全 文 ：姜科砂仁属植物DNA条形码序列的筛选*
杨振艳1,2,张暋玲1
**
(1中国科学院西双版纳热带植物园,云南 勐腊暋666303;2中国科学院研究生院,北京暋100049)
摘要:砂仁属 (Amomum )隶属于姜科,全属约150种,我国有39种。该属多种植物可作药物或香料,
但目前砂仁属的分类还不清楚,准确鉴定物种有很大难度。本研究利用DNAbarcoding技术,对砂仁属
50种121个个体的matK、rbcL灢a、trnH灢psbA 序列及其不同组合进行比较,用TaxonDNA计算种间、
种内barcodinggap,运用相似法的BLASTn计算条码的正确鉴定率,筛选适合砂仁属的条码片段。结果
显示:所有条码的barcodinggap均不存在;matK 的正确鉴定率高于trnH灢psbA 和rbcL灢a,联合片段的
条码正确鉴定率高于单片段条码,三个片段联合条码的正确鉴定率最高。因此,推荐matK +rbcL灢a+
trnH灢psbA作为砂仁属物种鉴定的候选条码。
关键词:砂仁属;DNA条形码;matK;rbcL灢a;trnH灢psbA;matK+trnH灢psbA+rbcL灢a
中图分类号:Q78,Q949暋暋暋暋暋文献标识码:A暋暋暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)05灢393灢08
ScreeningPotentialDNABarcodeRegions
inAmomum (Zingiberaceae)
YANGZhen灢Yan1,2,ZHANGLing1**
(1XishuangbannaTropicalBotanicalGarden,ChineseAcademyofScience,Mengla666303,China;
2GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)
Abstract:Amomumcontains150species,and39ofthemarefoundinChina.ManyAmomumspeciesare
usedintraditionalChinesemedicinesandfavoritefoodcondiment.Theintragenericclassificationofthisgenus
islargelyunclear,andtheaccurateidentificationofspeciesisdifficult.DNAbarcodingisatechniquetoiden灢
tifyspeciesusingstandardizedDNAregion.TheCOIsequencehasbeensuccessfulyusedtoidentifyanimal
species.Unfortunately,therearenouniversalyacceptedbarcodesystemsforplants.Thisstudycompared
theeachthreecandidateplastidregions(matK,rbcL灢a,trnH灢psbA)andthecombineddata(matK +
rbcL灢a,matK+trnH灢psbA,rbcL灢a+trnH灢psbA,matK +rbcL灢a+trnH灢psbA)among121accessions
representing50speciesofthegenus.Inordertoscreenoutthesuitablebarcodeforidentifyingthespeciesof
Amomum,TaxonDNAwasusedtoestimatethebarcodinggapbetweeninterspecificandintraspecificdis灢
tances,andBLASTnwasusedtocalculatetherateofcorrectidentification.Theresultsindicatedthatthere
wasnoDNAbarcodegapinthreeloci.ThecorrectidentificationofmatKwashigherthanthatoftrnH灢psbA
orrbcL灢a,thecombineddatahashighercorrectidentificationthanthatofsingleone,andthethree灢locus
combineddatashowedthegreatestlevelofspeciesdiscrimination.Tosumup,matK+rbcL灢a+trnH灢psbA
canbeconsideredasapotentialbarcodeforidentifyingthespeciesofAmomum.
