 彬: 植物种质资源超低温保存概述摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
下低温。 但采用快速脱水的方法 ( flash drying)
可以让材料在短时间内降低含水量, 减少因水分
丧失引起的代谢胁迫伤害, 把材料脱水到比较低
的含水量而保存比较高的活力, 实际上是降低了
种子的临界含水量 (下限), 有可能成功实现超
低温保存或提高超低温保存后的存活率。
一般认为, 正常性种子因为耐脱水, 在最高
冻结含水量和临界含水量之间存在一个比较宽的
“窗口冶, 可以在冷冻前把自由水安全的移除,
超低温保存比较容易取得成功, 但也有例外。 金
合欢等硬实种子在超低温保存过程中常常因为受
热不均匀遭致机械伤害, 种子破裂并伤害到胚而
影响萌发。 富含油脂的正常性种子 (油料植物
种子), 虽然具有很高的脱水耐性, 但在快速冷
冻的情况下, 很容易遭受超低温伤害, 如芝麻
(Stanwood, 1987 )、 大豆和向日葵 ( Vertucci,
1989b)。 这是因为油料种子贮油体与水分的相
互作用会促进大冰晶的形成, 导致电解质泄露
(Vertucci, 1989a), 称作油脂丰富种子对冷冻速
率的敏感性。 油棕、 咖啡、 柑橘等中间型种子具
有一定程度的脱水耐性, 但在超低温保存过程中
容易因为过度脱水而死亡。 油棕种仁在冷冻前把
含水量从 6%回升到 30% (以干重为基础), 可
以提高超低温保存后的存活率 (Engelmann 等,
1995), 柑橘类种子冷冻前先在 25益和 75% ~
80%的相对湿度下平衡水分, 然后再进行超低温
保存, 融后存活率最高 (Hor等, 2005)。
顽拗性种子易于招致超低温伤害很大程度上
源于其细胞保持活跃的生长状态, 具有丰富的线
粒体、 内膜系统和大的液胞而缺少脂肪体、 蛋白
体和淀粉粒这样一些特点。 跟动物细胞不同的
是, 植物细胞通常具有细胞壁和液泡。 液泡的主
要内容物质是水, 冷冻过程中很容易结冰引起伤
害, 是导致超低温保存失败的主要方面; 而细胞
壁的存在容易引起植物细胞在冻融过程中发生机
械伤害, 是导致超低温保存失败的另一重要原因
(Tao等, 1983)。 胞内结冰是造成超低温保存过
程中细胞死亡的主要原因 (Maurze, 1984), 这
不仅可能会出现在材料的降温阶段, 也可能出现
在材料的升温阶段。 从大约-3益到-50益的温度
范围是冰晶生长最容易发生的区间, 称为超低温
伤害的 “危险温度区冶, 含有自由水的材料在快
速冷冻过程中通过这一温度区间时细胞内部可能
因为同核结晶形成微小的冰晶。 这些冰晶本身并
不会对细胞造成伤害, 但如果解冻时升温速度太
慢, 更多的自由水以这些微小冰晶为结晶核发生
重结晶, 导致冰晶长大, 就会对细胞造成伤害
(Sakai, 1966)。 采用快速解冻法, 把材料从液
氮中取出来立即投入 37益的水浴中并不断搅拌,
使材料以 120益 / min的升温速度快速通过危险温
度区, 就可以有效地避免重结晶的发生。 但大块
材料使用快速升温又可能会因为受热不均匀造成
机械伤害。
伤害发生的原动力和位点是超低温伤害机理
研究需要阐明的主要内容。 蛋白质变性可能是植
物冷冻伤害的重要方面。 植物冻害和抗冻耐性的
巯基-二硫键假说认为, 蛋白质分子中包含有较
多的硫氢键是蛋白质变性和植物冻害发生的主要
原因。 在低温条件下, 蛋白质分子间的两分子硫
氢键被氧化脱氢, 形成一分子的二硫键, 使蛋白
质发生结构变化, 凝聚, 功能丧失 ( Levitt,
1962)。 众多的研究发现, 植物细胞在冻害发生
后, 单位蛋白含有的硫氢键减少了, 而二硫键增
多了, 说明冷冻导致二硫键的形成。 低温锻炼可
以诱导不含硫氢键的蛋白大量合成, 而含硫氢键
的蛋白合成较少, 因此单位蛋白含有的硫氢键减
少了, 植物抗冻性就增强了 (Morton, 1969)。
与超低温保存相关的伤害还可能发生在材料
的融后阶段, 这其中最常见的就是吸涨伤害。 脱
