全 文 ：亚热带森林乔木树种 DNA条形码研究
———以哀牢山自然保护区为例*
卢孟孟1,2, 慈秀芹1 ,2, 杨国平1, 李摇 捷1**
(1 中国科学院西双版纳热带植物园 植物系统发育与保护生物学实验室, 云南 昆明摇 650223;
2 中国科学院大学, 北京摇 100049)
摘要: 作为新一代植物志 iFlora的重要组成部分, DNA条形码已经成为物种鉴定中重要且有效的方法。 本
研究以亚热带森林的乔木树种为研究对象, 开展了 DNA条形码的尝试性工作。 为评估 DNA条形码对鉴定
亚热带森林树种的有效性, 收集并研究了来自哀牢山自然保护区内 51 科 111 属中 204 个树种的 525 个乔
木个体。 结果显示, 所选 4 个 DNA片段 ( rbcL, matK, trnH鄄psbA和 ITS) 的 PCR扩增成功率都超过 90% ;
测序成功率 rbcL和 matK最高, 分别为 90. 7%和 90. 5% , trnH鄄psbA次之 (83. 6% ), ITS最低 (73. 5% ),
表明 4 个片段在亚热带森林乔木中都具有较好的通用性。 应用 BLAST与 NJ Tree两种方法, 对物种和属水
平的鉴别成功率进行统计, 发现单片段中 ITS最高, 分别为 68. 4% ~ 81. 3%和 99. 0% ~ 100% , 核心条码
rbcL 和 matK组合的成功率是 52. 8% ~ 60. 2%和 86. 7% ~ 90. 5% , 再与补充条码 trnH鄄psbA和 ITS联合, 可
以成功鉴别 74. 7% ~ 79. 6%哀牢山自然保护区亚热带森林中的乔木物种。 由于 ITS片段在亚热带森林部分
重要树种类群 (樟科和壳斗科等) 中的测序成功率较差, 所以对这些植物类群采用 trnH鄄psbA 作为 DNA
条形码是一个更好的选择。
关键词: DNA条形码; 亚热带森林; 哀牢山自然保护区; 物种鉴别; ITS; 乔木
中图分类号: Q 949, Q 781摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-733-09
DNA Barcoding of Subtropical Forest Trees
———A Study from Ailao Mountains Nature Reserve, Yunnan, China
LU Meng鄄Meng1,2, CI Xiu鄄Qin1,2, YANG Guo鄄Ping1, LI Jie1**
(1 Laboratory of Plant Phylogenetics and Conservation, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy
of Science, Kunming 650223, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: To evaluate how effective DNA barcoding is for the identification of subtropical forest trees, we sampled
525 individuals representing 204 species in 111 genera of 51 plant families that occur in the Ailao Mountains Nature
Reserve, and tested the ability of rbcL, matK, trnH鄄psbA and ITS sequences to discriminate species. PCR success
was over 90% for each of these four sequences, while sequencing success rate was highest for rbcL and matK
(90. 7% and 90. 5% , respectively), followed by trnH鄄psbA (83. 6% ), and lowest for ITS (73. 7% ). Thus, all
four sequences showed a relatively high level of applicability for subtropical forest trees that occur in the Ailaoshan
Mountains Nature Reserve. Using two different “ species identification冶 methods - BLAST and Neighbor Joining
(NJ)—the highest rate of success for identification at species (68. 4% -81. 3% ) and genus (99. 0% -100% ) lev鄄
els was obtained using ITS when only a single region was used. When two molecular regions were used in combina鄄
tion, rbcL and matK correctly identified 52. 8% -60. 2% of species and 86. 7% -90. 5% of genera, while using all
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 733 ~ 741
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313171
*
**
基金项目: 中国科学技术基础性工作专项 (2012FY110400, 2011FY120200), 中国科学院热带森林生态学重点实验室的支持
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: jieli@ xtbg. ac. cn
收稿日期: 2013-09-04, 2013-10-14 接受发表
作者简介: 卢孟孟 (1984-) 男, 在读硕士研究生, 研究方向: 植物系统发育与保护生物学。 E鄄mail: llm505945286@ 126. com
four regions in combination correctly discriminated 74. 7% -79. 6% of species. The relatively low sequencing suc鄄
cess rate of ITS was mainly due to failure in certain groups (such as Lauraceae and Fagaceae), which play an im鄄
portant role in subtropical forest, suggesting that the ITS region may not be appropriate for DNA barcoding these par鄄
ticular plant groups.
