全 文 ：竹亚科叶绿体 DNA条形码筛选*
张玉霄1,2, 许宇星4, 马朋飞1,2, 张丽娜1,2,3, 李德铢1,2**
(1 中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室, 云南 昆明摇 650201; 2 中国科学院
昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库, 云南 昆明摇 650201; 3 中国科学院大学,
北京摇 100049; 4 西北农林科技大学生命科学学院, 陕西 杨凌摇 712100)
摘要: 竹亚科是一个形态上鉴定困难且易于混淆的类群。 DNA条形码技术为这一类群的鉴定提供了一个辅
助手段。 核心条形码 ( rbcL+matK) 在竹亚科中的鉴别率很低, 因此, 有必要针对竹亚科筛选有效的 DNA
条形码片段。 本研究根据已发表的竹亚科叶绿体基因组序列, 筛选出 16 个片段, 包括 1 个基因片段和 15
个基因间隔区, 选取青篱竹族和箣竹族的 10 属 22 种 30 个个体, 进行引物通用性、 测序成功率和变异位
点分析。 研究结果表明: (1) 引物具有较高的扩增成功率, 但部分片段中由于存在 poly 结构造成测序失
败; (2) 片段中的插入 /缺失可以编码, 作为信息位点; (3) trnG鄄trnT(t)具有最多变异位点, 建议可作为
竹亚科优先选择的 DNA条形码; (4) 在开展不同类群的 DNA 条形码和分子系统学研究时, 可以按照
“ trnG鄄trnT(t)+X冶 的方式选择合适的叶绿体 DNA片段。
关键词: 竹亚科; DNA条形码; 插入 /缺失; 分子系统学; 叶绿体片段筛选
中图分类号: Q 948, Q 781摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-743-08
Selection of Potential Plastid DNA Barcodes for
Bambusoideae (Poaceae)
ZHANG Yu鄄Xiao1,2, XU Yu鄄Xing4, MA Peng鄄Fei1,2, ZHANG Li鄄Na1,2,3, LI De鄄Zhu1,2**
(1 Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Kunming 650201, China; 2 Germplasm Bank of Wild Species, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy
of Sciences, Kunming 650201, China; 3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4 College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)
Abstract: Bamboos are a taxonomically difficult group. DNA barcoding provides another supplementary method for
the bamboo identification. The core DNA barcodes ( rbcL+matK) have quite low discriminatory power in bamboos,
therefore, it is crucial to select effective DNA barcodes for bamboos. We scanned the entire chloroplast genomes that
were published in Bambusoideae in order to search highly variable regions. Sixteen regions were selected including
one coding region and 15 intergenic spacers, and the universality, sequencing success rates, and the variable char鄄
acters were testified in 30 taxa of 22 species in 10 genera of Arundinarieae and Bambuseae. The results indicated
that (1) the amplification success rates were high for each region, but there were some problems in sequencing for
some regions due to poly鄄structures; (2) indels should be coded as informative characters; (3) the region trnG鄄trnT
(t) was the most variable one among the 16 regions and it was suggested as the prior candidate DNA barcode in
Bambusoideae; (4) the combination “ trnG鄄trnT( t) +X冶 can be used in DNA barcoding and molecular鄄phylogeny
reconstruction study of bamboos.
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 743 ~ 750
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313199
*
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基金项目: 国家自然科学基金 (31100148); NSFC鄄云南联合基金 (U1136603); 科技部科技基础性工作专项项目 (2013FY112600); 科
技部国家高技术研究发展计划 (863计划) 主题项目 (2012AA021801); 中国科学院大科学装置项目 (2009鄄LSFGBOWS鄄01)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: dzl@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2013-09-30, 2013-10-14 接受发表