Keywords:Amomum;DNAbarcoding;matK;rbcL灢a;trnH灢psbA;matK+trnH灢psbA+rbcL灢a
云 南 植 物 研 究暋2010,32(5):393~400
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡10070
*
**
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目 (KSCX2灢YW灢N灢0807)
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:zhangl@xtbg灡org灡cn
收稿日期:2010灢04灢01,2010灢07灢20接受发表
作者简介:杨振艳,女,中国科学院西双版纳热带植物园在读研究生。E灢mail:yzy832yzy@126灡com
暋 砂仁属 (AmomumL.)是姜科 (Zingiber灢
aceae)的第二大属,约150余种,主要分布于
亚洲、大洋洲的热带地区,我国有39种 (Wu
andLarsen,2000)。本属植物多为常绿草本,多
生长在潮湿森林的林窗和林际处,也有少数较小
的附生种 (SakaiandNagamasu,1998)。本属
中很多种可供药用或作香料,能祛风止痛,健胃
消食 (Tsai等,1981)。
砂仁属植物的分类比较混乱,直到20世纪
初,Kress等 (2002)综合运用形态学和分子学
的手段建立了姜科新的分类系统,把砂仁属归在
山姜亚科的山姜族中,才确立了砂仁属的分类位
置;Xia等 (2004)选用ITS和matK 两个片段
阐述了砂仁属的系统发育关系,并提出了新的可
用于砂仁属分类的形态特征 (如果实类型)。由
于砂仁属种类繁多,形态结构的差异复杂,花部
变异尤为多样,物种鉴定困难,所以迫切需要一
种快速准确的鉴定砂仁属物种的方法。
DNA条形码 (DNAbarcoding)是利用一
个或少数几个短的 DNA 片段 (400~800bp)
对地球上现有的物种进行快速、准确的识别和鉴
定的一项新技术 (Tautz等,2002,2003;He灢
bert等,2003a,b)。大量研究结果证明了线粒
体基因COI片段对动物物种的识别和鉴定切实
可行 (Hebert等,2004;Hajibabaei等,2006;
Yoo等,2006;Yancy等,2008),但由于线粒体
基因在植物中进化要比动物慢的多,不适合做植
物的条形码 (Kress等,2005),所以大家把目光
转向叶绿体和核基因。由于核基因组通常具有多
拷贝的特性,且物种内变异较大,引物通用性
差,并且扩增时对模板DNA的质量要求高,不
适用 于 存 在 DNA 降 解 的 材 料 (Kress 等,
2005),因此,植物中最可能的条形码还是从叶
绿体基因组中选择 (Chase等,2005;Cowan等,
2006)。
植物条形码片段的筛选已经做了大量的工作
(Chase等,2007;KressandErickson,2007;
Pennisi,2007;Erickson等,2008;Lahaye等,
2008;Liu等,2010),但通用于植物的条形码片
段仍存在很多争论,目前比较一致的观点是,适
用于植物界的条形码将会是两个或多个片段的组
合 (Kressand Erickson,2007;Fazekas 等,
2008;Holingsworth等,2009),如较保守的编
码基因rbcL灢a、进化较快的matK的部分片段和
非编码基因trnH灢psbA(Kress等,2009)。
本研究通过对砂仁属50个种121个个体的
matK、rbcL灢a和trnH灢psbA 及不同片段组合的
比较,尝试筛选一条适用于该属植物的DNABar灢
coding鉴定片段或片段组合。另外,本研究选用
短期分化物种较多的姜科材料,并在种的水平上
检验 “生命条码联盟暠(CBOL)提出的核心片段,
这对植物条码片段的筛选有一定的推进作用。
1暋材料与方法
1灡1暋材料
本实验以Kress等 (2002)的新的姜科分类系统和
Xia等 (2004)砂仁属系统研究为基础,共采集123个实
验材料,其中红豆蔻 (Alpiniagalanga(L.)Wild)2个
个体为外类群,砂仁属材料50个种121个个体为内类
群。另从GeneBank上获得13条序列 (11条matK 序
列,2条rbcL灢a序列)。
实验材料大部分是经硅胶快速干燥的叶片,少部分
是DNA原液,主要有三个来源,多数来自夏永梅女士
野外采集的材料,一部分采自中国科学院西双版纳热带