水和降温都可能会使细胞膜的脂质层发生相变,
细胞膜从液晶态变成六角形的结构, 这时候把种
子播种到富含自由水的基质上萌发或是把胚接种
到培养基上恢复生长, 特别是当含水量降得很低
的材料在低温下快速吸水的时候, 就容易产生吸
涨伤害, 电解质大量泄漏, 因为这样的条件下快
速复水会阻止细胞膜正确的重组为层状相
( Shivanna 和 Heslop鄄Harrison, 1981; Woodstock
和 Tao, 1981)。 超低温保存过的咖啡种子, 极易
于因为吸涨性的膜伤害导致生命力丧失, 但只要
先在 37益和水饱和的湿空气中预吸湿 24 h, 就
可以有效的防止伤害发生 (Dussert等, 2003), 说
明这样的处理有利于受伤膜的修复, 恢复细胞膜
的流动性和透过性。 另外, 前面介绍的低温驯化
和蔗糖预培养等诱导和提高植物低温耐性的各种
813摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
方法, 也都跟这些方法能够改善细胞膜的性状有
关。 例如, 低温驯化导致细胞膜的蛋白和脂类在
总量和组成方面都发生改变 (Uemura和 Yoshida,
1984; Lynch和 Steponkus, 1987)。
细胞质膜和各种细胞器膜是最容易受到伤害
的位点 (Steponkus, 1984)。 植物细胞膜是由磷
脂和蛋白质构成的, 具有流动镶嵌结构, 这种特
殊结构使得细胞膜脂有很好的流动性, 在把原生
质与外界环境分隔开的同时, 又通过扩散、 主动
运输的方式把细胞内外环境联系起来。 在脱水和
低温的胁迫下, 植物细胞膜从液晶态转变为凝胶
态, 膜收缩, 出现裂缝或者通道。 这一方面使膜
的透性增大, 细胞内溶物外渗; 另一方面使膜结
合酶系统受到破坏, 酶活性下降, 膜结合酶系统
与非膜结合酶系统的平衡丧失。 于是细胞代谢紊
乱, 有害中间代谢产物积累, 细胞受害和死亡。
测量冻融处理后细胞电解质的泄漏是了解超
低温保存过程中植物细胞遭受超低温伤害的重要
方法。 植物细胞质中溶解有很多带电荷的水溶性
的颗粒, 如果细胞膜的完整性或是膜透性受到伤
害就会导致膜的选择性透过功能受损, 细胞吸涨
时胞内电解质外漏, 溶液的电导率明显升高。 因
此, 浸出液的电导率与细胞膜受损伤程度呈正相
关。 超低温保存过程中因为细胞膜受伤害导致电
解质外漏是很普遍的现象 (Gusta 等, 1982; Fu鄄
jikawa, 1995; 郑郁善等, 2001)。
细胞显微和超显微结构的观察是一种直接观
察超低温伤害的有效方法, 在超低温伤害的研究
中很常用 (Zavala和 FInkle, 1983; Jensen和 Oett鄄
meier, 1984; Mari 等, 1995)。 Berjak 等 (1999)
利用细胞显微技术比较了两个不成功方案和一个
成功方案在保存欧亚栎胚轴过程中细胞结构方面
遭受的伤害, 发现胁迫伤害是积累的, 冷冻前过
于严格的表面灭菌和长时间脱水本身也许并不是
致命的伤害, 但再跟冷冻胁迫结合在一起的时候
就成为致命的伤害了。 Sakai 和 Otsuka (1967)
观察到超低温伤害跟结冰事件的关系, 冻融处理
后死亡的样品在电子显微镜下可见冰晶融化后留
下的空洞。 Isaacs 和 Mycock (1999) 研究了玉
米种子吸涨处理和超低温伤害的关系, 发现冷冻
前吸水仅导致轻微冷冻伤害的发生, 但当线粒体
内重新发育出嵴并恢复活跃代谢的时候严重的超
低温伤害就明显可见了。 Wang 等 (1998) 通过
对水稻胚性悬浮细胞玻璃化法超低温保存的研究
发现, 细胞结构的伤害主要发生在冷冻处理前的
玻璃化溶液处理过程中, 冻融处理并没有导致更
多的细胞形态变化。 另外, 可以使用低温显微镜
观察超低温保存过程中冰晶形成的动态过程。
如果膜透性的变化和细胞结构变化表现的主
要是超低温保存过程中的原初伤害, 则抗氧化酶
分析研究的主要是超低温保存过程中的次生伤
