全 文 ：藓类植物DNA条码的初步研究———以蔓藓科部分属为例*
赵丽嘉1,2,贾暋渝2**,周世良2
**,杜桂森3
(1首都师范大学生命科学学院,北京暋100048;2中国科学院植物研究所植物系统
与进化国家重点实验室,北京暋100093)
摘要:选取7个叶绿体基因片段,其中3个编码区基因片段 (matK,rps4andrbcL灢a)和4个非编码区
基因片段 (atpB灢rbcL,atpF灢H,psbK灢IandtrnH灢psbA ),一个线粒体基因片段 (nad5)和一个核基因
片段 (ITS2),材料包括5个属14个种的74份样品。分析比较了6个基因片段的多样性、种内和种间的
遗传距离、鉴别率等。结果显示,在使用单个片段时ITS2的鉴定效果最好,而atpB灢rbcL则是叶绿体基
因片段中鉴别能力最高的。使用组合片段的结果发现,两个基因片段组合的鉴别效果最好。通过 NJ树的
方法检验,atpB灢rbcL +trnH灢psbA和rbcL灢a++trnH灢psbA 的鉴定成功率是64%,当再增加一个或两
个基因片段时其鉴定效果并没有提高。本研究表明在植物中应用DNA 条码需要用质体基因和核基因联
合。
关键词:DNA条形码;鉴定;蔓藓科;片段;藓类植物
中图分类号:Q78暋暋暋暋 暋暋文献标识码:A暋暋暋暋暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)03灢239灢11
ThePreliminaryStudyonDNABarcodingofMosses———
ACaseofPartofGeneraofMeteoriaceae
ZHAOLi灢Jia1,2,JIAYu2** ,ZHOUShi灢Liang2** ,DUGui灢Sen3
(1SchoolofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100048,China;2StateKeyLaboratoryofSystematic
andEvolutionaryBotany,InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093,China)
Abstract:WecomparedtheperformancesofthecandidatelociformossDNAbarcodingandtheprimersused
inamplifyingtheloci.Primersforthreecodedloci(matK,rps4andrbcL灢a)andfournon灢codedloci(at灢
pB灢rbcL,atpF灢H,psbK灢IandtrnH灢psbA )ofthechloroplastgenome,onefromthemitochondrialge灢
nome(nad5),andonefromthenucleusgenome(ITS2)wereevaluated.Seventy灢foursamplesrepresenting
14speciesbelongingtofivegeneraofTrachypodoaceae(orMeteoriaceae)werescreened.Alprimersfor
matKandapairofprimersfortrnH灢psbAfailed.Lowsuccesseswereencounteredwiththeprimersforat灢
pF灢HandpsbK灢I.TheprimersforpsbK灢IproducedseveralbandsandthePCRproductsofatpF灢H were
difficulttosequence.Thepowersoftheremainingsixlociwerecomparedusingthevariability,identification
successandtheresolutions.ItwasfoundthatITS2isthemostpromisingcandidateforDNAbarcodingfor
mosses.Amongthechloroplastgenes,atpB灢rbcLexhibitedthehighestresolution.AlthoughtrnH灢psbAis
veryvariable,itistooshorttobeanidealbarcodealone.Combinationsofchloroplastgeneswerealsotriedand
PsofbothatpB灢rbcL+trnH灢psbAandrbcL灢a++trnH灢psbAwere64%usingNJmethod.Moreadditionsofloci
didnotincreasetheresolution.Nobarcodinggapexistsforaltheseloci.Phylogeneticanalyseswerecarriedoutpri灢
云 南 植 物 研 究暋2010,32(3):239~249
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡09234
*
**
基金项目:国家自然科技资源平台项目 (2005DKA21401);中科院植物所 (KSCX2灢YW灢Z灢0807)
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:yjia@ibcas灡ac灡cn,responsiblefortaxa;andE灢mail:slzhou@ibcas灡ac灡cnre灢
sponsibleforDNAbarcoding
收稿日期:2009灢11灢23,2010灢04灢01接受发表
作者简介:赵丽嘉 (1981-)女,硕士,主要从事苔藓植物分子系统学研究。
ortotheDNAbarcodingevaluationandsometaxonomicproblemsdoexist.Thisstudyexemplifiesthenecessityof
correctspeciesdelimitationandtheadoptionofbothplastidandnuclearlociinplantDNAbarcoding.