Key words: DNA barcode; Subtropical forest trees; Ailao Mountains Nature Reserve; Species identification; ITS
摇 森林生态系统类型的自然保护区建设, 不
仅能有效保护大量的森林资源, 更重要的是保护
具有典型性和代表性的森林生态系统, 进而在科
学研究和改善生态环境方面发挥重要的作用
(薛达元和蒋明康, 1995)。 对于这类保护区的建
设, 植物多样性尤其是对构成森林生态系统主体
的乔木树种的调查是非常重要的, 它是开展生态
学及其他保护区监测工作的基础和必要步骤。 然
而, 野外工作是一项耗时费力的活动, 而针对高
大乔木时难度更大, 物种的鉴定必须依赖有丰富
野外经验的分类学家及熟悉该区域的野外工作人
员, 但目前这类人才越来越匮乏 (Chase 和 Fay,
2009)。 随着现代社会的发展、 全球气候变化以
及人类活动的加剧, 生物多样性正以空前的速率
丧失 (Sala, 2000), 生物多样性保护的迫切性
凸显出分类学力量的匮乏和传统分类学的局限。
目前, 依赖 DNA序列差异来识别物种的 DNA条
形码技术 (Hebert 等, 2003), 以其数据分析显
示出了可靠性和客观性, 已成为运用分子生物学
技术鉴定物种最经济和最有效的工具之一, 被广
泛用于生物多样性的调查和评估 ( Costion 等,
2011; Dinc伲 等, 2011; De Vere 等, 2012; Ar鄄
menise 等, 2012; De Mattia等, 2012; Dolman等,
2012; Jin 等, 2013; Ji 等, 2013)。 然而, 应用
DNA条形码来鉴定和识别亚热带森林乔木树种
的研究目前还鲜有报道。
国际生命 DNA条形码联盟植物工作组 (CBOL
Plant Working Group) 在 2009 年提出植物 DNA
条形码以叶绿体基因 rbcL 和 matK 作为核心条
码, 同时以叶绿体基因间隔区 trnH鄄psbA 和核基
因 ITS 作为补充条形码 ( CBOL Plant Working
Group, 2009), 这 4个 DNA片段都有各自的优缺
点。 核心条码 rbcL具有很好的通用性, 但对物种
的识别能力不强 (Gonzalez 等, 2009; CBOL Plant
Wording Group, 2009); 核心条码 matK 在 Lahaye
等 (2008) 和 De Vere 等 (2012) 的研究中显示
具有很好的物种鉴别作用, 但在鉴别小檗属
(Berberis) 和女贞属 (Ligustrum) 时却效果不好
(Roy 等, 2010; Gu 等, 2011 ); 而补充条码
trnH鄄psbA 也广受争议, Chase 等 (2007) 以及
Roy等 (2010) 都认为 trnH鄄psbA 是一个很好的
DNA条形码, 而 Sass 等 (2007) 的研究则反对
把它列为 DNA 条形码; 补充条码 ITS 作为唯一
的一个核基因片段, 受到质疑主要是因为其存在
多拷贝、 易受真菌污染以及测序困难等问题, 然
而, 在最近的很多研究中 ITS被认为是最有效的
DNA条形码。 Li等 (2011) 通过对中国种子植
物 75 科 141 属 1 757 种共约 6 286 个样本的研
究, 发现 ITS 具有最高的物种分辨率; Tripathi
等 (2013) 的研究也表明 ITS 和 trnH鄄psbA 对印
度热带树种来说是最适合的 DNA 条形码。 尽管
诸多学者的研究结果显示不同区域的物种鉴定成
功率有差异, 但所有研究都认为 DNA 条形码对
评估植物多样性是有效的。
位于滇中的哀牢山自然保护区分布着我国目
前面积最大 (34 483 hm2 )、 且以云南特有植物
物种为优势的亚热带常绿阔叶林, 保存着完整而
稳定的亚热带山地森林生态系统。 其中森林植被
类型多样、 生物多样性高、 生物资源丰富, 蕴藏
着许多珍稀濒危动植物资源, 如滇金丝猴、 长臂
猿、 银杏、 水青冈等, 具有重要的保护意义和研
究价值 (哀牢山自然保护区综合考察团, 1988)。
根据 2009 年出版的 《云南哀牢山种子植物》 记
录, 该地区有种子植物 199 科、 956 属和 2 242
种及 206 变种 (亚种) (朱华和闫丽春, 2009),
经统计发现其中乔木树种约为 600 种。 为评估
DNA条形码在亚热带森林乔木物种鉴定中的实
际应用能力, 我们对该地区开展了常见乔木树种
的 DNA条形码尝试性研究, 其目标主要有两个:
一是检测 DNA条形码在亚热带森林乔木树种中
的通用性; 二是评估 DNA 条形码在哀牢山常见
树种中的鉴定成功率。 通过开展该项研究, 确立
437摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
DNA条形码能否用于哀牢山地区常见乔木树种
的鉴定; 同时, 以 DNA 条形码的大批量标准数
据为核心, 结合现代植物学知识和成果以及生物
信息学, 用 iFlora 的理念, 形成具有图片信息、
地理信息及 DNA分子序列等为核心的可利用数据
库 (李德铢等, 2012), 以期为亚热带森林生物
多样性调查和生态监测平台建设提供基础数据。
1摇 材料和方法
1. 1摇 研究地点与样品采集
本研究以哀牢山自然保护区西坡徐家坝和东坡千家
寨为主要研究区域, 具体的采样地点信息见表 1。 以哀