害。 活性氧伤害可能是超低温伤害的一个重要方
面。 低温胁迫和冻 /融处理一方面会诱导细胞的
活性氧防御体系发生改变, 导致抗氧化酶系统的
有效运转受到抑制或功能受到损害 (Lee 和 Lee,
2000), 另一方面, 会促进自由基的产生 (Ben鄄
son, 1988), 加速细胞内有害代谢产物的积累
(Fleck等, 1999), 从而活性氧伤害的发生就不
可避免了。 蛋白质、 核酸、 质膜都可能成为活性
氧攻击的目标。 超低温保存中的活性氧伤害具有
随时间推移逐渐加重和累积的特点, 如超低温保
存的 neem种子 (Varghese和 Naithani, 2008)。
与对照相比, 超低温保存后的材料一般恢复
生长比较缓慢, 说明存在着一个修复超低温伤害
的过程。 有时在解冻后和恢复生长前使用一些特
定的方法可以促进超低温伤害的修复, 提高种子
活力。 使用渗调处理和预吸湿处理预防吸涨伤害
的过程中就存在超低温伤害的修复, 在这个过程
中, 不仅受损伤的膜功能被修复, 抗氧化酶恢复
有效的运转, 而且受损伤的 rRNA 被替换, 蛋白
质和 DNA的伤害也可以被修复, 从而提高冻融
后种子的活力; 一些植物的胚在经过超低温保存
后对恢复生长培养基有了新的要求, 如未成熟的
咖啡胚经超低温保存后仅有一半存活, 但若在恢
复生长培养基中添加 GA3, 存活率可以提高到
80%以上 (Abdelnour鄄Esquivel 等, 1992); 胚和
胚轴在经过冻融处理后活性氧防御系统功能都会
有所降低, 因此恢复生长的初期都需要一段时间
的暗培养以避免光氧化伤害, 待活性氧防御系统
功能恢复到正常状态后就可以在常规条件下
培养了; 还有, 一些植物的胚或胚轴在经过超
低温保存后丧失了向地性, 需要用含钙镁离子的
溶液处理以重建细胞骨架 ( Berjak 和 Mycock,
2004)。
9133 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文摇 彬: 植物种质资源超低温保存概述摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
5摇 植物超低温保存的常用方法
如前所述, 一个完整的超低温保存过程通常
包括植株的调理、 材料的预处理、 降温、 贮存、
解冻、 融后处理、 恢复生长等几个阶段, 每一个
阶段又可以使用不同的技术和方法, 各种预处理
和冻、 融方式的具体操作方法可以参考有关文献
(文彬和宋松泉, 2005a, b)。 实际上, 这些方法
和技术是可以互相借用和组合的, 从而成为不同
的超低温保存方案。 不同物种的超低温保存需要
使用不同的方案。 每一个研究者为每一种材料设
计的超低温保存方案都是各具特色的, 但为了学
术交流的方便, 还是需要根据超低温保存过程中
材料的预处理和冻、 融等几个关键步骤所使用具
体方法的特点, 定义一些基本的超低温保存方
法。 需要说明的是, 不论使用哪一种超低温保存
方法, 做好材料的调理这一步对超低温保存的成
功至关重要。 材料的调理是指选用健康、 无病虫
害的植株并将材料调整到最适合超低温保存的生
理状态。 在此仅把几种常用的超低温保存方法的
基本原理及应用情况做一个简单的介绍:
5. 1摇 传统的二步冷冻法
二步冷冻法是在 Polge 等 (1949) 成功保存
动物精子的基础上发展起来的。 先使用低温保护
剂对保存材料进行预处理, 再用程序降温仪以
0. 1 ~1. 0益 / min 的速度把待保存材料降温至
-30益 ~ -40益, 有时需要人工诱导胞外结冰,
并在此温度下保持一段时间, 然后投入液氮。 第
一步降温是慢速降温, 降温的速度很重要, 各种
植物材料的最佳降温速度很不相同, 在细胞水平
上, 这主要是由细胞膜的透水性能所决定, 而在
器官水平上则取决于植物完成低温驯化的程度。
该方法的主要原理是, 通过第一步慢速降温促进
细胞冷冻脱水和过冷却, 脱除细胞内的可冻结
水, 以防止第二步快速降温时造成伤害。 低温保
