全 文 ：拟南芥 WRKY68 转录调控因子的表达谱分析
王学兰1, 林良斌1, 余迪求2*
(1 云南农业大学农学与生物技术学院, 云南 昆明摇 650201; 2 中国科学院西双版纳热带植物园, 云南 昆明摇 650223)
摘要: WRKY基因家族是主要存在于植物中的转录因子, 拟南芥中至少有 74 个成员。 根据锌指结构特征
和 WRKY结构域的数目, 可以将 WRKY转录因子分为三大类。 拟南芥 WRKY68 属于第域类 WRKY 蛋白。
通过 GUS染色和 qRT鄄PCR分析各组织部位的表达情况, 发现 WRKY68 在根中的表达量是最高的, 其次是
幼嫩的叶片和老的荚果中。 各种处理条件下的表达水平显示, IAA和高温处理后, WRKY68 的表达明显上
调, PstDC3000、 JA、 SA、 NAA轻微诱导 WRKY68 的表达, 而 Botrytis、 NaCl、 甘露醇、 PEG、 脱水、 ACC、
ABA抑制 WRKY68 的表达, 根据以上实验结果, 我们推测 WRKY68 可能参与生长素和温度调控的植物形态
建成及发育过程。
关键词: AtWRKY68 转录因子; GUS染色; 生物逆境; 非生物逆境; 植物激素
中图分类号: Q 75摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)01-041-07
Expression Profiles of Arabidopsis WRKY68 Transcription Factor
WANG Xue鄄Lan1, LIN Liang鄄Bin1, YU Di鄄Qiu2*
(1 College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
2 Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China)
Abstract: The transcription factors WRKY protein superfamily are mainly presented in plants, which contains at least
74 members in Arabidopsis. It can be classified into three groups according to the number of WRKY domains and the
features of their zinc鄄finger鄄like motif. Arabidopsis WRKY68 is one of the group域WRKY proteins. GUS staining and
qRT鄄PCR analysis showed that the expression of WRKY68 in roots was the highest in all tissues and the second was in
old siliques and young leaves. The expression profiles indicated that the expression levels of WRKY68 were elevated by
IAA and heat treatments, and slightly induced by PstDC3000, JA, SA, NAA while which were inhibited by other
treatments including Botrytis, NaCl, mannitol, PEG, dehydration, ACC, ABA. These results suggested that WRKY68
might be involved in plant morphogenesis and development which is regulated by auxin and temperature.
Key words: AtWRKY68; GUS staining; Biotic stress; Abiotic stress; Plant hormones
摇 转录调控因子 WRKY 基因家族是主要存在
于植物中的超级基因家族, 在其蛋白质 N鄄端含
有高度保守的氨基酸序列 WRKYGQK 和 CX4-5
CXnHXH (X为任一氨基酸) (Eulgem 等, 2000;
Yu等, 2001), 并通过结合靶基因启动子区域 W
盒 (C / T) TGAC (C / T) 核苷酸序列而调控相应
基因的表达, 发挥其分子生物学功能 (Yang 等,
1999; 余迪求等, 2006)。 现有的研究表明, WRKY
基因不仅参与植物生理代谢和形态建成, 还参与
植物的逆境反应。 WRKY 基因参与众多代谢过