植物园姜园的栽培植株,还有小部分为美国Smithsonian
Institution的 W.JohnKress博士提供,凭证标本分别存
放于中国科学院西双版纳热带植物园标本馆 (HITBC)
和美国国家标本馆 (NMNH)。
1灡2暋实验方法
总 DNA 提取采用改良的 CTAB 法 (Doyleand
Doyle,1987)。PCR扩增反应在PERKINELMER (PE)
9600或9700型PCR仪上进行。matK、trnH灢psbA 和
rbcL灢a三个DNA片段扩增反应程序均采用:97曟预变
性4min,94曟变性1min,52曟退火1min,72曟延伸1
min。32个循环后,72曟延伸10min,根据具体情况而
略有变动。扩增反应采用25毺l的反应体系,包括2灡5
mmol·L灢1的10暳buffer已加入镁离子,0灡2U 的 Taq
聚合酶,250毺M 的dNTPs,正反向引物浓度各为0灡2
毺mol·L灢1,以及约80ng的模板DNA。PCR产物经琼
脂糖凝胶电泳检测合格后,用上海生工生物工程技术服
务有限公司的纯化试剂盒纯化以备测序反应之用。
扩增引物同时作为测序引物,利用正反向引物分别
对两条链测序 (trnH灢psbA 采用双向测序,matK 和
rbcL灢a采用单向测序),反应依据双脱氧链终止法
(Sang等,1997)。测序反应在PE9600或9700型PCR
仪上进行,采用5毺l的反应体系,包括:1毺l的测序mix
(PE公司的Bigdyev3灡1测序试剂盒),0灡5毺l的测序引物,
493暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
1毺l的PCR纯化产物和2灡5毺l的重蒸水。反应程序为:
95曟预变性4min;96曟变性10s、50曟退火5s、60曟延
伸4min,共33个循环。反应产物经95%乙醇+乙酸钠
沉淀30min,之后用70%乙醇150ml洗涤,干燥后加入
15毺l的变性剂充分溶解,经95曟变性4min后上样,在
ABI3700型自动测序仪上进行检测。
序列编辑和拼接应用Lasergenev7灡1软件中的Seq灢
Man (DNASTAR Inc.,Madison, Wisconsin,USA;
Burland,2000)完成。3个叶绿体DNA序列数据进行单
独及联合序列矩阵构建,在EditPlus中将不同DNA序
列矩阵结合形成联合矩阵,矩阵中去除只有一个样本的
种,且在构建联合矩阵时,如果某个体只有一条 (当两
个DNA序列矩阵结合时)序列或两个 (当三个DNA序
列矩阵结合时)序列,此个体也被去除,因为序列矩阵
的大小对正确鉴定率的影响是次要的 (Holingsworth
等,2009)。利用ClustalX2 (Larkin等,2007)对矩阵
进行自动排序,并利用Bioedit(Hal,1999)与测序峰
图进行人工校对。对单片段及片段组合进行分析,采用
邻接法 (neighbor灢joining,NJ)构建基因树。邻接法分析
在PAUP*4灡0b10 (Swofford,2002)中运行;邻接法采用
自展分析 (Bootstrapanalysis),1000次抽样,根据抽样
自展值 (Bootstrapvalue,BS)评估分支的可靠性。
Barcodinggap是检验DNA条形码的一个指标,即
理想的条形码检测到的同属内种间遗传变异应显著大于
种内遗传变异,并形成一个明显间隔区 (Meyerand
Paulay,2005;Lahaye等,2008)。该检验采用 Meier等
(2006)开发的TaxonDNA软件结合一般的统计软件完
成,用柱形图呈现种间、种内的遗传距离的分布频度
(宁淑萍等,2008),然后采用中位数和 Wilcoxon双样本
检验 (http://www灡fon灡hum灡uva灡nl/Service/Statistics灡
html)进行不同条码种间、种内距离的差异显著性检验
(Liu等,2010)。
采用BLASTn(Altschul等,1997)计算种水平上的
正确鉴定率 (CorrectIdentification,CI),将每个片段及
片段组合的序列矩阵,经BLASTn格式化成为一个数据
库,这样每个序列矩阵就成为了一个Query和一个Data灢
base,每个Query分别在对应的Database进行搜索比对。
在某条序列的比对结果中,如果除了这条序列,这个种
的其它个体得到了最高分就认为这个种在种水平上鉴定
正确 (Kress等,2009);如果没有得到最高分数或是与其
它的种混在一起,就认为这条序列在种水平上鉴定错误。