作者简介: 张玉霄 (1981-) 女, 博士, 助理研究员, 主要从事竹类分类、 系统与进化研究。 E鄄mail: zhangyuxiao@ mail. kib. ac. cn
Key words: Bambusoideae; DNA barcoding; Indels; Molecular phylogeny; Plastid region selection
摇 DNA 条形码是一种利用标准的、 有足够变
异的、 易扩增且相对较短的 DNA 序列来进行物
种鉴别的技术和方法 (Hebert 等, 2003; Kress
等, 2005)。 目前, 在动物中通常利用线粒体基因
细胞色素 C氧化酶亚基 I (COI) 的一段序列进行
物种鉴定, 并且在一些动物中有效地实现了 DNA
条形码鉴定, 如蝴蝶、 鸟类、 鱼类、 蜘蛛等
(Waugh, 2007)。 在植物中 COI 进化较慢, 不适
用于物种鉴定。 生命条形码联盟植物工作组通过
一定规模的筛选, 提出将 rbcL 和 matK 作为植物
分子鉴定的核心条形码 (CBOL Plant Working
Group, 2009); 中国植物条形码研究组通过对两
个核心条形码 ( rbcL+matK) 以及 trnH鄄psbA 和
ITS / ITS2在 1757种植物中的鉴别能力评估, 提出
应将 ITS / ITS2也作为种子植物的核心条形码 (Li
等, 2011)。 虽然基于大量实验数据提出了植物核
心 DNA条形码, 在很多植物类群中也具有较好的
物种鉴别力, 如桤木属 ( Alnus)、 红豆杉属
(Taxus)、 蕨类 (Ren 等, 2010; Li 等, 2011; Liu
等, 2011), 但是在一些类群中这些片段的鉴别力
有限, 如小檗属 (Berberis)、 白蜡树属 (Fraxi鄄
nus) 和百里香属 (Thymus) (Roy 等, 2010; Arca
等, 2012; Federici等, 2013)。
竹亚科青篱竹族 (Arundinarieae) 约有 500 ~
600种, 中国有 300 多种, 是该族的现代分布中
心, 分子系统学研究表明, 该类群可能是快速辐
射进化形成的, 因而不同物种分子水平差异较小,
形态学鉴定困难 (Hodkinson 等, 2010; Zeng 等,
2010; Zhang 等, 2012)。 DNA 条形码技术为青篱
竹族的鉴定提供了一个潜在的辅助手段。 Cai 等
(2012) 利用 3 个叶绿体片段 rbcL, matK, trnH鄄
psbA和核基因片段 ITS对青篱竹族 27个代表种开
展了条形码研究, 研究结果表明叶绿体片段均具
有较好的通用性但鉴别率低, 单个叶绿体片段在
属和种水平的鉴别率均小于 12%, 片段组合的鉴
别率则小于 15%; 虽然 ITS 的鉴别率明显高于叶
绿体片段, 但通用性较差。 我国分布的竹类植物
另一大类群为箣竹族 (Bambuseae), 共有 140 多
个种, 以箣竹属 (Bambusa) 和牡竹属 (Dendro鄄
calamus) 居多, 分子系统学研究表明, 上述两属
与巨竹属 (Gigantochloa) 等构成 BDG 复合群,
该复合群的种间差异小, 并且可能存在杂交和不
完全谱系分选 (Yang 等, 2010; Goh 等, 2013)。
鉴于 rbcL, matK, trnH鄄psbA和 ITS片段在青篱竹
族中较低的鉴别率, 以及箣竹族系统学研究中所
使用的分子片段 (BPG, 2012), 可以推测上述 3
个叶绿体 DNA条形码片段在箣竹族中的物种鉴别
率不会太高, 而 ITS 同样面临通用性的问题。 总
体来看, 目前通用的 DNA条形码在竹亚科木本竹
子中的鉴别率远远不能达到 DNA鉴定的目的, 因
此有必要筛选更适合竹亚科的有效 DNA 条形码。
鉴于竹类植物为多倍体 (陈瑞阳等, 2003), 对核
基因片段筛选必然会存在很多困难, 本研究主要
根据已有竹亚科叶绿体基因组的信息, 开展叶绿
体 DNA条形码筛选工作, 以青篱竹族和箣竹族的
代表种为研究对象, 以期筛选出更有效的 (通用性
好、 变异位点多、 长度适当) 叶绿体 DNA片段。
1摇 材料和方法
1. 1摇 实验材料
本研究共选取竹亚科植物 10 属 22 种 30 个个体, 包
括青篱竹族 7 属 14 种, 其中中华大节竹 ( Indosasa sinica
C. D. Chu & C. S. Chao)、 摆竹 ( Indosasa shibataeoides
McClure) 和糙花少 穗 竹 ( Oligostachyum scabriflorum
(McClure) Z. P. Wang & G. H. Ye) 为第 VI 分支类群,
其他种为第 V分支类群 (Zeng等, 2010), 箣竹族 3 属 8
种, 以 BDG 复合群的类群为主 (Goh 等, 2013)。 为了
检验种内变异, 选取短穗竹 (Semiarundinaria densiflorum
(Rendle) T. H. Wen) 9 个个体, 其他每种 1 个个体 (表
1)。 在野外采集的新鲜叶片置于硅胶中干燥, 凭证标本
存放于中国科学院昆明植物研究所标本馆 (KUN)。
1. 2摇 DNA片段选择及引物设计
根据已发表的 10 个竹亚科叶绿体全基因组数据
(Wu等, 2009; Zhang 等, 2011; Burke 等, 2012), 利用
软件 MEGA 4. 0 (Tamura 等, 2007) 比较和分析基因间
隔区和部分编码区的变异位点数目, 筛选出 15 个基因
间隔区片段和 1 个编码区片段 (表 2)。 除了 rpl32鄄trnL
和 trnT鄄trnL使用已发表的通用引物外 (Shaw 等, 2007;
Zeng等, 2010), 其他 14 个片段的引物均为作者利用软
件 Primer Premier v 5. 0 (Premier Biosoft International, Palo
Alto, California) 设计。 引物由生工生物工程 (上海) 股
份有限公司合成。
447摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
表 1摇 实验材料及凭证标本
Table 1摇 Materials and voucher information
种名 Taxon 采集地 Locality 凭证标本 Voucher
青篱竹族 Arundinarieae Nees ex Asch. & Graebn.