护剂作用的确切机理仍然不很清楚, 这类物质具
有一定的渗透调节作用, 可以引起细胞脱水, 还
可能具有保护细胞膜和酶结合位点免受冻害的作
用。 常用的低温保护剂有甘油、 甘露醇、 二甲亚
砜等。
5. 2摇 简化的二步冷冻法
传统的二步冷冻法因为需要使用程序降温仪
等昂贵设备, 其广泛应用受到了严重的限制, 人
们想出其它办法来解决这一难题。 实践中, 有时
可以使用家用冰箱的冷冻室 ( -20益), 把添加
了低温保护剂的待保存材料放入冷冻室降温到
-20益并保持一段时间, 然后投入液氮中, 某些
材料可以用这种方法降温并取得了不错的保存效
果。 有研究者通过使用具有不同隔热性能的容器
装载待保存材料来调节投入液氮后的降温速度,
还有的通过在盛装待保存材料的容器外套上不同
厚度的泡沫隔热层来调节投入液氮后的降温速度
(Finkle等, 1974)。 另外, Nalgene公司设计了一
种程序降温盒 Mr Forsty, 盒中灌满异丙醇, 装好
待保存材料后把程序降温盒放进-70益深低温冰箱
中约 6 h, 就可以使待保存材料以接近 1. 0益 / min
的速度降温到-40益, 然后投入液氮中, 对一些
材料的超低温保存很有效。
5. 3摇 微滴法
该方法是在超低温保存木薯 (Manihot escu鄄
lenta) 的分生组织过程中首先创造出来的
(Kartha等, 1982)。 方法是先把低温保护剂滴到
铝箔条上形成 2 ~ 3 滋L的微滴, 然后把待保存材
料放置到微滴之中, 把铝箔连同微滴一起送入程
序降温仪的冷冻室, 按一定的速度降温到-20益
~ -40益, 然后投入液氮中。 该方法的主要优点
是使用极少量的低温保护剂, 并利用铝箔良好的
导热性能, 以提高待保存材料降 /升温的均匀一
致, 减少因为材料降温速度不均匀而造成的伤
害。 另外, 也有用微细玻璃管、 金属环等代替铝
箔条进行微滴法超低温保存的, 原理基本一致。
5. 4摇 脱水法
该方法的原理是在冷冻前先用人工的方法把
待保存材料中的自由水脱除, 以防止冷冻过程中
结冰对细胞造成伤害。 耐脱水的种子对脱水速率
没有要求, 但顽拗性种子则需要快速脱水, 而且
常常是用胚或胚轴做超低温保存的目标材料。 快
速脱水可以通过活化硅胶吸除水分或通过无菌气
流带走水分来实现。 在顽拗性 /中间型种子方面,
Grout等 (1983) 首先使用这一方法保存了油棕
的胚, 后来这一方法又被用来成功的保存了许多
植物, 如咖啡 ( Abdelnour鄄Esquivel 等, 1992)、
蒲葵 (Wen和 Song, 2007b) 等。 有一些植物的
种子和孢子, 不需要经过脱水处理就可以直接投
入液氮中并成功的实现超低温保存, 如前文所述
023摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
的超低温保存的早期试验 (Selby, 1901; Lipman
和 Lewis, 1934; Lipman, 1936), 实际上也可以
归入到脱水法中来, 只是这些材料本身的含水量
很低, 省去了人工脱水的过程, 或者说材料的水
分是被自然脱去的而不是人工脱去的, 因而可称
做直冷法。
5. 5摇 包埋法和包埋脱水法
包埋法是借用人工种子的技术发展起来的,
其主要步骤是在冷冻前先把待保存材料悬浮在含
有高浓度的甘油、 蔗糖的海藻酸钠溶液中, 然后
用滴管把待保存材料滴到含有相同浓度的甘油、
蔗糖的氯化钙溶液中, 静置一段时间让海藻酸钙
螯合和固化, 在待保存材料表面形成一个包裹
层, 成为包埋珠。 在包埋处理的过程中, 因为渗
透脱水等原因待保存材料的低温耐性有一定的提
高, 同时材料外的包裹层又具有一定的保护作
用, 可以减轻接下来的脱水、 玻璃化及冷冻处理
对材料的伤害。 包埋珠经吸干表面水分后, 可以
直接用于冷冻保存, 如烟草悬浮细胞 ( Koba鄄
yashi, 2005), 但是更多的材料在包埋后还需要
经过进一步脱水或玻璃化处理才能实施冷冻保