同时,正确鉴定率的计算还参考了 Holingsworth
等 (2009)的 “同种个体分组聚类暠标准,即是将 NJ
树上同种的个体聚成一枝认为就是正确鉴定到种,相
反,如果种间个体的序列没有差异,或是 NJ树上某种
的一个个体没有和这个种的其他个体聚成一枝,就认为
是鉴定错误。
2暋结果
本研究获得砂仁属及其外类群的三个叶绿体
片段 (matK、rbcL灢a和trnH灢psbA)的序列,
对这些序列的单独矩阵和不同联合矩阵的相关数
据进行分析,结果如下:
2灡1暋不同片段的PCR和SEQ (sequencing)的成功率
三个片段在种水平 (50个)和个体水平 (121
个)上的PCR及SEQ的成功率都偏低,且均为
rbcL灢a的最高,trnH灢psbA 的次之,matK 的最
低 (表1)。rbcL灢a和matK 两片段采用单向引
物测序,有 >90% 的序列一次性测序成功,
trnH灢psbA 因为需要正反向引物两端测序,约
80%序列一次性测序成功。不同片段的PCR和
SEQ的成功率主要受到所选片段引物通用性影响,
表1暋不同片段及其不同组合的PCR和SEQ (sequencing)结果比较
Table1暋ComparisonofPCRandsequencing(SEQ)resultsfromdifferentlociandcombineddatasets
trnH灢psbA
PCR SEQ
rbcL灢a
PCR SEQ
MatK
PCR SEQ
trnH灢psbA+
rbcL灢a
Either
PCR
Both
SEQ
matK+
rbcL灢a
Either
PCR
Both
SEQ
trnH灢psbA
+matK
Either
PCR
Both
SEQ
matK+rbcL灢a
+trnH灢psbA
Either
PCR
Both
SEQ
NO灡of
species(50)*
35 35 38 38 33 33 38 35 38 33 38 33 38 33
Percent(%) 70 70 76 76 66 66 76 70 76 66 76 66 76 66
NO灡of
samples(121)
100 99 102 102 91 91 102 99 102 91 100 91 102 91
Percent(%) 82灡64 81灡82 84灡30 84灡30 75灡21 75灡21 84灡30 81灡82 84灡30 75灡21 82灡64 75灡21 84灡30 75灡21
Meanlength 868# 463 771 ——— ——— ——— ———
*50个种是已经确定的种个体数,材料中还有28个个体只确定到属。#868bp长度包括了gap的长度。
*50certainspecies,28uncertainspecies.#868bpincludegaps
5935期暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋杨振艳和张玲:姜科砂仁属植物DNA条形码序列的筛选暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
同时也受到种内不同居群个体间差异的影响,而
两个或三个片段组合的PCR和SEQ的成功率主
要受低成功率片段的影响。根据目前的研究,植
物条码将很可能是一个多片段的组合,这就对每
个候选片段的引物通用性要求更高,尤其是现在
很看好的matK 片段,迫切需要开发出高通用性
的引物。
2灡2暋种间与种内的Barcodinggap
Barcodinggap通过计算得到种间、种内的
K2P (Kimura2灢parameter)距离,然后用频率
直方图表示 (图1),采用中位数和 Wilcoxon双
样本检验的方法进行差异显著性检验 (表2)。
检验结果显示,种间与种内 K2P距离有显著性
差异,但单片段和片段组合的种间、种内距离都
图1暋不同条形码种间和种内K2P距离的频率直方图
A:matK;B:rbcL灢a;C:trnH灢psbA;D:matK+rbcL灢a;E:matK+trnH灢psbA;
F:matK+rbcL灢a+trnH灢psbA。X轴表示K2P距离,Y轴表示是出现的累计频率
Fig灡1暋Thefrequencydistributionofinter灢andintra灢specificKimura2灢parameter(K2P)distancesforsixcandidateloci
A:matK;B:rbcL灢a;C:trnH灢psbA;D:matK+rbcL灢a;E:matK+trnH灢psbA;F:matK+rbcL灢a+trnH灢psbA.