宁南方竹 Chimonobambusa ningnanica Hsueh & L. Z. Gao 云南, 元阳 CZM038
八月竹 Chimonobambusa szechuanensis (Rendle) P. C. Keng 四川, 马边 08001
空心箭竹 Fargesia edulis Hsueh & T. P. Yi 云南, 云龙 WXQ07018
腾冲箭竹 Fargesia solida T. P. Yi 云南, 福贡 ZXZ鄄11013
云南箭竹 Fargesia yunnanensis Hsueh & T. P. Yi 云南, 昆明 CZM083
摆竹 Indosasa shibataeoides McClure 广东, 广宁 10028
中华大节竹 Indosasa sinica C. D. Chu & C. S. Chao 云南, 金平 CZM050
肿节少穗竹 Oligostachyum oedogonatum (Z. P. Wang & G. H. Ye) Q. F. Zheng & K. F. Huang 福建, 屏南 08047
糙花少穗竹 Oligostachyum scabriflorum (McClure) Z. P. Wang & G. H. Ye 福建, 闽清 08045
美竹 Phyllostachys mannii Gamble 云南, 昆明 ZLN鄄2011142
毛环竹 Phyllostachys meyeri McClure 浙江, 安吉 ZLN鄄2011032
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 安徽, 广德 12040
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 安徽, 广德 12054
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 安徽, 岳西 12065
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 安徽, 岳西 12078
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 安徽, 霍山 12089
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 安徽, 霍山 12097
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 江苏, 溧阳 12109
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 江苏, 宜兴 12114
短穗竹 Semiarundinaria densiflora (Rendle) T. H. Wen 江苏, 宜兴 12121
斑壳玉山竹 Yushania maculata T. P. Yi 云南, 巧家 WXQ099007
泡滑竹 Yushania mitis T. P. Yi 云南, 巧家 WXQ10202
箣竹族 Bambuseae Kunth ex Dumort.
油簕竹 Bambusa lapidea McClure 云南, 江城 12152
马甲竹 Bambusa teres Buchanan鄄Hamilton ex Munro 云南, 盈江 12204
芸香竹 Bonia amplexicaulis (L. C. Chia et al. ) N. H. Xia 广西, 凭祥 12329
单枝竹 Bonia saxatilis (L. C. Chia et al. ) N. H. Xia var. saxatilis 广西, 巴马 12327
小叶龙竹 Dendrocalamus barbatus Hsueh & D. Z. Li 云南, 江城 12151
缅甸龙竹 Dendrocalamus birmanicus A. Camus 云南, 瑞丽 12200
勃氏甜龙竹 Dendrocalamus brandisii (Munro) Kurz 云南, 江城 12142
美穗龙竹 Dendrocalamus calostachyus (Kurz) Kurz 云南, 关累 12165
1. 3摇 DNA提取、 PCR扩增和测序
采用改良的 CTAB 法提取总 DNA (Doyle 和 Doyle,
1987), 并将其溶于 1伊TE缓冲液中, 浓度稀释为 70 ng /
滋L ~ 150 ng / 滋L。
PCR反应体系为 16. 5 滋L, 包括 DNA模板 1 滋L, 正
反向引物各 0. 5 滋L (5 滋M), 2伊Taq PCR MasterMix (天
根生化科技 (北京) 有限公司) 7 滋L, 双蒸水 7. 5 滋L。
PCR扩增程序如下: 95 益, 预变性 2 min; 95 益变性 1
min, 50 益退火 10 s, 0. 3 益 /秒升温至 65 益, 65 益延伸
1 min, 进行 33 个循环; 65 益延伸 10 min。
PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 采
用 ExoSAP鄄IT 酶 (10 伊) (USB, Cleverland, OH, USA)
进行纯化。 纯化反应如下: 5 滋L PCR 产物与 2 滋L 纯化
酶混合, 置于 PCR 仪上, 37 益消化 15 min, 80 益变性
15 min, 使酶失活。 纯化产物用于测序反应, 反应体