牢山自然保护区亚热带森林中常见的乔木树种为研究对
象, 采样标准借鉴 Li等 (2011) 采取的方法, 尽可能每
个物种选择 2 个或 2 个以上的个体。 实验材料以硅胶干
燥的新鲜叶片为主, 少数无法采集到叶片的高大乔木或
者采集季节落叶的树种选取树皮韧皮部作为 DNA 提取
的材料, 共计获得乔木 525 个个体。 经专家鉴定, 确定
其隶属于 204 种 (其中有 2 个个体未能鉴定到种)、 111
属和 51 科 (按 APG III 系统), 本研究采集物种数目约
占哀牢山地区乔木树种的三分之一 (204 / 600)。 由于各
种条件的限制, 其中有 66 个物种仅采到 1 个个体。
1. 2摇 DNA提取、 扩增及测序
本研究中样品 DNA 的提取使用天根公司的植物总
DNA提取试剂盒。 选择叶绿体 rbcL、 matK 以及基因间
隔区 trnH鄄psbA与核基因 ITS 4 个分子序列作为研究的扩
增片段。 参照国际生命 DNA条形码联盟植物工作组推荐
的 PCR反应体系 (CBOL Plant Working Group, 2009),
并作出了优化和调整, 研究中用到的引物信息见表 2。
所有扩增产物均送北京六合华大基因科技有限公司
(BGI) 完成测序工作。 所得序列使用 Sequencher 4. 14
(Bromberg等, 1995) 进行拼接和校对, rbcL、 matK 和
ITS这 3 个 DNA片段在 Geneious 6. 1. 5 (Biomatters Ltd. )
中选择 ClustalX (Larkin 等, 2007) 排序, 而 trnH鄄psbA
由于序列长度变化大, 选用了软件 SAT佴 (Liu 等, 2009)
进行排序。
1. 3摇 数据分析
对 PCR扩增成功率和测序成功率的数据统计, 主要
参考了 Kress 等 (2009) 的计算方法。 PCR 扩增成功率
是 PCR扩增成功的个体数与总个体数的百分比值, 测序
成功率是获得的高质量序列数与总个体数的百分比值。
对 DNA条形码在哀牢山自然保护区亚热带森林乔木物
种中的鉴定能力评估, 研究中采用了两种常用方法, 即
BLAST和邻接树分析 (Neighbor鄄Joining Tree, NJ)。 对于
BLAST, 首先在 Geneious 6. 1. 5 (Biomatters Ltd. ) 中将 4
个 DNA 片段分别建立一个本地数据库 ( Burgess 等,
2011), 再把每条序列与数据库内的所有序列进行
BLAST, 以相同位点的百分比 ( Identical Sites) 作为量
化标准。 如果相同物种间的所有个体经过 BLAST, 发现
Identical Sites值都大于与其他所有物种个体间的 Identical
Sites值, 那么我们认为这个物种的序列得到了准确鉴
定。 对于邻接树分析 (NJ Tree) 方法, 通过构建 Tamu鄄
ra鄄Nei距离下的 NJ树, 并完成 1 000 次运算以获得拓扑
结构上的节点支持率, 在评估一个物种是否被成功鉴定
时, 只有同一个物种的所有个体在构建的 NJ 系统树上
形成单系分支, 并且 Bootstrap value逸70% , 我们才认为
该物种被成功鉴定。 这两种方法的物种鉴定成功率是通
过成功鉴定物种数与各自获得序列的总物种数的百分比
值得到的。
表 1摇 哀牢山自然保护区采样信息表
Table 1摇 The information of samples collected in Ailao Mountains Nature Reserve
采集区
Collection areas
植被类型
Vegetation type
采集地
Locality
海拔
Atitude / m
纬度
Latitude
经度
Longitude
季风常绿阔叶林
响水河
道班、 三棵桩
大黑丫口
1393
1460
2015
24毅27忆9. 5义
24毅26忆13义
24毅30忆12义
100毅54忆55义
100毅54忆09义
100毅53忆01义
徐家坝(西坡) 中山湿性常绿阔叶林
生态站入口旁
杜鹃湖
小新厂低
2395
2500
2522
24毅31忆07义
24毅32忆12义
24毅32忆57义
101毅00忆53义
101毅01忆36义
101毅01忆37义
苔藓矮林
三棵树
小新厂顶
2666
2720
24毅32忆10义
24毅33忆48义
101毅01忆52义
101毅01忆26义
千家寨(东坡)
半湿性常绿阔叶林
中山湿性常绿阔叶林
千家寨
千家寨
2000 ~ 2400
2400 ~ 2600
24毅14忆09义
24毅14忆45义
101毅17忆08义
101毅17忆49义
5376 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 卢孟孟等: 亚热带森林乔木树种 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 DNA条形码片段扩增使用的引物信息表
Table 2摇 The information of primers amplified DNA barcodes
DNA片段 Region 引物对 Primers 序列 Sequences (5忆-3忆) 来源 References
rbcL
rbcL1F
rbcL724R
ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
TCGCATGTACCTGCAGTAGC