Keywords:DNAbarcode;Resolution;Meteoriaceae;Loci;Mosses
暋 最早开展植物DNA条码研究的是Kress等
(2005)。在使用了11个片段对被子植物进行探
讨后,他们认为psbA灢trnH 是最有潜力成为植
物中DNA条码的候选片段,尽管它比较短 (曋
450bp),但是其变异位点较多而且容易扩增。
然而,越来越多的研究已经表明要使用单个
片段来对所有的植物物种进行准确鉴定是非常困
难的。一系列的片段组合尝试之后,已经提出一
些具体的基因片段组合:rpoC1+rpoB+matK和
rpoC1+matK +psbA灢trnH (Chase,2007),rbcL
+trnH灢psbA (KressandErickson,2007),matK
+atpF灢atpH +psbK灢psbI和matK +atpF灢atpH +
trnH灢psbA (Pennisi,2007),matK +trnH灢psbA
(Lahaye等,2008b)。
到目前为止,有关苔藓植物DNA条码研究
尚未有报道。苔藓植物的DNA条码鉴定片段是否
与维管植物一致或者有其特殊性? 还需要我们通过
大量的工作来回答这些问题。本研究以分布于中
国的蔓藓科中部分属为例来开展工作,其目标是
初步探讨适合藓类植物的基因片段或片段组合。
我们选取如下5个属:异节藓属Diaphan灢
odon、扭 叶 藓 属 Trachypus、拟 木 毛 藓 属
Pseudospiridentopsis、拟扭叶藓属 Trachypo灢
dopsis和绿锯藓属Duthiela。上述5属在全世
界有22种 (Frey等,2009),在中国有14种
(Redfearn等,1996)。这些属曾经属于扭叶藓科
Trachypodaceae,主要分布于旧热带地区,而新
热带地区仅有2属2种 (Gradstein等,2001)。
1994年Buck将扭叶藓科归并到蔓藓科。
1暋材料和方法
1灡1暋取样
取分布在中国的74份材料,包括5个属,分别为异
节藓属、扭叶藓属、拟木毛藓属、拟扭叶藓属和绿锯藓
属。总共14个种,每个种1~13个样品。外类群是塔藓
科的小蔓藓Meteorielasoluta(Mitt).Okam。(表1)
1灡2暋DNA提取、扩增和测序
DNA的材料均取自近15天采集的干标本,提取全
基因组DNA,采用CTAB法,(DoyleandDoyle,1987)。
本研究除了做了atpB灢rbcL,rps4,rbcL灢a,trnH灢psbA,nad5
和ITS2 (共用了14对引物,见表2)外,也做了atpF灢at灢
pH,matK,psbK灢I,rpoB,rpoC15个片段,但后者预扩增
结果不太好。我们设计了matK引物,但是扩增效果很差。
叶绿体基因用PCR产物直接测序法测定序列,核基因的
PCR产物用试剂盒克隆测序,每个样品至少测定8个克隆。
所获得的序列先用SEQUENCHER4灡7校对拼接,用Clust灢
alX2灡0比对后 (LarkinandBlackshields,2007),再用SE灢
ALversion2灡0a11手工调整 (Rambaut,1996)。
1灡3暋数据分析
1灡3灡1暋系统发育分析和物种鉴定 暋为了评估物种鉴定
是否正确,先使用软件PAUP* ver.4灡0b10(Swofford,
2003)使用最大简约法 (MP)构建系统发育树。MP树
以外类群置根,gap当缺失数据处理。
1灡3灡2暋DNA条码分析 暋对于物种的鉴定能力是使用
NJ树的方法,NJ树是基于K2P遗传距离建立的。我们
使用以下两种方法 (F灢检验和BBA灢检验)来比较不同
片段对物种的鉴别能力。
F灢检验:该检验方法是用来测试实验用的标记是否
适合鉴别属和种。分子的多样性使用 ARLEQUINver.
3灡0 (Excoffier等,2005)中的 AMOVA (Excoffier等,
1992)分析了属间、属内、种间和种内的关系。
BBA灢检验 (“Bestmatch暠,“Bestclosematch暠and
“Alspeciesbarcodes暠):使用这种检验方法是为了得到
本次研究中用到的标记的鉴定能力 (Meier等,2006)。
使用软件TaxonDNA来计算BBA灢检验。
2暋结果
2灡1暋PCR扩增和测序
本次研究使用了下列片段,atpB灢rbcL,
rps4,rbcL灢a,trnH灢psbA,nad5 和 ITS2,
其扩增成功率都在90%以上,只有几个片段中
的极小部分没有被扩增出来。ITS2全部扩增成
功,扩增成功率最低的是nad5,有7%没有扩增
成功 (表3)。另外本研究中还增加了atpF灢at灢
pH,psbK灢I和matK,atpF灢atpH 4个片段,
但是仅有一部分扩增成功并测序,而且测序成功
率比较低,所以没有对这些数据进行分析。
2灡2暋不同片段组合鉴定能力的比较
在使用NJ树方法和K2P散点图方法时,核
基因ITS2的分辨能力存在不一致的现象 (图
042暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
1),K2P散点图结果表明ITS2的鉴别能力比这
两个叶绿体基因atpB灢rbcL和rbcL灢a弱,与NJ
树方法的结果恰好相反,其它片段的结果也不一
致,因此,我们没有展示核基因ITS2和其它基
因片段的比较图。图2显示单个基因片段鉴定能
力大小的顺序依次是atpB灢rbcL>trnH灢psbA>
rps4>rbcL灢a>nad5。初步结果显示:在单个
片段中,除了ITS2,atpB灢rbcL鉴定效果最好。
但是单一基因片段在物种鉴定上仍然存在缺陷,
例如,有的片段引物通用性差;有的片段普遍存
在插入/缺失事件,导致在不同类群间的长度变
异很大;有的片段的信息位点少且鉴别能力弱;
表1暋取样表
Table1暋Sampling