TheXaxisrelatestotheK2Pdistances,andtheYaxiscorrespondstothenumberofoccurrences
693暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
表2暋不同片段及不同片段组合的种间种内距离的差异显著性检验
Table2暋Significancetestsofdivergenceoninter灢versusintra灢specificdistancesofeachlocusanddifferentlocicombination
Region Mediantest Wilcoxontwo灢sampletest
matK #A=73#B=73,Median=1灡07,p<=1灡13e灢31 #A=73#B=73,W=2772,p<=3灡426e灢24
rbcL灢a #A=67#B=67,Median=0灡354,p<=8灡74e灢26 #A=67#B=67,W=2435,p<=1灡614e灢20
trnH灢psbA #A=63#B=63,Median=0灡858,p<=7灡74e灢25 #A=63#B=63,W=2097,p<=1灡641e灢20
matK+rbcL灢a #A=58#B=58,Median=0灡831,p<=4灡03e灢25 #A=58#B=58,W=1769,p<=3灡165e灢19
matK+trnH灢psbA #A=58#B=58,Median=1灡09,p<=2灡78e灢24 #A=58#B=58,W=1766,p<=2灡723e灢19
matK+rbcL灢a+trnH灢psbA #A=58#B=58,Median=0灡919,p<=1灡79e灢23 #A=58#B=58,W=1769,p<=3灡165e灢19
没有表现出显著的gap (即明显的间隔区),如
图1所示,各个条码的种间、种内距离都有很多
重叠区,且有很多种间距离为0,在单片段条码
中表现更明显尤其是rbcL灢a。虽然没有显著的
barcodinggap,但单片段中matK 以及联合片段
中matK+rbcL灢a+trnH灢psbA 的种间、种内距
离的重叠区仍是最小的,这说明单片段条码中
matK表现最好,联合片段条码中matK+rbcL灢
a+trnH灢psbA表现最好。
2灡3暋不同片段和联合片段的正确鉴定率 (CI)
暋暋单片段的正确鉴定率以matK 为最高,且明
显高于trnH灢psbA 和rbcL灢a。当正确鉴定率乘
上PCR的成功率后,三个片段的正确鉴定率均
降低,但仍是matK表现最好。与单片段的正确
鉴定率相比,联合片段的正确鉴定率较高,尤其
三片段联合时即matK+trnH灢psbA+rbcL灢a的
正确鉴定率最高 (59灡65%)(表3)。
当参考 Holingsworth等 (2009)的 “同种
个体分组聚类暠标准时,分辨力 最 好 的 是
matK、rbcL灢a和trnH灢psbA 联合矩阵的NJ树
(图2)。从图中可以看出,很多种聚在了同一个
分支上,如A灡yunnanense,这种情况下就很清
楚的鉴定到种,但是也有几个种聚在一个枝上,
如A灡microcarpum 和A灡neoaurantiacum ,这种
情况下如果单纯的依据条形码就很难鉴定到种。
这种方法的结果和BLASTn的结果基本相同,
三片段组合条码的正确鉴定率是最高的。
由此我们可以看出,无论采用哪一种计算方
法,本研究中matK、rbcL灢a和trnH灢psbA 三片
段的联合条码的正确鉴定率均为最高,但由于联
合片段条码较单片段条码受PCR扩增成功率和
测序成功率的影响更大,所以高效通用引物的开
发将是下一步工作的重点。
3暋讨论
自DNABarcoding提出以来,无论开始提
出的单片段,还是现在提出的联合片段,都存在
着很多的争论,至今仍然没有找到适合植物的条
形码片段或组合。以往的研究多对所筛选片段的
正确鉴定率和引物通用性进行了检验比较,本研
究也是从这两个方面对所选的实验片段进行评
价,以往研究多基于高阶分类单元 (目、科水
平),而本研究则侧重于同一属不同种的比较。
本研究中三个片段的PCR和SEQ (Sequen灢
cing)的成功率均表现为保守的编码基因rbcL灢a