Ivanova等, 2008
Ivanova等, 2008
matK
matK3F
matK1R
matK472F
matK1248R
CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGA
ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGG
CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC
GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC
Kim (unpublished)
Kim (unpublished)
Yu等, 2011
Yu等, 2011
trnH鄄psbA
trnH2
psbA
CGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
Fazekas等, 2010
Sang等, 1997
ITS
ITS5P
ITS8P
ITS4
GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG
CACGCTTCTCCAGACTACA
TCCTCCGCTTATTGATATGC
M觟ller and Cronk, 1997
M觟ller and Cronk, 1997
White等, 1990
2摇 结果
2. 1摇 序列通用性
对哀牢山自然保护区亚热带森林中采集到
204个物种的 525个个体进行序列统计, 发现 4个
DNA片段共获得可用序列 1 776 条, 有 98. 5%的
个体得到至少一条序列, 仅有 8 个个体没能得到
任何一条序列。 在使用的 4 个 DNA片段中, PCR
扩增成功率是 ITS最高, 为 97. 0%, 其次是 matK
(93. 1%) 和 rbcL (93. 0%), trnH鄄psbA (90. 5%)
最低。 但测序成功率却是 rbcL 和 matK 最高, 分
别为 90. 7%和 90. 5% , trnH鄄psbA (83. 6% ) 次
之, 最低的是核基因 ITS, 仅有 73. 5% (表 3)。
317 个个体 (60. 4% ) 得到了 4 个基因片段的序
列, 代表了在哀牢山自然保护区亚热带森林中收
集到的 76. 5%的物种和 84. 7%的属。
2. 2摇 物种鉴定成功率
本研究应用 BLAST 和邻接树 (NJ Tree) 两
种分析方法, 比较了每个片段及其相互组合对哀
牢山自然保护区亚热带森林树种的物种和属的鉴
定成功率。 BLAST 分析结果显示, 在至少得到
一条序列的 517 个个体中, 单个 DNA片段中 ITS
对物种和属水平的鉴别成功率最高为 81. 3%和
99. 0%, 其次依次为 trnH鄄psbA (64. 6%, 93. 3%)
和 matK (51. 5% , 91. 7% ), rbcL 最低, 只有
49. 5%和 82. 6% 。 NJ 树的统计结果是 ITS 的物
种鉴别率最高 (69. 1%), 其次是 rbcL (47. 7%)
和 trnH鄄psbA (43. 6% ), 而 matK (42. 3% ) 最
低 (图 1); 对属的鉴别率依然是 ITS (100% )
最高, matK (81. 1% ) 次之, 而 rbcL (76. 3% )
和 trnH鄄psbA (75. 0%) 最低 (图 1)。 与此同时,
研究结果显示, 在数据库完全一致的情况下, 单
个片段的物种鉴定成功率, BLAST 的结果普遍
高于 NJ树的结果。
对多片段的不同组合进行统计分析, 发现核
心条码组合, 即 rbcL+matK, 可以成功鉴定 52. 8%
~60. 2%的物种和 86. 7% ~ 90. 5%的属 (图 1);
补充条码 trnH鄄psbA与核心条码的组合, 使物种水
平的鉴别能力上升到了 60. 0% ~ 63. 0%, 提高了
2. 8% ~7. 2%; ITS与核心条码的组合, 物种的鉴
别能力为 72. 7% ~78. 0%。 四个片段的联合使用,
可以对 95%以上的属完成准确鉴定, 物种水平的
鉴别能力也提升到了 74. 7% ~79. 6% (图 1)。 这
些数据表明 DNA条形码对哀牢山自然保护区亚热
带森林乔木树种的鉴定具有很好的实用性。
在研究中注意到并不是所有的物种都可以被
DNA条形码有效地区分, 即使是 4 个 DNA 片段
的组合。 研究发现诸如樟科 (Lauraceae)、 壳斗
科 (Fagaceae)、 冬青科 (Aquifoliaceae)、 山矾
科 (Symplocaceae) 等植物类群在单片段、 多片
段的组合条件下都不能被有效地区分开 (表 4)。
我们尤其注意到, 在樟科和壳斗科等植物类群中
ITS的测序成功率较低。 樟科和壳斗科的样本量
占总样品数的 24. 2% (127 / 525), 但 ITS 测序成
功率却仅有 30. 7% (39 / 127) (表 5)。 在这些无
法获得高质量 ITS序列的特定植物类群中, trnH鄄
psbA片段比核心条码表现出了较高的种间分辨
率, 在一定程度上可以提高对这些类群的物种识
别能力 (表 4)。
637摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
表 3摇 哀牢山自然保护区亚热带森林树种的扩增和测序成功率