种名Taxa 采集地Locality 标记Code 凭证标本Voucher(PE)
异节藓Diaphanodonblandus(Harv.)Ren&Card
暋1 四川省泸定县Luding,Sichuan * 贾渝 (Y.Jia)J01857 (PE)
暋2 四川省泸定县Luding,Sichuan * 贾渝 (Y.Jia)J01986 (PE)
暋3 四川省泸定县Luding,Sichuan SC灢1 贾渝 (Y.Jia)J02161 (PE)
暋4 四川省泸定县Luding,Sichuan SC灢2 贾渝 (Y.Jia)J02129 (PE)
暋5 四川省汶川县 Wenchuan,Sichuan * 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W58561 (PE)
暋6 四川省汶川县 Wenchuan,Sichuan SC灢3 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W58754 (PE)
斜枝绿锯藓Duthieladeclinata(Mitt.)Zant
暋1 贵州省道真县Daozhen,Guizhou GZ 何强 (Q.He)H636 (PE)
暋2 江西省崇文县Chongwen,Jiangxi JX 于宁宁 (N灡N.Yu)Y01151 (PE)
暋3 四川省盐边县Yanbian,Sichuan SC 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W20374 (PE)
软枝绿锯藓Duthielaflaccida(Card.)Broth
暋1 重庆市仙女峰XiannvMountain,Chongqing CQ 李建文 (J灡W.Li)L409 (PE)
暋2 甘肃省文县 Wenxian,Gansu GS 李粉霞 (F灡X.Li)L223 (PE)
暋3 广西省那坡县Napo,Guangxi GX 裴林英 (L灡Y.Pei)P2322 (PE)
暋4 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou * 何强 (Q.He)H451 (PE)
暋5 四川省峨眉山EmeiMountain,Sichuan SC灢1 何强 (Q.He)H1162 (PE)
暋6 四川省峨眉山EmeiMountain,Sichuan SC灢2 何强 (Q.He)H1315 (PE)
暋7 四川省都江堰市DujiangyanCity,Sichuan SC灢3 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W58360 (PE)
暋8 四川省都江堰市 DujiangyanCity,Sichuan * 贾渝 (Y.Jia)J06569 (PE)
美绿锯藓DuthielaspeciosissimaBroth.ex.Card
暋1 重庆市南川市 Nanchuan,Chongqing CQ灢1 刘阳 (Y.Liu)L2520 (PE)
暋2 重庆市巫溪县 Wuxi,Chongqing CQ灢2 李粉霞 (F灡X.Li)L1364 (PE)
暋3 重庆市巫溪县 Wuxi,Chongqing CQ灢3 王庆华 (Q灡H.Wang)W20 (PE)
暋4 甘肃省文县 Wenxian,Gansu GS 贾渝 (Y.Jia)J09157 (PE)
暋5 甘肃省文县 Wenxian,Gansu * 贾渝 (Y.Jia)J09127 (PE)
暋6 湖北省宜昌市 YichangCity,Hubei HB 王庆华 (Q灡H.Wang)W585 (PE)
暋7 四川省都江堰市DujiangyanCity,Sichuan SC灢1 刘阳 (Y.Liu)L417 (PE)
暋8 四川省泸定县Luding,Sichuan SC灢2 贾渝 (Y.Jia)J01931 (PE)
暋9 四川省泸定县Luding,Sichuan SC灢3 贾渝 (Y.Jia)J01951 (PE)
拟木毛藓Psedospiridentopsishorrida(Card)Fleisch
暋1 福建省将乐县Jiangle,Fujian FJ 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W48287 (PE)
暋2 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou GZ灢1 何强 (Q.He)H246 (PE)
暋3 贵州省道真县Daozhen,Guizhou GZ灢2 黄玉茜 (Y灡Q.Huang)H115 (PE)
暋4 贵州省道真县Daozhen,Guizhou GZ灢3 黄玉茜 (Y灡Q.Huang)H294 (PE)
大耳拟扭叶藓Trachypodopsisauriculata(Mitt.)Fleisch
暋1 广西省九万山JiuwanshanMountain,Guangxi GX灢1 龙光日&张灿明(G灡R灡Long&C灡M灡Zhang)GSY灡0286(PE)
暋2 广西省猫儿山 MaoerMountain,Guangxi GX灢2 左勤&王幼芳(Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1464(HSNU;PE)
暋3 广西省猫儿山 MaoerMountain,Guangxi GX灢3 左勤&王幼芳(Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1532(HSNU;PE)
暋4 云南省贡山Gongshan,Yunnan * 汪楣芝 (M灡Z.Wang),9310灢b (PE)
台湾拟扭叶藓TrachypodopsisformosanaNog.