最高,非编码基因trnH灢psbA 次之 (含有多个
PolyA 结构),而进化较快的matK 最低 (表
1),这与以往的研究结果是一致的 (Kressand
Erickson,2007;Fazekas等,2008;Kress等,
2009)。在我们的实验结果中,三个片段的PCR
的成功率均较低,这可能是因为本研究所用的实
验材料由多方提供,有硅胶材料也有 DNA 原
液,由于保存已久或保存不当等原因,影响了
PCR的成功扩增率。由此可以看到,PCR的成功
表3暋 不同片段及不同片段组合的正确鉴定率
Table3暋Frequencyofcorrectidentification(CI)%ofeachlocusandlocicombination
Measure
Frequencyofcorrectidentification(%)
matK trnH灢psbA rbcL灢a matK+rbcL灢a matK+trnH灢psbA matK+trnH灢psbA+rbcL灢a
CIonly(%) 75灡34 52灡38 27灡54 75灡86 75灡86 79灡31
Recovery*CI(%) 56灡67 42灡86 23灡21 57灡06 57灡06 59灡65
7935期暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋杨振艳和张玲:姜科砂仁属植物DNA条形码序列的筛选暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
图2暋叶绿体matK、rbcL灢a和trnH灢psbA联合矩阵分析得到砂仁属的NJ树 (分支上显示高于50%支持率)
Fig灡2暋Theneighbor灢joiningtreebasedonthecombineddatabaseofcpDNAdata(matK,rbcL灢aandtrnH灢psbA)
forAmomum.Bootstrapvaluesover50% wereshownabovethebranches
893暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
率除了受到通用引物和不同居群个体间差异的影
响外,还受到DNA质量的影响。
在我们所评价的三个单片段中,matK 是表
现最好的单片段条码 (表3),这与 Kress等
(2009)和 Holingsworth等 (2009)的研究结
果相同。CBOLPlantWorkingGroup在2009年
也已经把matK 定为植物条形码的核心片段。虽
然matK片段鉴定率很高,但由于其较低的PCR
扩增率,影响到了最终的正确鉴定率,所以尽快
开发出适合于matK 的高通用性引物,才能将
matK广泛应用于植物条码的各大项目中 (La灢
haye 等,2008;CBOL Plant Working Group,
2009)。而rbcL灢a的正确鉴定率很低,也同样说
明了此片段多可运用在目、科水平的鉴定上
(Holingsworth等,2009;Liu等,2010)。
在联合片段中,matK +rbcL灢a +trnH灢
psbA 三个片段联合的条码的正确鉴定率高于任
何单片段和两片段联合的条码,这也与Kress等
(2009)和 Holingsworth等 (2009)的研究结
果一致。与以往研究相比,此三片段联合作为条
码的正确鉴定率在本研究中略低,可能是由于本
实验是基于属下的不同种的鉴定,而且姜科植物
本身也存在较多近期分化的物种,所以这种结果
是可以理解的,况且DNA条形码能否适用于近
缘和近期分化的种的鉴别也是植物条形码研究中
最大的争议点和难点 (宁淑萍等,2008)。综上
所述,我们推荐matK +rbcL灢a+trnH灢psbA
三个片段联合的条码作为砂仁属潜在的鉴定候选
条码。
致谢暋中国科学院西双版纳热带植物园的夏永梅老师提
供实验材料,美国国家标本馆的 W.JohnKress博士提
供实验材料和数据处理方面给予的宝贵建议,中国西南
野生生物种质资源库分子生物学实验中心的杨俊波、李
洪涛老师给予实验技术指导,其他工作人员在实验过程
中给予的帮助。
暡参暋考暋文暋献暢
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