系为 5 滋L, 包括纯化产物 0. 7 滋L, 引物 0. 5 滋L (5
滋M), BigDye v3. 1 (Life Technologies Corporation, USA)
0. 3 滋L, 双蒸水 3. 5 滋L; 反应程序: 96 益变性 10 s,
50 益 退火 5 s, 60 益 延伸 4 min, 进行 32 个循环。 测序
反应产物经酒精纯化后, 在 ABI 3730xl 测序仪上进行
测序。
1. 4摇 数据分析
测得的序列使用 Geneious 4. 8. 3 ( Biomatters Ltd.,
http: / / www. geneious. com) 和 Lasergene软件包中的 Seq鄄
Man (DNA STAR package; DNA Star Inc., Madison, WI,
USA) 进行编辑和拼接, 拼接好的序列用 Geneious 4. 8. 3
集成的 MUSCLE软件进行比对, 并对部分序列进行手工
调整。 使用 PAUP*4. 10b (Swofford, 2002) 软件进行变
异位点和信息位点统计。 所有序列已提交 GenBank, 序
列号 KF764704鄄KF765159。
5476 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张玉霄等: 竹亚科叶绿体 DNA条形码筛选摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 16 个叶绿体 DNA片段的引物序列及片段长度
Table 2摇 Primers and length of the 16 plastid regions
分子片段
Molecular
marker
摇 摇 摇 引物序列(5忆-3忆)
摇 摇 摇 摇 摇 Primer
长度*
Length / bp
ndhC鄄trnV
(UAC)
F: AAATATCATATTCGTGAAGC
R: TATAGACTGGACGGTCGC 579-765
ndhF鄄rpl32 F: AACTGGAAGTGGGAGAAGR: GATAAAAGGAAGGGAAAAT 478-963
ndhI鄄ndhA
内含子
F: TTCCGAATTGATCTCGTCC
R: TGCTCCTATTGGTCTTCTTATG 815-821
ndhK F: TGAAAGATTGCCCTGCTCR: TCGTGCTTATCCCAGTTG 539-697
psaC鄄ndhE F: TGGCTTTACACCCATCCCR: ATCGGTTCAATTCTTGTCCTC 847-917
rbcL鄄psaI F: CGATCTTGCTCGTGAAGGR: CGAAACTCGCTCTTATCCTATC 606-775
rbcL鄄psaI鄄ycf4 F: GGATAGGATAAGAGCGAGTTR: AAAAGAATACAGGCCCAG 976-993
rpl32鄄trnL
(UAG)*
F: CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC
R: CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT 781-824
rpoC2鄄rps2 F: CATTCCCCACAAGACAAGR: AAGAAAGAGCCGAAATAGC 308-373
rps15鄄ndhF F: TTTGCTGGCTTATTTGGCR: TGGAGTAGGTCTTGCTGGT 542-582
trnD(GUC)鄄
psbM
F: CCGTCAGTCCCGAACTAG
R: AAGGGGTATCCTGTAAATTC 816-884
trnG(UCC)鄄
trnT(GGU)(g)
F: AACTATACCCGCTACATG
R: CATACCTAACTCCTCCTG 604-884
trnG(UCC)鄄
trnT(GGU)(t)
F: CCGATGACTTATGCCTTAC
R:TTACCAAATGTTCCTCCCA 1080-1210
trnL(UAA)鄄
ndhJ
F:TGGGTTTAAGATTCATTAG
R:TCCAGATAGACTGAGCAA 681-691
trnT(UGU)鄄
trnL(UAA)*
F: CATTACAAATGCGATGCTCT
R: TCTACCGATTTCGCCATATC 702-801
ycf4鄄cemA F: TGTGGAATGTAGGCAGTGR:ACTTAGAATAGCCAAACAGA 963-1008
* rpl32鄄trnL采用 Shaw等 (2007) 文章中的引物, trnT鄄trnL采用
Taberlet等 (1991) 文章中的引物, 其他片段的引物均在本研究
中设计。 “长度冶 是指测序后得到的片段有效和相对长度
2摇 结果
2. 1摇 引物通用性
除了 rpl32鄄trnL、 trnT鄄trnL 和 ycf4鄄cemA 外,
其他 13 个叶绿体 DNA 片段的扩增成功率均为
100% (表 3)。 肿节少穗竹 (Oligostachyum oedogo鄄
natum (Z. P. Wang & G. H. Ye) Q. F. Zheng &
K. F. Huang) 和云南箭竹 (Fargesia yunnanensis
Hsueh & T. P. Yi) 的 rpl32鄄trnL片段未能扩增出
来, 使得该片段的扩增成功率只有 93. 33% ; 宁
南方竹 (Chimonobambusa ningnanica Hsueh & L.