暋1 重庆市城口县Chengkou,Chongqing * 贾渝 (Y.Jia)J10263 (PE)
1423期暋暋暋 暋暋暋暋赵丽嘉等:藓类植物DNA条码的初步研究———以蔓藓科部分属为例暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
续表1
种名Taxa 采集地Locality 标记Code 凭证标本Voucher(PE)
暋2 四川省泸定县Luding,Sichuan SC 贾渝 (Y.Jia)J01844 (PE)
暋3 西藏波密县Bomi,Xizang XZ 贾渝 (Y.Jia)J05755 (PE)
暋4 云南省贡山 Gongshan,Yunnan YN 刘阳 (Y.Liu)L3736 (PE)
疏耳拟扭叶藓TrachypodopsislaxoalurisBroth.
暋1 安徽省黄山 Huangshan,Anhui * 陈邦杰 (P灡C.Chen)7361a (PE)
暋2 四川省泸定县Luding,Sichuan * 贾渝 (Y.Jia)J01744 (PE)
暋3 四川省泸定县Luding,Sichuan * 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W58776 (PE)
拟扭叶藓Trachypodopsisserrulata(P.Beauv)Fleisch
暋1 重庆市南川区Nanchuan,Chongqing CQ灢1 刘阳 (Y.Liu)L2119 (PE)
暋2 重庆市巫溪县 Wuxi,Chongqing CQ灢2 李粉霞 (F灡X.Li)L1354 (PE)
暋3 贵州省道真县Daozhen,Guizhou GZ 何强 (Q.He)H036 (PE)
暋4 广西省猫儿山 MaoerMountain,Guangxi * 左勤 &王幼芳 (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)429 (PE)
暋5 广西省猫儿山 MaoerMountain,Guangxi * 左勤 &王幼芳 (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1353 (PE)
暋6 湖南省吊罗山DiaoluoMountain,Hunan * 林邦娟&张力 (B灡J.Lin&L.Zhang)1084 (PE)
扭叶藓TrachypusbicolorReinw.etHornsch
暋1 重庆市南川区 Nanchuan,Chongqing CQ 刘阳 (Y.Liu)L2632 (PE)
暋2 甘肃省文县 Wenxian,Gansu GS 李粉霞 (F.X.Li)L561 (PE)
暋3 广西省那坡县Napo,Guangxi GX 裴林英 (L灡Y.Pei)P2417 (PE)
暋4 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou GZ灢1 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W58901 (PE)
暋5 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou GZ灢2 何强 (Q.He)H410 (PE)
暋6 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou GZ灢3 何强 (Q.He)H476 (PE)
暋7 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou GZ灢4 黄玉茜 (Y灡Q.Huang)H345 (PE)
暋8 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou GZ灢5 黄玉茜 (Y灡Q.Huang)H455 (PE)
暋9 贵州省道真县 Daozhen,Guizhou GZ灢6 黄玉茜 (Y灡Q.Huang)H476 (PE)
暋10 湖北省宜昌市YichangCity,Hubei HB 王庆华 (Q灡H.Wang)W613 (PE)
暋11 四川省都江堰市DujiangyanCity,Sichuan SC灢1 刘阳 (Y.Liu)L123 (PE)
暋12 四川省泸定县Luding,Sichuan * 贾渝 (Y.Jia)J01885 (PE)
暋13 四川省泸定县Luding,Sichuan SC灢2 贾渝 (Y.Jia)J02198 (PE)
Trachypussp1(=T灡bicolor?)
暋1 四川省峨眉山EmeiMountain,Sichuan SC灢1 何强 (Q.He)H897 (PE)
暋2 四川省汶川县 Wenchuan,Sichuan SC灢2 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W58707 (PE)
暋3 四川省汶川县 Wenchuan,Sichuan SC灢3 刘阳 (Y.Liu)L756 (PE)
暋4 西藏墨脱县 Motuo,Xizang XZ 汪楣芝 (M灡Z.Wang)800518灢栟 (PE)
Trachypussp2(=T灡bicolor?)
暋1 甘肃省文县 Wenxian,Gansu GS 贾渝 (Y.Jia)J09324 (PE)
暋2 贵州省道真县Daozhen,Guizhou GZ 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W58955 (PE)
Trachypussp3(=T灡bicolor?)
暋1 四川省都江堰市DujiangyanCity,Sichuan SC 汪楣芝 (M灡Z.Wang)W57363 (PE)
小扭叶藓暋TrachypushumilisLindb.