Table 3摇 PCR and sequencing results for subtropical forest trees in Ailao Mountains Nature Reserve
rbcL
PCR SEQ
matK
PCR SEQ
trnH-psbA
PCR SEQ
ITS
PCR SEQ
rbcL+matK
Either
SEQ
Both
SEQ
rbcL+matK
+trnH鄄psbA
Either
SEQ
Three
SEQ
rbcL+matK
+ITS
Either
SEQ
Three
SEQ
All four
All SEQ
No. of samples 488 476 489 475 475 439 504 386 498 449 501 417 516 335 317
(525) / % 0. 93 0. 907 0. 931 0. 905 0. 905 0. 836 0. 97 0. 735 0. 949 0. 855 0. 954 0. 794 0. 983 63. 8 0. 604
No. of species 201 199 201 197 196 189 201 172 203 191 203 184 204 162 153
(204) / % 0. 986 0. 975 0. 986 0. 966 0. 961 0. 926 0. 986 0. 843 0. 995 0. 937 0. 995 0. 902 1. 0 0. 794 0. 75
genus(111) — 109 — 109 — 104 — 102 111 105 111 102 111 99 95
表 4摇 DNA条形码在樟科、 壳斗科、 山矾科和冬青科的物种鉴别能力
Table 4摇 The ablility of species identification for DNA barcodes in Lauraceae, Fagaceae, Symplocaceae and Aquifoliaceae
樟科 Lauraceae 壳斗科 Fagaceae 山矾科 Symplocaceae 冬青科 Aquifoliaceae
哀牢山地区物种数
No. of species in Ailao Mountains 51 43 14 17
采集到的物种数
No. of species collected 25 21 8 6
rbcL 6 2 0 1
BLAST成功 matK 8 2 0 0
鉴定物种数 trnH鄄psbA 14 6 2 2
No. of species ITS 12 14 2 2
identified success rbcL+matK 10 4 0 1
rbcL+matK+trnH鄄psbA 13 5 2 2
All 10 12 3 4
图 1摇 单片段和多片段组合在哀牢山自然保护区物种和属水平的鉴别成功率
R、 K、 T、 S分别代表 rbcL、 matK、 trnH鄄psbA、 ITS; all代表由所有物种组成的数据库;
n逸2 代表由含有 2 个或 2 个以上个体的所有物种组成的数据库
Fig. 1摇 Species and Genus discrimination rate of all single鄄 and multi鄄DNA regions in Ailao Mountains Nature Reserve
R, rbcL; K, matK; T, trnH鄄psbA; S, ITS; NJ tree, neighbor鄄joining tree; all, the database consisted
of all species; n逸2, the database consisted of species including two or more samples
7376 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 卢孟孟等: 亚热带森林乔木树种 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 5摇 研究中涉及到的物种数超过 5 的科的 ITS通用性分析
Table 5摇 The universality analysis of ITS for families including five or more species in this study
樟科
Lauraceae
壳斗科
Fagaceae
杜鹃花科
Ericaceae
蔷薇科
Rosaceae
山茶科
Theaceae
唇形科
Lamiaceae
五列木科
Pentaphylacaceae
山矾科
Symplocaceae
冬青科
Aquifoliaceae
哀牢山地区物种数
No. of species in Ailao
Mountains
51 43 56 50 19 34 11 14 17
采集物种数
No. of species collection 25 21 15 14 9 8 8 8 6
采集个体数
No. of samples collection 64 63 46 34 28 15 26 32 19
ITS测序成功物种数
No. of species of ITS
sequencing success
11 13 15 9 7 8 8 8 6
ITS测序成功个体数
No. of samples of ITS
sequencing success
19 20 43 25 17 14 26 29 19
3摇 讨论
本研究是针对哀牢山自然保护区亚热带森林
乔木物种开展区域植物 DNA 条形码研究的一次