程, 如 AtWRKY4 和 AtWRKY34 参与糖代谢信号
途径 (Hammargren 等, 2008); AtWRKY44 参与
调控拟南芥种皮单宁酸的合成 ( Johnson 等,
2002)。 WRKY基因家族对植物的形态建成有调
控作用, AtWRKY44 对表皮毛状体的形态建成和
根毛细胞的分化有作用 (Johnson 等, 2002; Ishi鄄
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (1): 41 ~ 47
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201312046
* 通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: ydq@ xtbg. ac. cn
收稿日期: 2012-04-04, 2012-05-25 接受发表
作者简介: 王学兰 (1984-) 女, 在读硕士研究生, 主要从事植物分子生物学研究。
da 等, 2007); 抑制拟南芥 WRKY75 的表达有利
于不定根和根毛的生长 (Devaiah 等, 2007); 拟
南芥WRKY10能调控种子的大小 (Luo等, 2005)。
WRKY基因还调控植物的非生物和生物逆境。 植
物的非生物逆境包括干旱、 高温、 冷害、 缺素、
盐害、 伤害等。 本实验室从低温 (4 益) 诱导的
水稻叶片 cDNA 文库中克隆获得了 13 个 WRKY
基因, 其中 10 个 WRKY 基因的表达受到 NaCl、
PEG、 低温 (4 益) 和高温 (42 益) 等非生物
逆境因子的影响 ( Qiu 等, 2004)。 实验表明
WRKY6 的表达受低 Pi 诱导 ( Chen 等, 2009)。
本实验室的研究结果显示 AtWRKY34 调控成熟花
粉粒对冷的响应 (Zou 等, 2010)。 AtWRKY22 参
与调控黑暗诱导的叶片衰老 (Zhou 等, 2011)。
AtWRKY2 参与调控渗透胁迫反应 ( Jiang 和 Yu,
2009)。 AtWRKY25、 AtWRKY26、 AtWRKY33 ( Li
等, 2011)、 AtWRKY39 (Li 等, 2010) 参与与植
物对热诱导的响应。 高表达 AtWRKY25、 At鄄
WRKY33 拟南芥植株具有耐盐性, 同时也表现出
对 ABA更为敏感 (Jiang和 Deyholos, 2009)。 有
很多 WRKY基因参与调控植物的生物逆境, 如参
与植物的抗病反应等。 对 72 个拟南芥 WRKY 基
因的表达谱进行分析, 发现其中有 49 个基因受
SA 或无毒假单胞杆菌 (PstDC3000) 的诱导
(Dong等, 2003)。 WRKY33 在植物病原菌抗性中
有很重要的作用 ( Zheng 等, 2006; Lai 等,
2011)。 AtWRKY52 的突变造成对含菌土壤的高
度敏感, 暗示其参与了天然免疫过程 (Noutoshi
等, 2005)。 WRKY8 与拟南芥的基础抗性有关
(Chen等, 2010)。 AtWRKY46 与 AtWRKY70 及 At鄄
WRKY53 协同作用调控拟南芥对病原菌的基础抗
性 (Hu等, 2012)。 此外, 还有研究表明, WRKY
还可以调控植物的衰老, 如 AtWRKY6 和 At鄄
WRKY53 调控植物衰老相关基因 SIRK (Robatzek
和 Somssich, 2002; Miao 和 Zentgraf, 2007; Zent鄄
graf等, 2010)。 综上所述, WRKY 基因在植物的
整个生命活动过程中起着非常重要的作用。
研究显示 WRKY68、 WRKY23 和 WRKY50 的
氨基酸序列的相似性程度高 (Dong 等, 2003)。
研究表明 WRKY23 的表达受 NAA 的诱导, 对线
虫的取食位点有影响, 敲除 WRKY23 的植物导致
线虫的低感染 (Grunewald等, 2008)。 但是, 到
目前为止, WRKY68 基因功能方面的研究尚未有
报道。 我们利用定量 RT鄄PCR, GUS 染色等技术
分析 WRKY68 基因的表达情况, 以初步探究
WRKY68 的功能。 实验结果表明, WRKY68 受
IAA和高温诱导, 可能与生长素和温度调控的植
物形态建成及发育等有关。
1摇 材料和方法
1. 1摇 实验材料
选用哥伦比亚生态型拟南芥 ( Arabidopsis thaliana
Col. ) 为实验材料。 拟南芥种子表面用漂白水灭菌后均
匀散布在 MS培养基上 (含 0. 85%的卡拉胶), 4 益春化
3 d后放在 22 益温室中培养 7 d 然后移栽到混合土里。
生长条件为相对湿度 55% , 短光照 (光照时间 8 颐 00-
18 颐 00) 条件下生长。 用于各种处理表达分析的野生型