暋1 广西省猫儿山 MaoerMountain,Guangxi * 左勤&王幼芳 (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)1823灢1 (PE)
暋2 广西省猫儿山 MaoerMountain,Guangxi * 左勤 &王幼芳 (Q灡Zuo&Y灡F灡Wang)299 (PE)
暋3 广西省那坡县 Napo,Guangxi * 裴林英 (L灡Y.Pei)P2550 (PE)
暋4 江西省上犹县Shangyou,Jiangxi JX 于宁宁 (N灡N.Yu)Y01236 (PE)
暋5 贵州省道真县Daozhen,Guizhou GZ 黄玉茜 (Y灡Q.Huang)H344 (PE)
长叶扭叶藓暋TrachypuslongifoliusNog.
暋1 广西省靖西县Jingxi,Guangxi GX 裴林英 (L灡Y.Pei)P2713 (PE)
暋2 湖北省神农架Shennongjia,Hubei * Sino灢ALutegn1726 (PE)
小蔓藓 Meteorielasoluta(Mitt).Okam.
暋1 贵州省道真县Daozhen,Guizhou GZ 黄玉茜 (Y灡Q.Huang)H364 (PE)
* 没有序列的样品 *unsequenced
242暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
表2暋引物序列及退火温度
Table2暋Primersequencesandannealingtemperatures(Ta)
Genome Gene Primername Primersequence (5曚to3曚) Ta(曟)
Chloroplast
atpB灢rbcL atpB灢1 ACATCKARTACKGGACCAATAA 50
rbcL AACACCAGCTTTRAATCCAA
atpF灢H atpF ACTCGCACACACTCCCTTTCC 50
atpH GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT
matK matK2灡1f CCTATCCATCTGGAAATCTTAG 50
matK5r GTTCTAGCACAAGAAAGTCG 52
matK3灡2r CTTCCTCTGTAAAGAATTC
matK1f CGATCTATTCATTCAATATTTC
matK1r TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT
psbK灢I psbK TTAGCCTTTGTTTGGCAAG 50
psbI AGAGTTTGAGAGTAAGCAT 52
rbcL灢a rbcL灢ar CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC 50
rbcL灢af ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
rps4 rps5 ATGTCCCGTTATCGAGGACCT 50
trnS TACCGAGGGTTCGAATC
trnH灢psbA psbA1f ACTGCCTTGATCCACTTGGC 50
trnH1r CGAAGCTCCATCTACAAATGG
psbA3F GTTATGCATGAACGTAATGCTC 50
trnH3R CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
Mitochondrion
nad5 nad3R AAAACGCCTGCTGTTACCAT 50
nad4F GAAGGAGTAGGTCTCGCTTCA
Nuclear
ITS2 P3 CTTGGCTCTTGCAACGATGA 52
P4 CCTCCCGCTTATTGATATGC
表3暋三类不同来源的基因组中12对引物的PCR扩增和测序成功率
Table3暋PCRandsequencingsuccessesof12pairsofprimersfor9lociinthreegenomes
Locusname Primername Samplestested
Lengthof
products
PCRsuccess
(%)
Sequencingsuccess
(%)
atpB灢rbcL atpB灢1,rbcL 74 714 96 93
atpF灢H atpF,atpH 50 700 85 71
matK matK1f,matK1r 24 0 0 —
matK2灡1f,matK5r 24 0 0 —
matK2灡1f,matK3灡2r 24 0 0 —
psbK灢I psbK,psbI 50 400,700 86 —
rbcL灢a rbcL灢af,rbcL灢ar 74 571 97 91
rps4 rps5,trnS 74 617 99 96
trnH灢psbA psbA3f,trnH3r 74 218 96 100
psbA1f,trnH1r 24 0 — —
nad5 nad3R,nad4F 74 1140 93 82
ITS2 P3,P4 74 468 100 96
有的片段的信息位点多且鉴定能力也弱,因此,
考虑使用多个基因片段的组合,至少是两个片段
组合对物种的分辨率可能有较大提高,因为组合
的基因片段在一定程度上可以降低因种内变异而
带来的影响,同时减少种内和种间变异的重叠,
但是不同组合的鉴定能力的大小差异不是很大。
图2中的P和Q说明atpB灢rbcL +trnH灢psbA +
rbcL灢a>rbcL灢a +rps4+trnH灢psbA>atpB灢