存, 具体情况依种而定。 Solanum phureja (Fabre
和 Dereuddre, 1990)、 梨 (Dereuddre等, 1990)、
葡萄 (Plessis等, 1991) 的茎尖和胡萝卜的体细
胞胚 (Dereuddre 等, 1991a, b) 是最早用包埋
脱水法成功超低温保存的材料。 目前, 文献报道
使用该方法成功实现超低温保存的植物材料有近
百种 (Gonzalez鄄Arnao和 Engelmann, 2006)。
5. 6摇 玻璃化法、 包埋玻璃化法和微滴玻璃化法
玻璃化是指液相物质被过冷却到深低温, 在
冷冻过程中不出现结晶现象, 并最终固化成无定
形的玻璃样状态的过程。 玻璃化法的原理是利用
高浓度的玻璃化溶液处理待保存材料, 玻璃化溶
液中有些成分可以引起细胞脱水, 有些成分可以
渗透进入原生质, 从而极大的提高了原生质的粘
滞程度, 因此在接下来的快速降温过程中细胞内
的水分子来不及按冰晶方式排列而呈玻璃态, 或
只能形成极微小的冰晶, 避免对细胞造成伤害。
该方法起源于动物学方面的超低温保存, 小鼠胚
最早报道用玻璃化法成功实现了超低温保存
(Rall 和 Fahy, 1985), 使用的玻璃化溶液称为
VS1, 但 VS1 在植物材料的超低温保存中效果很
不好, 植物材料超低温保存中常用的玻璃化溶液
是 PVS1、 PVS2 和 PVS3。 文献记载使用玻璃化
法成功超低温保存的植物有 130 余种 (Sakai 和
Engelmann, 2007), 绝大多数都是使用 PVS2。
包埋玻璃化法是先把材料包埋成海藻酸钙的小
珠, 然后按玻璃化法的程序处理。 到目前已有
10 多种植物材料用该方法成功实现了超低温保
存 (Sakai 和 Engelmann, 2007), 其中山葵的顶
端分生组织是最先使用这一方法的例子 (Matsu鄄
moto等, 1995)。 微滴玻璃化法是结合了玻璃化
法和微滴法的技术, 待保存材料先用玻璃化溶液
处理, 然后单个放到铝箔片上的玻璃化溶液微滴
中, 投入液氮快速冷冻, 因为表面张力的作用,
操作过程中微滴并不会从铝箔条上滑落。 该方法
是近些年创造出来的, 目前用该法保存的植物材
料也有 10 多种 (Sakai和 Engelmann, 2007)。
虽然植物种质资源超低温保存的方法多种多
样, 但经验告诉我们, 并不是这些方法对每一种
材料都适用。 对一个具体的植物样品而言, 采用
哪一种方法能够实现超低温保存, 通过怎样的预
处理和融后处理能够提高超低温保存后的存活
率, 不能一概而论, 需要根据材料的具体情况而
定。 实际上, 任何一种材料都只能通过试验才有
可能摸索出适合的超低温保存方案。 超低温保存
的总体方向是, 在追求更好的超低温保存结果的
同时, 力图使超低温保存实验重复性好、 操作简
单、 省时省事省钱。
6摇 顽拗性种质资源超低温保存的现状与
展望
Roberts (1973) 定义了顽拗性种子 ( recal鄄
citrant seeds), 并预言超低温保存是唯一的和最
有希望能够长期保存顽拗性种子的方法 (Ro鄄
berts, 1975)。 在目睹了长期保存顽拗性种子的
许多努力终归失败, 而顽拗性种子的超低温保存
不断取得进展之后, 越来越多的人认同超低温保
存是顽拗性种子长期保存唯一和最有希望的方法
(King和 Roberts, 1979; Roberts 等, 1984; Chin,
1989; Berjak和 Pammenter, 2001, 2004; Pritchard
和 Dickie, 2003; Engelmann, 2000, 2004; Hor
等, 2005)。 但顽拗性种子的超低温保存还有很
大的难度, 仍然处在试验和摸索阶段。 目前, 顽
1233 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文摇 彬: 植物种质资源超低温保存概述摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