Z. Gao) 的 trnT鄄trnL 和 ycf4鄄cemA 片段扩增失
败, 使得这两个片段总体的扩增成功率为 96. 67%。
ndhC鄄trnV、 ndhA内含子、 psaC鄄ndhE、 rbcL鄄psaI鄄ycf4、
rpoC2鄄rps2、 trnD鄄psbM和 ycf4鄄cemA共计 7 个片段
的测序成功率为 100%, ndhF鄄rpl32 (83. 33%)
和 trnT鄄trnL (89. 66%) 的测序成功率低于 90%,
其他 7 个片段的测序成功率均在 90%以上 (包
括 90% )。
2. 2摇 序列特征
16 个 DNA 片段的长度为 308 bp ~ 1 210 bp
(表 2), 最短的片段为 rpoC2鄄rps2, 最长的片段
为 trnG鄄trnT(t)。 比对后序列产生插入 /缺失, 长
度发生变化, 全部序列比对以及按不同族分别比
对得到的序列长度不同 (表 3)。 trnG鄄trnT( t)的
长度最长, 变异位点和信息位点最多。 从总体水
平来看, 变异位点 (VCs) 和信息位点 (PICs)
数目较多的 3 个片段均为 trnG鄄trnT( t), trnG鄄
trnT(g), 和 rpl32鄄trnL; 在青篱竹族中, VCs 数
目较多的 4 个片段是 trnG鄄trnT( t), ndhF鄄rpl32,
rbcL鄄psaI鄄ycf4 以及 trnD鄄psbM, PICs数目较多的 3
个片段是 trnG鄄trnT( t), ndhF鄄rpl32, 以及 rbcL鄄
psaI鄄ycf4; 在箣竹族中, VCs 和 PICs 数目较多的
3 个片段均为 trnG鄄trnT( t), rpl32鄄trnL 和 trnG鄄
trnT(g)。 短穗竹的 9 个个体在 16 个片段中均没
有变异。
除了 ndhK 片段没有插入 /缺失外, 其他片
段在序列比对后大多数产生插入 /缺失, 其数目
在各个片段中不同。 所有序列比对后, trnG鄄trnT
(t)中的插入 /缺失数目最多 (24), ndhC鄄trnV其
次 (13), psaC鄄ndhE 和 rps15鄄ndhF 第三 (10);
在青篱竹族中, rps15鄄ndhF 最多 (9), trnG鄄trnT
( t ) 其次 ( 7 ), psaC鄄ndhE 和 rpoC2鄄rps2 第三
(5); 在箣竹族中, trnG鄄trnT ( t ) 最多 (13),
ndhC鄄trnV其次 (6), rbcL鄄psaI第三 (4)。
在所选的 16 个片段中都包含有重复在 6 个
及其以上的 poly 结构, 这些 poly 结构在部分序
列中位于两端, 包括 rpoC2鄄rps2, ndhF鄄rpl32,
trnD鄄psbM, psaC鄄ndhE, trnT鄄trnL, rps15鄄ndhF 和
rbcL鄄psaI, 其他 9 个片段的 poly 结构则位于片段
的中部附近。 此外, 在 rbcL鄄psaI、 rbcL鄄psaI鄄ycf4
和 rpl32鄄trnL 中各有一处倒位 ( inversion) 发生
(图 1; rpl32鄄trnL示意图见 Zeng等, 2010)。
647摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
表 3摇 备选叶绿体分子片段相关参数信息表
Table 3摇 Summary of the relevant parameters of the selected plastid markers
分子片段
Molecular
marker
扩增成功率
Amplification
success
rate / %
测序成功率
Sequencing
success
rate / %
序列比对后
的长度
(T / A / B)*
Aligned sequence
length
变异位点数
(T / A / B)
No. of VCs*
/ %
信息位点数
(T / A / B)
No. of PICs*
/ %
插入 /缺失
(T / A / B)
Insertion /
Deletion
(T / A / B)
ndhC鄄trnV
(UAC) 100 100 816 / 605 / 791 19 / 3 / 7(2. 33 / 0. 50 / 0. 88) 15 / 2 / 2(1. 84 / 0. 33 / 0. 25) 13 / 3 / 6
ndhF鄄rpl32 100 83. 33 504 / 503 / 498 32 / 11 / 5(6. 35 / 2. 19 / 1. 00) 22 / 8 / 0(4. 37 / 1. 59 / 0. 00) 5 / 2 / 1
ndhA内含子 100 100 825 / 825 / 821 29 / 7 / 6(3. 52 / 0. 85 / 0. 73) 24 / 5 / 3(2. 91 / 0. 61 / 0. 37) 2 / 2 / 0
ndhK 100 93. 33 697 / 697 / 697 13 / 4 / 2(1. 87 / 0. 57 / 0. 29) 11 / 3 / 1(1. 58 / 0. 43 / 0. 14) 0 / 0 / 0