rbcL +trnH灢psbA +rps4,与NJ树方法的结果
也不一致。
3423期暋暋暋 暋暋暋暋赵丽嘉等:藓类植物DNA条码的初步研究———以蔓藓科部分属为例暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
图1暋ITS2和叶绿体基因鉴定能力的比较暋A.atpB灢rbcL和ITS2;B.rbcL灢a和ITS2
Fig灡1暋ComparisonsofthepoweridentificationofITS2andcpDNA.A.atpB灢rbcLandITS2;B.rbcL灢aandITS2
2灡3暋序列的多样性
我们所使用的基因片段的多样性是通过用变
异位点、信息位点、种间与种内分子多样性的比
率等3种指标来体现。由于异节藓属和拟木毛藓
属都是单种属,因此不存在种间和种内的比率
(表4)。总体来看,多样性最高的序列是核基因片
段ITS2 (13灡60),次之的是atpB灢rbcL(11灡89)。种
间和种内的多样性比率在扭叶藓属内最高,同样
最高的也是核基因片段TIS2 (31灡15),其次是
片段atpB灢rbcL(10灡45)。属间与属内的多样性
最高的是叶绿体片段trnH灢psbA (12灡81),其次
是rbcL灢a(10灡85)。
表4暋候选条码的序列多样性
Table4暋Sequencevariabilityofcandidatebarcodes
Locus Genera N L Cv p Vb/Va
Diaphanodon 3 607 0 0 —
Duthiela 16 675 13 3灡48 1灡66
atpB灢rbcL Psedospiridentopsis 4 633 0 0 —
Trachypodopsis 9 694 18 6灡06 1灡85
Trachypus 22 618 14 2灡92 10灡45
Altogether 54 694 45 11灡89 6灡13
Diaphanodon 3 566 1 0灡67 —
Duthiela 16 566 8 2灡70 6灡32
rbcL灢a Psedospiridentopsis 4 566 0 0 —
Trachypodopsis 9 566 5 1灡39 1灡00
Trachypus 22 566 12 2灡00 3灡12
Altogether 54 566 26 5灡20 10灡85
Diaphanodon 3 614 21 14灡00 —
Duthiela 16 615 11 3灡21 2灡34
rps4 Psedospiridentopsis 4 615 3 1灡50 —
Trachypodopsis 9 616 6 2灡22 1灡33
Trachypus 22 614 18 5灡46 3灡64
Altogether 54 616 38 9灡13 4灡94
Diaphanodon 3 213 0 0 —
Duthiela 16 217 4 0灡88 2灡01
trnH灢psbA Psedospiridentopsis 4 217 0 0 —
Trachypodopsis 9 218 4 1灡22 5灡52
Trachypus 22 214 14 3灡40 4灡53
Altogether 54 218 28 4灡21 12灡81
442暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
续表4
Locus Genera N L Cv p Vb/Va
Diaphanodon 2 1130 0 0 —
Duthiela 16 1126 39 7灡20 0/0
nad5 Psedospiridentopsis 4 1124 1 0灡50 —
Trachypodopsis 7 1130 13 0 0/0
Trachypus 21 1130 3 0 0/0
Altogether 54 1130 56 0 0/0
Diaphanodon 3 428 18 29灡33 —
Duthiela 16 413 22 5灡80 1灡79
ITS2 Psedospiridentopsis 4 412 0 0 —
Trachypodopsis 9 405 10 3灡56 1灡73
Trachypus 22 443 82 17灡71 31灡15
Altogether 54 443 132 13灡60 5灡78
注:序列长度 (L);变异位点 (Cv);两条序列之间每个位点平均的平均核苷酸差异 (p);种间与种内多样性差异的比率 (Vb/Va)。
N代表样品的序列数
Note:L:sequencelength;Cv:variablecharacters;p:theaveragenumberofnucleotidedifferencespersitebetweentwosequences;
Vb/Va:ratioofthevariancecomponentbetweenspeciestothevariancecomponentwithinspecies.N:numberofsamplessequenced
2灡4暋候选条码鉴别率的比较
2灡4灡1暋候选基因在BBA方法中的鉴别能力暋在
“bestmatch暠和 “bestclosematch暠检验中,
ITS2的鉴别率最高 (64灡81%)。在4个叶绿体
基因中atpB灢rbcL 的鉴别率最高,其次是rps4,
trnH灢psbA 则 最 低。使 用 “Al speciesbar灢
codes暠来 检 验,rbcL灢a 的 鉴 别 效 果 最 好
(48灡14%)。上述3种检验方法的结果并不是完
全一致,存在一定的差异 (表5)。