尝试, 其目的在于评估 DNA 条形码对一个地区
植物类群在引物通用性、 序列质量和物种鉴定能
力等方面的总体表现。
3. 1摇 DNA条形码通用性
引物的通用性是评价一个 DNA 条形码理想
与否的重要指标 (Cowan 等, 2006; CBOL Plant
Wording Group, 2009)。 在我们的研究中发现
matK片段的扩增和测序成功率高达 93. 1% 和
90. 5%, 与 Hollingsworth (2008)、 Chase等 (2007)
以及 Kress等 (2009) 的研究相比, 表现出更高
的通用性和成功率, 即使与 Fazekas 等 (2008)
用 10 对引物扩增得到的序列结果 (88% ) 相
比, 也要高出不少; 该结果接近 Li 等 (2011)
对分布于中国的 1 757 种种子植物 DNA条形码研
究所报道的 matK 的扩增和测序成功率 (91%,
95. 3% )。 这在一定程度上应该归功于具有较高
通用性的不同引物的使用。 我们所使用的两对引
物是近年来在 DNA 条形码研究中筛选和设计出
来的, 具有更短的序列长度, 避免了扩增片段中
单核苷酸重复序列的出现, 从而提高了成功率。
在这两对引物中, 我们优先使用 matK3F 和
matK1R, 可以对哀牢山自然保护区亚热带森林
中 60%左右的乔木物种进行成功扩增与测序,
具有普遍的适用性, 应作为 matK 片段扩增的
首选引物; 而增加另一对引物—matK472F 和
matK1248R (Yu 等, 2011), 可以把该片段对哀
牢山亚热带森林乔木物种的引物通用性提升到
90%左右, 因此 matK所存在的通用性不好这一
缺点可以通过采用尝试不同引物的方法来解决。
在本研究中, 核心条码 ( rbcL 和 matK) 在
亚热带森林乔木树种中表现出了最好的通用性,
与之相比, 补充条码的测序成功率不太理想。 补
充条码 trnH鄄psbA测序不成功的主要原因是在部
分物种中存在单核苷酸重复序列, 通常表现为几
个甚至是十几个碱基 A 或 T 的连续重复。 目前
所使用的 Sanger 测序方法, 容易造成重复序列
后的峰图混乱, 导致多核苷重复序列数目的不确
定及该结构之后的序列不可用 (Devey等, 2009)。
ITS测序成功率在所有 DNA片段中最低 (73. 5%),
但从已发表的数据来看, Gonzalez 等 (2009) 对
亚马逊热带森林 285 个树种的研究结果显示,
ITS扩增和测序成功率为 41%; Tripathi 等 (2013)
的研究表明, ITS序列在印度热带森林树种的扩
增与测序成功率是 74. 0%和 62. 0% , 与之相比,
我们的结果要理想很多。 哀牢山自然保护区内的
亚热带常绿阔叶林主要是由壳斗科、 樟科、 山茶
科和木兰科等组成, 在我们的研究中 ITS 片段测
序成功率低, 主要是受到壳斗科和樟科的影响。
这两个科的个体数约占总样本的 1 / 4, 却仅有
30. 7%的测序成功率。 如果去除樟科和壳斗科的
物种, ITS的测序成功率会出现显著升高, 从现
在的 73. 5% (386 / 525) 上升到 91. 0% ( 362 /
398)。 其他学者 Simeone 等 (2013) 和 Denk 和
837摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
Grimm (2010) 对壳斗科栎属 (Quercus) 的研
究以及 Abeysinghe等 (2009) 对樟科樟属 (Cin鄄
namomum) 的研究, 都表明 ITS是一个多拷贝片
段, 存在不完全的一致性进化现象 ( incomplete
concerted evolution)。 因此, 在这些特定类群中,
对 ITS扩增产物直接测序往往得不到好的结果,
可能需要克隆才能得到高质量序列。
3. 2摇 物种鉴定能力
研究发现, 不同的分析方法对评估 DNA 条
形码鉴别物种的能力上是存在差异的。 BLAST
方法主要是通过比较两两序列间的位点变化来区
分物种, 对只有一个个体的物种也具有适用性,
而邻接树方法适用于含有多个个体的物种。 在数
据库一致的情况下, 对单个 DNA 片段物种的鉴
定成功率比较发现, BLAST 得到的物种鉴定率
均高于 NJ 树的结果, 这与两种方法本身的工作
原理有关。 前者仅考虑位点之间的差异, 后者还
要考虑到遗传距离模型以及是否构成单系类群。
事实上, 目前很多类群的分类系统无法保证形态
学上的种都是单系发生的类群, 此外还存在隐存
种 (cryptic species) 现象 (Liu等, 2011), 这无
疑也会使得利用 NJ 树的方法容易获得较低的物
种鉴定成功率。 多片段的组合分析在运用 BLAST
方法时, 有时反而会降低物种的鉴定成功率, 如
rbcL+matK在属水平的鉴定成功率 (90. 5% ) 比
rbcL+matK + trnH鄄psbA (89. 2% ) 的组合要高,
主要原因是 trnH鄄psbA 存在较多的插入和缺失位
点, 降低了同种个体间 Identical Sites 值, 从而
影响了物种鉴定成功率。
3. 2. 1摇 核心条码具有较低的物种鉴定成功率
虽然有学者曾报道核心条码具有较高的物种
鉴定能力, 如 Burgess 等 (2011) 在加拿大温带
植物群的研究中, 发现核心条码可以成功鉴定
93%的物种, 以及 De Vere等 (2012) 发现 rbcL+