材料的苗龄为 4 ~ 5 周, 处理后将取得的材料存放于
-80 益冷冻保存。 用于组织部位表达分析的材料从同一
批野生型材料中获得。
1. 2摇 质粒构建与农杆菌转化
通过 PCR从野生型拟南芥 (WT) 基因组扩增获得
WRKY68 的启动子序列。 将 WRKY68 启动子序列插入到质
粒 pJS131B中 GUS报告基因表达框之前, 经测序正确后进
一步克隆到表达载体 pOCA28 上, 记为 pWRKY68 颐 颐 GUS。
将构建好的重组质粒转化到农杆菌 GV3101 中, 使用花
序浸染法转化野生型植株 (Clough和 Bent, 1998)。 将收
到的种子播于 1 / 2MS 板上 (含 50 ug·ml-1 Kanamycin),
绿色苗即为转基因植株。
1. 3摇 GUS染色
参照本实验室的操作手册进行 GUS染色。 用预冷的
90%丙酮于冰上固定材料 20 min, 用 GUS Staining solu鄄
tion (without X鄄Gluc) 漂洗固定后的材料 3 次 (在冰上进
行), 然后放入 GUS Staining solution (with X鄄Gluc) 中,
并于冰上避光抽真空 10 min, 最后于 37 益下放置过夜。
用 70%酒精脱色后拍照。
1. 4摇 定量 RT鄄PCR
从 4 ~5 周苗龄的野生型拟南芥获得了根、 茎、 叶、
花和荚果及各种处理材料, 用 TRIZOL试剂盒及水饱和酚
法提取总 RNA, 并进行 DNase玉消化, 用来进行定量 RT鄄
PCR实验。 定量 RT鄄PCR的引物为 WRKY68 (AT3G62340):
5忆鄄ATTCATCACGAGGAGTGAGGTT鄄3忆 和 5忆鄄CAAGTTGTT鄄
GTGCAACGGTAAT鄄3忆; ACT2 (AT3G18780): 5忆鄄TGTGC鄄
CAATCTACGAGGGTTT鄄3忆 和 5忆鄄TTTCCCGCTCTGCTGTT鄄
GT鄄3忆。 定量 PCR 的反应体系 (20 滋L): 10 滋L SYBR
Green I反应混合物, 8. 2 滋L ddH2O, 每条引物各 0. 4
滋mol·L-1和 1 滋L cDNA。 退火温度为 50 益, 在 Roche
24摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
LightCycler real鄄time PCR 仪上进行了定量 PCR 实验。 整
个定量 PCR实验用不同的 RNA样品重复 3 次。
2摇 结果与分析
2. 1摇 AtWRKY68 基因在不同组织器官中的表达
分析
为了明确 WRKY68 在各组织部位的表达量,
我们用野生型拟南芥的根、 茎、 莲座叶、 茎生
叶、 花序、 荚果进行实验。 提取 RNA后反转录,
用定量 RT鄄PCR方法检测 WRKY68 在不同组织器
官中的表达。 实验结果显示 WRKY68 在根、 茎、
叶、 花、 荚果中都有表达, 相对来说, 在根中的
表达量最高, 达到 132. 6, 其次是老的荚果中,
在花中的表达量最低, 仅有 0. 0364 (图 1)。
图 1摇 WRKY68 在不同组织器官中的表达分析
Fig. 1摇 Expression analysis of WRKY68 in different organ and tissue
rl, rosette leaves; st, stem; rt, root; cl, cauline leaf;
f, flowers; ys, young siliques; os, old siliques
2. 2摇 生物逆境条件下 AtWRKY68 的表达分析
大量研究工作证实大多数 WRKY 蛋白主要
参与了植物从基础免疫到获得性抗性的多种抗病
反应之中, 通过调控多通路多层次的抗病信号转
导途径影响植物对病原物的生理反应, 在植物与
病毒、 细菌、 真菌、 线虫以及昆虫的相互作用过
程中发挥重要作用 (Eulgem, 2005)。 当植物受
病原菌侵染时, 植物体内会发生一系列的生理生
化变化产生抵抗病原菌的防御机制。 为了探究
WRKY68 对生物逆境的响应情况, 我们用真菌
Botrytis 和无毒假单胞菌 PstDC3000 处理野生型
拟南芥。 具体操作是用浓度为 2. 5 伊105 spores /
mL的孢子悬浮液喷施 4 周大的拟南芥野生型植
株, 并高度保湿, 然后分别于 6、 12、 24、 36、
48、 72 h后收集材料, 经提取 RNA 反转录后用
定量 RT鄄PCR分析; 用悬浮于 10 mmol·L-1 MgCl2
的 OD600 =0. 0001 的 PstDC3000 溶液注射 4 周大
的拟南芥植株, 注射 6、 12、 24、 48、 72 h后收集
注射叶片, 提取 RNA反转录后用于定量 RT鄄PCR
分析。 结果显示 (图 2 ): WRKY68 的表达被