2灡4灡2暋NJ树的鉴定结果暋通过NJ树检验,在
单个基因片段中ITS2的鉴定效果最好 (57%),
其次是叶绿体片段非编码区atpB灢rbcL (表6)。
两个基因片段组合的结果显示atpB灢rbcL +
trnH灢psbA (图3)和rbcL灢a+trnH灢psbA 的鉴
别率最高,均为64%。当在这两个组合的基础
上再增加一个基因片段时,鉴定成功率并没有增
加,如atpB灢rbcL +trnH灢psbA +rbcL灢a和rbcL灢
a+trnH灢psbA +rps4 组合,其鉴别率仍然为
64%。4个叶绿体基因片段组合时鉴定率也没有
增加,同样是64%,如果在此4个组合上增加线
粒体片段nad5时,鉴定率却反而下降了 (50%)。
3暋讨论
3灡1暋引物的通用性
成为候选DNA条码的首要条件是引物的通
用性。本研究的9个片段的引物多数都很容易扩
增,psbK灢I和atpF灢H较低的扩增成功率,可能是
因为需要更严格的条件。matK在本次研究中没有
扩增成功,类似情况也见于其它研究中 (Fazekas
等,2008;Kressand Erickson,2007,2008;
Sass等,2007),此外,是否在藓类植物中扩增
matK还有其特殊性需要进一步探索。但是matK
表5暋基于 “bestmatch暠,“bestclosematch暠and“Alspeciesbarcodes暠的鉴定成功率
Table5暋Dentificationsuccess(%)basedon“bestmatch暠,“bestclosematch暠and“Alspeciesbarcodes暠
Locus
Bestmatch
SI AI MI
Bestclosematch
SI AI MI NM
Alspeciesbarcodes
SI AI MI NM
atpB灢rbcL 62灡96 35灡18 1灡85 61灡11 35灡18 1灡85 1灡85 42灡59 53灡7 1灡85 1灡85
rbcL灢a 51灡85 46灡29 1灡85 51灡85 44灡44 1灡85 1灡85 48灡14 48灡14 1灡85 1灡85
rps4 57灡4 35灡18 7灡4 57灡4 33灡33 5灡55 3灡7 31灡48 61灡11 3灡7 3灡7
trnH灢psbA 46灡29 46灡29 7灡4 46灡29 46灡29 7灡4 0 44灡44 53灡7 1灡85 0
nad5 26灡0 64灡0 10灡0 26灡0 64灡0 10灡0 0 14灡0 78灡0 8灡0 0
ITS2 64灡81 29灡62 5灡55 64灡81 29灡62 3灡7 1灡85 40灡73 57灡4 0 1灡85
注:鉴定成功 (SI);模糊鉴定 (AI);鉴定失败 (MI);没有匹配 (NM).
Note:SI:successfulidentification;AI:ambiguousindentificaiton;MI:misidentification;NM:nomatch.
5423期暋暋暋 暋暋暋暋赵丽嘉等:藓类植物DNA条码的初步研究———以蔓藓科部分属为例暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
图2暋基于6个候选DNA条码和不同组合的K2P遗传距离比较图
Fig灡2暋K2PpairwisegeneticdistancebasedonsixcandidateDNAbarcodingregionsanddifferentcombinationloci
A.atpB灢rbcLandrbcL灢a;B.atpB灢rbcLandrps4;C.atpB灢rbcLandtrnH灢psbA;D.rbcl灢aandtrnH灢psbA;
E.rbcl灢aandrps4;F.rps4andtrnH灢psbA;G.atpB灢rbcLandnad5;H.rbcL灢aandnad5;I.rps4andnad5;J.
trnH灢psbAandnad5;K.atpB灢rbcL +trnH灢psbAandatpB灢rbcL +rbcL灢a;L.atpB灢rbcL +rps4andrbcL灢a+
rps4;M.rbcL灢a+trnH灢psbAandrps4+trnH灢psbA;N.atpB灢rbcL +trnH灢psbA +rbcL灢aandrbcL灢a+rps4+
trnH灢psbA;O.atpB灢rbcL +trnH灢psbA +rps4andatpB灢rbcL+trnH灢psbA +rps4
642暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
图3暋基于atpB灢rbcL和trnH灢psbA的NJ树,曪 样品存在分类学问题
Fig灡3暋TheNJtreebasedontheregionofatpB灢rbcLandtrnH灢psbA,曪indicatestaxonomicproblemofthesample
在一些被子植物类群中的扩增成功率较高 (La灢
haye等,2008a,b;Starr等,2009;Hiling灢
sworth等,2009)。考虑到nad5的长度 (1131
bp),93%的扩增成功率已经很好。尽管ITS2
片段是多拷贝,但是对样品的扩增和测序都全部
成功。从PCR扩增成功率来考虑,高等植物通
用引物的设计应该从保守性这个特点出发。
3灡2暋ITS2是藓类中最有效的一个片段
Kress等 (2005)首次提出把核基因ITS片
断作为植物两个候选的DNA条码片段之一。但
从那之后即被忽略。迄今为止这个片段在植物
DNA条码中应该是最好的一个候选条码,尤其是