matK可以鉴别威尔士境内 69. 4% ~74. 1%的有花
植物, 但是我们的研究结果没能达到那么高的物
种鉴别水平。 在属水平上, 核心条码的组合对哀
牢山自然保护区的亚热带森林乔木具有较好的识
别作用 (86. 7% ~90. 5%), 但在物种水平的鉴别
能力偏低, 仅有 52. 8% ~ 60. 2%, 接近 Li 等
(2011) 对分布于中国的 1 757 种种子植物的研究
结果 (BLAST: 60. 8%)。 对此存在以下几种可能
的解释, 一是该地区核心条码分子序列的遗传分
化率低, 缺乏足够的信息位点, 因而不能将物种
有效地区分开 (裴男才等, 2011), 这与哀牢山地
区的一些类群近缘种较多, 种间分化时间较短有
关, 核心条码较好的通用性也从侧面支持这种解
释, 上述可能是造成核心条码对哀牢山地区乔木
物种鉴定成功率低的主要原因; 二是对有些样品
的形态学鉴定可能不太准确, 主要是采集的部分
标本只采到了营养枝条, 缺乏花和果等重要的形
态分类特征, 使得对其鉴定到物种存在很大的难
度; 三是形态学上物种的界定和认识与 DNA序列
本身存在差异, 而在哀牢山地区对相关类群的分
类与系统学研究工作开展的相对较少, 形态学种
与系统发育物种之间的关系没有得到有效的纠正。
3. 2. 2摇 补充条码具有较高的物种鉴定成功率
补充条码基因间隔区 trnH鄄psbA 片段是备受
学者争议的片段 (Hollingsworth 等, 2011)。 尽
管 trnH鄄psbA在不同植物类群间碱基数目差异很
大, 存在大量的插入和缺失造成排序困难以及在
某些类群中存在单核苷酸重复序列等特殊结构造
成测序困难, 但我们的研究发现该片段在哀牢山
自然保护区亚热带森林乔木树种中具有较核心条
码 rbcL和 matK更高的种间分辨率。 前人已开展
的植物 DNA 条形码研究, 也发现 trnH鄄psbA对乔
木类群的鉴别是最具有希望与潜力的条形码之一
(Gonzalez 等, 2009; Tripathi 等, 2013)。 trnH鄄psbA
片段与核心条码的组合, 可以实现优势互补, 相比
于核心条码 rbcL+matK 的联合, trnH鄄psbA 的加入
对哀牢山自然保护区亚热带乔木物种水平的解决能
力提高到了 60. 0% ~63. 0%,应用 BLAST方法对物
种鉴定成功率提高了 7. 2% (图 1), 与 Kress 等
(2009) 在巴拿马样地的研究 (提高 6%) 相近,
高于 Burgess等 (2011) 的研究 (提高 2. 2%)。 此
外, 在一些的特殊的植物类群中, 如樟科、 壳斗科
等, 很难获得高质量的 ITS 序列, trnH鄄psbA 要
比核心条码 rbcL或 matK更能发挥积极作用 (表
4), 因此, trnH鄄psbA 应该被选为哀牢山亚热带
森林的乔木 DNA条形码之一。
补充条码核基因 ITS尽管在本研究中有着较
低的通用性, 但我们的研究显示其在物种水平
的鉴别上有着最好的可用性 (图 1)。 ITS在所有
单片段中具有最高的物种识别能力 (68. 4% ~
9376 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 卢孟孟等: 亚热带森林乔木树种 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
81. 3% ), 与核心条码联合可以提高约 17. 8% ~
19. 3%的物种鉴定成功率。 ITS 高鉴定能力主要
是因为其进化速率快可以鉴别和区分近缘种, 与
Kress等 (2005)、 Sass 等 (2007) 的研究认为
ITS是最可能被定为植物 DNA 条形码的结论是
一致的。 现在 ITS被否决作为一个植物条形码的
主要因素有以下几点: 不完全的协同进化、 真菌
污染以及低扩增与测序成功率等。 但我们的研究
发现, 上述问题主要是集中在樟科、 壳斗科等特
定类群, 在绝大多数其他类群中并没有出现, 所
以, 本研究支持 Li 等 (2011) 将补充条码 ITS
并入到核心条码的结论。 此外, ITS 作为植物
DNA条形码唯一的一个核基因片段, 遗传信息
来自于双亲, 较之叶绿体基因可以提供更多的信
息。 因此, 应该把 ITS片段列为亚热带森林乔木
树种的 DNA 条形码之一, 但在特定植物类群
(如壳斗科、 樟科等) 中应谨慎使用。
4摇 小结
通过对哀牢山自然保护区乔木树种的 DNA
条形码研究发现, 核心条码 rbcL+matK物种鉴定
成功率较低, 辅以补充条形码, rbcL +matK +
trnH鄄psbA+ITS的组合可以鉴别哀牢山自然保护
区亚热带森林中 74. 7% ~ 79. 6%的乔木物种和
95%以上的属, 具有很好的实用价值。 在哀牢山
自然保护区开展区域 DNA 条形码研究, 是该地
区 iFlora工作的重要组成部分, 不仅为国家级哀
牢山自然保护区的资源普查提供本底分子数据资
料, 同时也促进对亚热带森林的生物多样性、 群
落生态学和保护生物学等领域的研究。 该项研究
再一次验证了 DNA 条形码作为一种标准、 快速
识别物种的方法是可行的。 区域性 DNA 条形码
的研究工作能够促进 iFlora 的快速完成, 在地区
生物多样性的保护及生态学研究中发挥极大的作
用。 在实际应用中, DNA 条形码通过结合地理
学或者形态学数据, 即使是在研究背景相对不充
分的森林群落中, 也能帮助我们提高物种识别率
(Gonzalez等, 2009), 对目前分类学人才匮乏的