拗性种子依然是植物种质资源超低温保存需要研
究的重点和难点。
尽管提出顽拗性种子的概念已经有 30 多年,
提出用超低温方法保存顽拗性种子也有 30 多年,
而且超低温保存是顽拗性种子长期贮藏的唯一和
最有希望的方法已经成为广泛的共识, 但目前顽
拗性种子超低温保存的技术和方法还很不成熟,
成功的例子也不多。 在顽拗性种子超低温保存的
实验中, 经验和机遇有着很重要的作用, 失败的
事例要远多于成功的事例, 即便是在超低温保存
的方法和技术确定之后, 材料的选择、 处理的把
握等仍然可以决定实验是成功还是失败 (Krish鄄
napillay, 2000; Panis 等, 2005)。 对同一种材料
使用同一种方法进行超低温保存, 不同的实验室
得出不同的结果, 这样的事例很多, 如 Kartha
等 (1982)、 Reed 等 (2001)、 Panis 等 (2005)
等。 成功的超低温保存至少应该以材料解冻之后
能够恢复生长成苗为标准, 但在很多研究中还只
能得到愈伤组织或不完全的幼苗。 造成顽拗性种
子超低温保存不成功的原因很多, 如对材料的生
物学特性缺乏了解, 材料的生理状态不理想, 或
者超低温处理后材料恢复生长所需要的条件发生
了变化等等。 但更多的问题来自超低温冻融处理
和种子顽拗性本身, 例如, 种子太大, 含水量太
高, 对低温和脱水敏感等等。
关于顽拗性种质资源的超低温保存, 我们欣
喜地看到, 经过许多人的共同努力已经取得了一
些重要的成果和进展。 最初的实验发现咖啡种子
超低温保存后不能存活 (Becwar 等, 1983), 随
着研究的深入, 逐渐发现种子的含水量、 冷冻方
式、 解冻速度和复水过程对咖啡种子的融后存活
都有重要影响, 在此基础上优化超低温保存方
案, 从而获得了满意的融后成苗率 (Dussert 和
Engelmann, 2006)。 近 30 年来, 伴随着每一个
新思想的迸发和每一个新方法的诞生, 都涌现一
些顽拗性种质资源成功超低温保存的报道。 同
时, 植物超低温耐性的机理逐渐清楚, 已经可以
通过一些手段诱导产生和提高某些植物的超低温
耐性。 超低温伤害的研究又让我们对超低温保存
过程中伤害发生的原因有了越来越多的了解, 为
我们设计和优化超低温保存方案提供了理论依
据。 超低温保存研究中, 可以通过对一些关键步
骤技术指标的优化, 包括超低温保存对象的选
择, 材料调理、 预处理、 冷冻、 贮存、 融冻、 融
后处理和恢复生长等的优化, 提高超低温保存成
功机率。 植物细胞的液胞和细胞壁被认为是影响
植物材料超低温保存的两个主要障碍, 超低温保
存过程中选用分化程度低的分生组织或指数生长
期的悬浮培养细胞就可以比较好地避开液胞的不
利影响, 而选用原生质体作为超低温保存材料又
可以避免细胞壁的不利影响, 基于这样的思想,
芒果 (Wu 等, 2003)、 荔枝和龙眼 (郭玉琼,
2007) 的超低温保存都获得了成功。 另外, 有
一些生产顽拗性种子的植物, 种子和胚的超低温
保存都很困难, 但花粉却是耐脱水的, 可以成功
实现超低温保存, 如黄皮 (陈佳瑛等, 2007)。
此外, 一些在动物学和医学实验中被证明行之有
效的技术还很少在顽拗性种子的超低温保存中试
用。 如动物学和医学实验中常常以只含有几个细
胞的卵为材料并超低温保存成功; 还有通过操纵
锌离子浓度调控细胞膜上微孔的开关来调节细胞
对低温保护物质的摄入; 采用射入的方法把材料
投入液氮提高冷冻过程中的降温速度; 通过低压
蒸发以降低液氮的温度来促进材料在降温过程中
实现玻璃化等等。
同时, 我们也清醒地看到, 目前能够成功地
超低温保存的顽拗性种子还非常有限, 也还没有
一个成熟的技术可以普遍适用于顽拗性种子的超
低温保存, 能够通过低温驯化、 低温锻炼和各种
预处理方法诱导产生和提高超低温耐性的主要是
正常性种子、 中间型种子和温带起源的顽拗性种
子, 而热带起源的典型的顽拗性种子很少有可以