7423期暋暋暋 暋暋暋暋赵丽嘉等:藓类植物DNA条码的初步研究———以蔓藓科部分属为例暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
表6暋单个片段和不同组合的鉴定结果,使用了没有缺失数据的55个样品
Table6暋Resolutionofasinglelocusandsomecombinationsofmultipleloci.55samplesofnomissingdatawereused
Locus La Cv Ci Ps(%) Locus La Cv Ci Ps(%)
atpB灢rbcL 701 68 47 50 rbcL灢a+rps4 1182 99 63 43
rbcL灢a 566 34 21 43 rbcL灢a+trnH灢psbA 783 60 39 64
Rps4 616 65 42 29 rps4+trnH灢psbA 833 91 60 50
trnH灢psbA 217 26 18 37 atpB灢rbcL +trnH灢psbA +rbcL灢a 1484 128 86 64
Nad5 1131 52 21 7 atpB灢rbcL +trnH灢psbA +rps4 1524 159 107 50
ITS2 460 124 87 57 rbcL灢a+trnH灢psbA +rps4 1399 125 81 64
atpB灢rbcL +rbcL灢a 1268 102 68 57 atpB灢rbcL+rbcL灢a+rps4+trnH灢psbA 2100 193 128 64
atpB灢rbcL +rps4 1318 133 89 57 rps4+atpB灢rbcL+rbcL灢a+trnH灢psbA+nad5 3231 245 149 50
atpB灢rbcL +trnH灢psbA 918 94 65 64
比对长度 (La);信息位点 (Ci);变异位点 (Cv);物种作为单系的鉴定成功率 (Ps)
La:alignedlength;Cv:variablecharacters;Ci:informativecharacters;Ps:percentagesofspeciesresolvedasuniqueclusters
像苔藓植物这样的以单倍体在生活史中占优势的
大类群,因为杂交不会给测序带来任何困难。在
序列变异较大和拷贝数不太清楚的情况下,这个
片段的缺点之一是比对较难。尽管本次研究只使
用了第二个内含子,但却有124个变异位点和
87个简约信息位点,而且是本次研究中6个候
选基因里,使用 “bestmatch暠和 “bestclose
match暠和NJ树等检验方法鉴定成功率最高的
(分别是64灡81%和57%)。ITS2在对扭叶藓属
和异节藓属的鉴定中却是失败的,这可能是因为
这两个属本身内在生物学原因所致。因为尽管我
们所使用的4个叶绿体基因的鉴定率较ITS2
低,但是它们却能将这两个属区分开,而且将叶
绿体基因片段和核基因片段ITS2组合也无法将
两属区分开。同样的情况在 Hedenas等 (2009)
对北美西部的同蒴藓属Homalothecium 的研究
以及Draper等 (2007)对猫尾藓属Isothecium
的研究中出现过。在DNA条码中核基因的缺陷
可以用质体基因片段来弥补。尽管ITS不是很
理想,但是由于它的变异较高,在研究DNA条
码中,对于理解自然的物种是不可缺少的,因此
应该很好地使用它。
3灡3暋atpB灢rbcL是藓类中效果较好的叶绿体片段
单个片段中非编码基因片段atpB灢rbcL鉴定
成功率最高 (57%),其次是rbcL (43%)。at灢
pB灢rbcL在以前的研究中没有被考虑作为DNA
条码的候选基因,但是我们的研究结果显示它可
能是藓类中比较好的一个潜在的候选基因,但
是,它还需要更多的数据来验证,而且它的长度
在藓类中是519bp到557bp,适合PCR扩增和
单向测序。
rps4被广泛的应用在苔藓和蕨类的系统重
建分析中,它可以很好的区别科和属。这个片段
的序列中很少有间隙 (gap)存在,因此,序列
很容易比对。然而在我们的数据中rps4和rbcL灢
a的结果却是相互矛盾的。非编码区trnH灢psbA
曾经被提出作为植物DNA条码的候选基因,并
且指出它可能是变异位点最多的一个叶绿体片段
(Kress等,2005),而且在某些植物类群中鉴别
效果比较好 (Newmadter等,2008;Starr等,
2009)。尽管如此,在藓类植物中trnH灢psbA 序
列太短 (217bp),不是一个理想的候选基因。
线粒体片段nad5的变异位点较少,可以考
虑用于科一级的鉴别。虽然以前的研究结果将线
粒体基因排除在DNA条码候选基因之外,但是
在我们的研究中仍然使用它来检验鉴定物种的效
果,不过数据显示这一片段不适合作DNA条码
的候选基因。
3灡4暋DNA条码的不同组合
由于单个片段的鉴别率较低,我们考虑使用
不同片段的组合来鉴别并通过NJ树的方法分析
了各种组合,出乎意料地发现,两个叶绿体片段
组合的鉴别率是最高的。在此基础上增加一个或
者多个片段并没有提高鉴定率,有时反而会降低
鉴别率,类似的结果在以前的研究中也出现过
(Starr等,2009)(图4)。
致谢暋在研究过程中吴鹏程教授协助鉴定标本,在此表
示感谢。
842暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
图4暋不同片段组合的最高鉴别率
Fig灡4暋Thehighestdiscriminationofdifferentcombination
暡参暋考暋文暋献暢
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