psaC鄄ndhE 100 100 989 / 959 / 876 21 / 4 / 4(2. 12 / 0. 42 / 0. 46) 15 / 1 / 1(1. 52 / 0. 10 / 0. 11) 10 / 5 / 1
rbcL鄄psaI 100 96. 67 788 / 781 / 745 26 / 7 / 4(3. 30 / 0. 90 / 0. 54) 25 / 6 / 4(3. 17 / 0. 77 / 0. 54) 6 / 0 / 4
rbcL鄄psaI鄄ycf4 100 100 1011 / 998 / 982 28 / 7 / 6(2. 77 / 0. 70 / 0. 61) 26 / 6 / 3(2. 57 / 0. 60 / 0. 31) 6 / 4 / 0
rpl32鄄trnL
(UAG) 93. 33 96. 43 842 / 797 / 830 38 / 6 / 12(4. 51 / 0. 75 / 1. 45) 31 / 3 / 9(3. 68 / 0. 38 / 1. 08) 8 / 2 / 2
rpoC2鄄rps2 100 100 379 / 373 / 345 7 / 4 / 2(1. 85 / 1. 07 / 0. 58) 5 / 1 / 2(1. 32 / 0. 27 / 0. 58) 7 / 5 / 0
rps15鄄ndhF 100 93. 33 627 / 609 / 551 11 / 4 / 1(1. 75 / 0. 66 / 0. 18) 11 / 3 / 1(1. 75 / 0. 49 / 0. 18) 10 / 9 / 1
trnD(GUC)鄄
psbM 100 100 908 / 830 / 884 35 / 9 / 7(3. 85 / 1. 08 / 0. 79) 29 / 5 / 4(3. 19 / 0. 60 / 0. 45) 8 / 2 / 0
trnG(UCC)鄄
trnT(GGU)(g) 100 96. 67 900 / 839 / 890 44 / 4 / 9(4. 89 / 0. 48 / 1. 01) 42 / 4 / 7(4. 67 / 0. 48 / 0. 79) 6 / 1 / 3
trnG(UCC)鄄
trnT(GGU)(t) 100 93. 33 1333 / 1251 / 1220 140 / 31 / 67(10.50 / 2.48 / 5.49) 109 / 16 / 49(8.18 / 1.28 / 4. 02) 24 / 7 / 13
trnL(UAA)鄄
ndhJ 100 90 699 / 692 / 691 20 / 6 / 4(2. 86 / 0. 87 / 0. 58) 18 / 5 / 2(2. 58 / 0. 72 / 0. 29) 2 / 0 / 1
trnT(UGU)鄄
trnL(UAA) 96. 67 89. 66 819 / 761 / 802 29 / 5 / 6(3. 54 / 0. 66 / 0. 75) 21 / 4 / 1(2. 56 / 0. 53 / 0. 12) 3 / 0 / 1
ycf4鄄cemA 96. 67 100 1022 / 972 / 1008 24 / 7 / 5(2. 35 / 0. 72 / 0. 50) 21 / 5 / 3(2. 05 / 0. 51 / 0. 30) 4 / 1 / 0
*VCs: variable characters, PICs: parsimony鄄informative characters. T: 全部序列; A: 青篱竹族; B: 箣竹族
图 1摇 rbcL鄄psaI (A) 和 rbcL鄄psaI鄄ycf4 (B) 片段中的倒位及
倒位重复序列。 黑体部分表示倒位序列, 下划线部分表示
倒位重复序列 (inverted repeat)
Fig. 1摇 Inversion sequence types in the rbcL鄄psaI (A) and rbcL鄄
psaI鄄ycf4 (B) regions. The bold characters indicate the inversions
and the underlined characters indicate inverted repeats
2. 3摇 属内和种间以及分支之间和分支内部的序
列变异
箣竹族取样中箣竹属 (Bambusa) 和牡竹属
(Dendrocalamus) 的序列差异较小, 除了 ndhF鄄
rpl32、 trnG鄄trnT( g)、 trnG鄄trnT( t)和 trnL鄄ndhJ,
箣竹属的序列均与牡竹属相同, 单枝竹属 (Bon鄄
ia) 与上述两属的序列差异较大, 包括碱基突变
和插入 /缺失 (表 4)。 箣竹属的 2 个种仅在
trnG鄄trnT(g)片段中有 1 个碱基变异, 除 ndhF鄄
rpl32 和 trnL鄄ndhJ未测出外, 其他片段的序列一
致; 牡竹属的 4 个种在不同片段中的差异情况不
同, 在 ndhF鄄rpl32、 psaC鄄ndhE 和 trnD鄄psbM片段
中没有变异, trnG鄄trnT(t)片段的碱基变异最多;
单枝竹属在 ndhK、 rbcL鄄psaI 和 rpoC2鄄rps2 片段