现状来说是一种经济且有效的手段, 而 DNA 条
形码遇到的各种难题, 随着生物信息学和新一
代测序技术的不断发展, 也会得到逐步地解决和
完善。
致谢摇 野外考察得到了云南省林业厅、 哀牢山国家级自
然保护区景东管理局和镇沅管理局、 中国科学院西双版
纳热带植物园哀牢山生态站的大力支持; 物种鉴定工作
由中国科学院昆明植物研究所李锡文研究员完成; 采样
工作得到了植物系统发育与保护生物学实验室李朗博士、
李恒、 黄小翠、 刘志芳等人的协助, 在此一并表示感谢。
也参摇 考摇 文摇 献页
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简讯
Flora of China (《中国植物志》 英文和修订版) 全面完成
由中国科学院与美国等国合作开展的重大国际合作项目-Flora of China ( 《中国植物志》 英文和
修订版), 已于近日全面完成。 2013 年 9 月 23 日下午 5 时, 中外联合编委会在北京举行了简朴而备
受瞩目的仪式, 由联合主编、 美国密苏里植物园 Peter Raven 院士和副主编、 中国科学院植物所洪德
元院士共同宣布这一消息。 该书由中国科学出版社和美国密苏里植物园出版社联合出版发行。
Flora of China的编撰工作正式启动于 1988 年 10 月, 在第一次有 6 位中方编委和 4 位美方编委组
成的联合编委会会议上, 由中国科学院昆明植物所吴征镒院士和美国密苏里植物园 Peter Raven 院士
分布代表中美双方签订了合作协议。 此合作项目为中国植物分类学家走向世界提供了良好的机会, 特
别是得以查阅到大量国外保存的中国标本, 结合到中外学者不同的学术观点和思路, 进一步地通过野
外考察、 文献考证和对疑难类群的深入研究, 从而解决了大量 《中国植物志》 (中文版) 遗留的名称
和鉴定问题。
Flora of China项目前后历时 25 年, 对 80 卷 125 册的中文版 《中国植物志》 进行了较为全面的
修订, 并用英文成稿。 该书由吴征镒院士和 Raven 院士主编, 2003 年编委会调整, 增补中国科学院
植物研究所洪德元院士为副主编。 项目采用中外作者合作的形式, 由中方作者完成初稿, 并赴美国和
欧洲一些大标本馆查阅模式标本, 鉴定存于国外的大量中国标本, 并查阅植物分类学经典文献, 结合
近年采集的国内标本, 对物种名称和分布区状况进行修订, 并邀请美、 英、 法、 日、 俄等相关类群的
权威学者作为合作者, 通过广泛的交流、 讨论, 共同修改文稿, 最终由双方作者协商定稿。 该书包括
文字 25 卷 (其中第一卷为索引、 统计和相关卷册出版后发表的新分类群总汇)、 图版 24 卷, 加上由
联合编委会组织, 中外科学家合作完成、 全面总结和介绍中国植物多样性的总论卷 《Plants of Chi鄄
na—A Companion to the Flora of China》, 共 48 本 50 卷 (其中第 2 ~ 3 卷为石松类和蕨类植物合订本,
第 20 ~ 21 卷为菊科植物合订本), 记录了我国维管植物 312 科 3 328 属 31 362 种, 是目前世界上最大
和高水平的英文版植物志。 这也是自 2004 年 《中国植物志》 出版完成并于 2009 年获国家自然科学一
等奖之后, 中国植物学界的又一里程碑式的成果。
在 Flora of China主页上 (http: / / flora. huh. harvard. edu / China / ) 同步提供了在线的分类处理和植
物信息数据。 由于有一些新属和新的属的中国分布记录在所属科出版后才被发现, 故在线版本所记录
的属的数目要比纸质书多。 Flora of China的在线版本共记录维管植物 312 科 3 357 属, 其中石松类和
蕨类植物 38 科 177 属, 裸子植物 12科 42属和被子植物 262科 3 138属 (截止于 2013年 10月 7日)。
Flora of China的全面完成也为我们进一步精准而细致的研究中国维管植物提供了极为重要的基
础信息和科学依据。 作者曾在 Flora of China主页提供的数据的基础上 (截止于 2011 年 12 月 30 日),
将 Flora of China与以 APG系统为代表的维管植物新系统在科的水平上进行了对比 (骆洋等, 2012)。
随着 Flora of China的全面完成, 作者对在线版本记录的维管植物 312 科 3 357 属以同样的方法修订了
结果。 石松类和蕨类植物由于期间的 Flora of China 2 ~ 3 卷的正式出版而产生了一些变动, 具体变动
和最终数目参照王凡红等 (2013); 裸子植物未发生变化; 被子植物的属的数目有所增加, 但在科级
水平上仅新增一处变动: 节蒴木属 (Borthwickia) 从山柑科 (Capparaceae) 中移出并建立了一个新科
--节蒴木科 (Borthwickiaceae) (Su等, 2012)。 基于最新数据, 确定了在以 APG 系统为代表的分子
系统框架下中国维管植物为 310 科 3 270 属, 其中石松类和蕨类植物 38 科 160 属, 裸子植物 10 科 42
属和被子植物 262 科 3 068 属。
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247摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