通过这些方法诱导产生超低温耐性的。 另外, 顽
拗性种子在对低温和脱水敏感的同时, 对低温保
护剂、 玻璃化溶液和各种诱导低温耐性的预处理
也都很敏感。 而且, 热带起源的典型的顽拗性种
子在组织培养方面也表现出很强的顽拗性, 如龙
脑香科植物, 要想通过组织培养的方法脱分化产
生愈伤组织也是件难事。 这些现象不应该简单的
理解为偶然的、 孤立的事件, 而很可能是与种子
顽拗性联系在一起的, 或者说就是种子顽拗性的
一部分。 因此, 把使用正常性种子建立起来的各
种提高超低温耐性的技术简单地搬到顽拗性种
子的超低温保存中来, 并期望获得跟正常性种
223摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
子超低温保存相似的成功, 结果往往都是失败。
每年都有很多关于植物种质资源被成功超低
温保存的报道, 估计到目前已经有 800 ~ 1 000
种高等植物材料被成功地超低温保存 (这个数
字不包括被超低温保存的正常性种子), 但其中
属于热带植物的很少, 生产顽拗性种子的植物也
很少, 生产顽拗性种子的热带植物就更少。 原产
于热带地区的、 生产顽拗性种子的植物以种子或
胚为对象保存成功的仅有南洋杉 ( Pritchard 和
Prendergast, 1986)、 菠萝蜜 (Thammasiri, 1999;
Krishnapillay, 2000)、 椰子 (Assy鄄Bah, Engelm鄄
ann, 1992a, b)、 可可 ( Pence, 1991a)、 橡胶
(Normah 等, 1986) 等少数几种 ( Engelmann,
1991; Panis 等, 1996; Hong 等, 1996)。 种子顽
拗性是一种复合数量性状, 是植物长期适应各自
生活环境的结果, 多样性的生境造就了多样性的
顽拗性种子类型; 不同植物的顽拗性种子具有各
自不同的生物学特点, 在顽拗性方面存在着质和
量的差别 (文彬, 2008)。 这就决定了顽拗性种
子的超低温保存存在不同的难度, 需要使用不同
的方法, 通过试验逐个摸索适合的超低温保存方
案。 经验告诉我们, 对顽拗性种子的超低温保存
应该持谨慎的乐观态度: 中间型种子、 “亚正常
性种子冶 和 “具有有限脱水耐性的正常性种子冶
的超低温保存比较容易取得成功, 超低温保存胚
或胚轴效果明显优于保存整粒种子, 小粒种子整
粒的保存比大粒种子容易, 只要操作得当, 大粒
种子的整粒保存也是有可能的; 顽拗性种子的超
低温保存就要困难得多, 而且热带起源的顽拗性
种子比温带起源的难保存, 热带起源的顽拗性种
子以湿热生境中生长的种类最难保存, 那些快速
萌发的、 脱水高度敏感的种类比具有休眠的、 临
界含水量低的种类更难保存, 除少数种类外, 顽
拗性种子的保存都需要以离体胚或胚轴为保存对
象, 需要选择合适发育阶段的材料, 精心设计超
低温保存方案并谨慎操作方有可能成功。
也参摇 考摇 文摇 献页
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筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌
更摇 正摇 启摇 事
《云南植物研究》 2009 年第 4 期发表杨君等作者论文 “箭毒木种子蛋白质
样品制备及双向电泳改良方法冶, 由于作者的疏忽, 第一作者单位漏写了 “中
国科学院研究生院冶, 现予以更正。 第一作者杨君单位为:
1 中国科学院昆明植物研究所, 中国科学院青藏高原研究所昆明部, 云南 昆明摇 650204;
2 中国科学院研究生院, 北京摇 100094
《植物分类与资源学报》 编辑部摇 摇
9233 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文摇 彬: 植物种质资源超低温保存概述摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