中的变异为零, ndhF鄄rpl32 和 trnT鄄trnL 未测出,
trnG鄄trnT(t)中的碱基变异最多。
摇 摇 青篱竹族的叶绿体分子系统学研究表明, 该
族的大多数属不是单系, 属间和种间分子水平差
异微小, 尤其是第 V分支 (the Phyllostachys clade)
和第 VI 分支 ( the Arundinaria clade) (Zeng 等,
2010), 因此, 本研究以分支之间及其内部的变异
进行分析。 两个分支之间的差异除在 psaC鄄ndhE
为零外, 在其他片段中均有碱基和 (或) 插入 /
7476 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张玉霄等: 竹亚科叶绿体 DNA条形码筛选摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 4摇 分支内、 分支间、 属内及属间序列差异统计
Table 4摇 Summary of the differences among species, genera, and clades
片段
Molecular
marker
青篱竹族(Arundinarieae)
V* VI* V vs.VI
箣竹族(Bambuseae)
箣竹属
Bambusa
(B)
牡竹属
Dendrocalamus
(D)
单枝竹属
Bonia
(BO)
BO vs.(B+D)
ndhC鄄trnV
(UAC) 1 bp
* & 1 indel* 0 2 bps & 1 indel 0 1 indel 4 bps & 2 indels 2 bps & 1 indel
ndhF鄄rpl32 2 bps & 1 indel 0 8 bps NA* 0 NA 5 bps & 1 indel
ndhA内含子 2 bps & 1 indel 0 5 bps & 1 indel 0 1 bp 2 bps 1 bp
ndhK 2 bps 0 2 bps 0 2 bps 0 0
psaC鄄ndhE 1 bp & 4 indels 0 0 0 0 2 bps & 1 indel 1 bp
rbcL鄄psaI 1 bp 1 bp 5 bps 0 4 bps 0 2 indels
rbcL鄄psaI鄄ycf4 3 bps & 1 indel 0 5 bps & 2 indels 0 2 bps 3 bps 0
rpl32鄄trnL
(UAG) 2 bps & 1 indel 1 bp 3 bps 0 1 bp 3 bps & 1 indel 5 bps
rpoC2鄄rps2 1 bp & 1 indel 0 1 bp & 2 indels 0 1 bp 0 1 bp
rps15鄄ndhF 1 bp & 2 indels 1 bp 1 bp & 1 indel 0 1 bp & 1 indel NA NA
trnD(GUC)鄄
psbM 2 bps 0 5 bps & 2 indels 0 0 2 bps 4 bps
trnG(UCC)鄄
trnT(GGU)(g) 1 bp & 1 indel 0 3 bps 1 bp 2 bps 1 bp 4 bps & 2 indels
trnG(UCC)鄄
trnT(GGU)(t) 14 bps & 2 indels 5 bps & 1 indel 12 bps & 3 indels 0 16 bps & 2 indels 17 bps 23 bps
trnL(UAA)鄄
ndhJ 2 bps 0 4 bps NA 1 bp 1 bp & 1 indel 2 bps
trnT(UGU)鄄
trnL(UAA) 3 bps 0 2 bps 0 1 bp & 1 indel NA 0
ycf4鄄cemA 4 bps & 1 indel 1 bp 4 bps 0 2 bps 1 bp 2 bps
*V:叶绿体系统树第 V分支(the Phyllostachys clade);VI:叶绿体系统树第 VI 分支( the Arundinaria clade);bp:碱基;indel:插入 /缺失;
NA:由于序列缺失或属内仅有一条序列,无法统计属内变异
缺失的变异;第 V分支内部类群的差异大多数在
1 ~ 4 个碱基,在 trnG鄄trnT( t)中则有 14 个碱基变
异; 第 VI 分支的 3 个种之间差异较小, 仅在
rbcL鄄psaI、 rpl32鄄trnL、 rps15鄄ndhF、 trnG鄄trnT ( t)
和 ycf4鄄cemA共计 5 个片段中有变异。
3摇 讨论
3. 1摇 引物通用性
16 个 DNA片段的引物扩增成功率为 100%
或者在 90%以上, 表明引物具有较好的通用性,
但是 ndhF鄄rpl32、 trnL鄄ndhJ和 trnT鄄trnL的测序成
功率在 90%及其以下, 主要是由于靠近引物的
序列中含有 poly结构 (通常有 7 个或 10 个以上
单个碱基重复), 影响了测序, ndhF鄄rpl32 和 trnL鄄
ndhJ中的 poly 结构对箣竹族的影响较大 (分别
测得 4 个和 5 个个体), 而 trnT鄄trnL中的 poly 结
构对青篱竹族的影响较大 (3 个个体未测出)。
序列两端具有 poly 结构的其他片段 (见 2. 2),
测序并未受到影响。 ndhK 片段的扩增成功率为
100% , 但该片段在距其中一端引物 (R: TCGT鄄
GCTTATCCCAGTTG) 约 60 bp 有一长段 poly 结
构, 影响了测序, 使这一端的序列无法获得, 只
能依靠 F端引物测得的序列进行拼接。 针对 poly
结构的存在, 应优化引物设计, 尽量避开该结构
设计引物。
3. 2摇 倒位和插入 /缺失
Kim和 Lee (2005) 通过比较分析单子叶植
物和双子叶植物已发表的部分叶绿体基因组, 发
现长为 5 ~ 50 bp 的倒位序列广泛存在于叶绿体
基因组中, 这些倒位序列会影响序列的比对和研
究结果分析。 Whitlock 等 ( 2010 ) 以龙胆科
(Gentianaceae) 植物为例, 探讨了 trnH鄄psbA 片
段中的倒位序列对物种鉴定的影响, 研究表明,
如果没有正确地识别和比对倒位序列, 将会造成
847摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
对碱基变异数目的过高统计以及错误的物种关
系。 本研究中的 3 个片段 ( rbcL鄄psaI、 rbcL鄄psaI鄄
ycf4 和 rpl32鄄trnL) 有倒位序列, 如果未发现倒
位, 会增加变异位点数目 (结果未显示), 因
此, 在今后的研究中, 对这些片段的比对应谨
慎, 以免造成错误的结果。
目前, 大多数 DNA 条形码研究中并没有把
插入 /缺失看作信息位点, 而是作为 “ missing
data冶 处理。 Liu 等 (2012) 以红豆杉属 (Tax鄄
us) 为例, 研究了插入 /缺失的编码对 DNA条形
码物种鉴别率的影响, 提出在属及其以下分类阶
元水平的 DNA 条形码研究中应将插入 /缺失编
码, 作为信息位点处理。 本研究中所选取的 16
个片段, 除基因片段 ndhK 没有插入 /缺失外,
其他片段中均有插入 /缺失。 竹亚科已开展的分
子系统学研究表明, 青篱竹族和箣竹族各属内部
种间分子变异较小 ( Yang 等, 2010; Zeng 等,
2010; Tyrrell 等, 2012; Goh 等, 2013), 在叶绿
体片段碱基变异较少的情况下, 为了提高分子水
平的物种鉴别率, 有必要将插入 /缺失编码作为
信息位点。
3. 3摇 备选分子片段作为 DNA 条形码的潜质评
价及其系统学意义
DNA条形码通常需要满足以下三个标准:
(1) 在物种水平具有显著的遗传变异和分化,
能够鉴别不同物种; (2) 合适的长度, 以便于
DNA提取和扩增, 序列拼接及排序时不需要手
动调整; (3) 目的片段两端具有保守位点, 可
用于通用引物设计 (Kress等, 2005; CBOL Plant
Working Group, 2009)。 本研究所选取的 16 个片
段根据已发表的竹亚科叶绿体全基因组筛选, 在
物种间均具有一定的遗传变异和分化, 引物在片
段扩增中具有较高的通用性, 16 个片段的长度
范围为 308 bp ~ 1 210 bp, 均在使用 Sanger 测序
法单端或双端引物能够测得的范围, 符合作为
DNA条形码的基本要求。 最短的 rpoC2鄄rps2 片段
虽然引物通用性很好, 但其所包含的变异位点较
少, 因此, 不推荐作为竹亚科的 DNA 条形码;
最长的 trnG鄄trnT(t)片段, 扩增成功率为 100% ,
测序成功率在 90%以上, 含有的变异位点最多,
可以作为竹亚科有效 DNA 条形码的优先选择片
段; 对于其他片段而言, 可以根据不同类群以及
变异位点和信息位点数目进行选择, 作为竹亚科
的备选 DNA条形码。
上述片段只有两个 ( rpl32鄄trnL 和 trnT鄄trnL)
用于竹亚科分子系统学研究 (BPG, 2012), 根
据变异位点和信息位点的数目, 也可以将其他片
段用于竹亚科分子系统学研究 (表 4)。 短穗竹
不同产地的个体在 16 个片段中均没有变异, 表
明该种不同居群的进化具有保守性, 而该种与其
他近缘种也几乎没有差异, 说明使用叶绿体片段
解决竹亚科近缘类群的关系存在一定局限性。
另外, 从表 3 和表 4 的结果可以看出, trnG鄄
trnT(t)片段在青篱竹族和箣竹族代表类群中的
进化速率最快, 而其他片段的进化速率在两个族
中则不尽相同。 由于本研究的着眼点以分类阶元
较低和亲缘关系更近的族和属为主, 取样侧重于
青篱竹族叶绿体系统树中的第 V 分支和箣竹族
中的 BDG复合群, 如果扩大类群, 不同片段进
化速率的快慢排序或许会有所变化。 总体来看,
trnG鄄trnT(t)片段的进化速率要远远高于其他分
子片段, 因此, 建议在开展竹亚科 DNA 条形码
和分子系统学研究时, 可以按照 “ trnG鄄trnT(t) +
X冶 的方式选择分子片段, 从而有效地提高 DNA
条形码的物种鉴别率和分子系统树的分辨率。
致谢摇 感谢中国科学院昆明植物研究所王雪芹博士和张
宪智先生提供部分实验材料。
也参摇 考摇 文摇 献页
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