Botrytis强烈抑制 (约 50 倍) 而受 PstDC3000 的
轻微诱导 (约 2. 7 倍), 这说明 WRKY68 有可能
在对 Botrytis和 PstDC3000 抗性中发挥作用。
2. 3摇 AtWRKY68在非生物逆境条件下的表达分析
为了确定 WRKY68 在非生物逆境过程中是否
起作用, 我们分别用 42 益、 NaCl (0. 1 mol·L-1)、
甘露醇 (15% )、 聚乙二醇 (25% )、 脱水 (将
拟南芥植株剪取后放入置于室温干燥的培养皿)
处理野生型拟南芥植株, 按照时间点取材后提取
RNA。 定量 RT鄄PCR 结果显示 (图 3): WRKY68
的表达受高温的强烈诱导, 大约诱导 100 倍。 而
NaCl、 甘露醇 (mannitol)、 聚乙二醇 (PEG)、 脱
水 (dehydration) 都抑制 WRKY68 的表达。 NaCl、
图 2摇 WRKY68 在生物逆境条件下的表达分析
Fig. 2摇 Expression analysis of WRKY68 by biotic stress treatments
341 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王学兰等: 拟南芥 WRKY68 转录调控因子的表达谱分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 3摇 WRKY68 在非生物逆境条件下的表达分析
Fig. 3摇 Expression analysis of WRKY68 by abiotic stress treatments
甘露醇 (mannitol)、 聚乙二醇 ( PEG) 都能引
起渗透胁迫, 我们的实验结果说明 WRKY68 可能
参与高温胁迫, 而不参与盐害、 干旱、 渗透胁迫
等非生物胁迫。
2. 4摇 植物激素处理条件下 WRKY68 的表达分析
植物激素在植物的正常生长和发育及应对胁
迫的过程中起着很重要的作用。 现有的研究表明
JA、 SA、 ET参与植物抗病性, ABA 与种子的萌
发和渗透胁迫有关, ACC 与氧化胁迫相关, 而
NAA和 IAA参与植物发育方面的很多过程。 我们
分别用MeJA (0. 1 mmol·L-1), ACC (0. 1 mmol·
L-1), ABA (0. 1 mmol·L-1), SA (2 mmol·L-1),
IAA (0. 1 mmol·L-1) 和 NAA (0. 1 mmol·L-1 )
喷洒野生型拟南芥材料并分别于处理后 6、 12、
24、 48、 72 h 收集材料。 提取 RNA 反转录后定
量 RT鄄PCR分析显示 (图 4), WRKY68 的表达受
IAA明显诱导 (约 6 倍), NAA、 JA、 SA 的轻微
诱导, ACC 和 ABA 的明显抑制, 说明 WRKY68
可能参与生长素调控的植物形态建成和发育等。
图 4摇 激素处理后 WRKY68 的表达分析
Fig. 4摇 Expression analysis of WRKY68 by hormones treatments
2. 5摇 pWRKY68 颐 颐 GUS 转基因植物中 GUS 表达
情况
通过基因克隆和遗传操作技术获得了 pWRKY68
颐 颐 GUS融合基因表达载体。 通过农杆菌介导法,
并用 1 / 2MS鄄Kan 板筛选获得含有 pWRKY68 颐 颐
GUS融合表达载体的转基因植株, 经过繁殖, 再
次筛选获得 T2 代纯合转基因植株, 用于后续实
验。 我们用获得的转基因植株的幼苗 (14 天左
右的苗岭) 和开花期苗进行 GUS 染色分析, 结
果显示: WRKY68 启动子驱动的 GUS 仅在根、
幼苗的嫩叶片中有表达 (图 5: A), 而在花序、
荚果, 老叶片中看不到 GUS 染色。 这些结果与
我们的定量 RT鄄PCR结果一致。
根据我们的实验结果 WRKY68 受 IAA 的诱
导, 于是我们就用天然生长素 IAA (0. 1 mmol·
L-1) 溶液分别处理了 pWRKY68 颐 颐 GUS 转基因植
株幼苗和开花期苗, 并于处理 12 h 后进行 GUS
染色分析。 结果显示 IAA 处理幼苗后, 未处理
前看不到 GUS 染色的荚果和叶片能看到明显染
色 (图 5: C, D), 并且与未处理的 GUS 染色相
比 WRKY68 在根和幼苗的嫩叶中表达增强 (图
5: B), 尤其在根尖的表达很强。 我们发现 IAA
处理后 WRKY68 在荚果的基部和叶脉及叶柄处都
有表达, 而花序经 IAA 处理后还是没有观察到
GUS染色。 以上结果再次证实 WRKY68 受 IAA
的诱导, 实验现象与我们的定量 RT鄄PCR 结果一
致。 有研究表明与 WRKY68 亲缘关系最近的
WRKY23 受 NAA 的诱导并与生长素的极性运输
有关 (Grunewald 等, 2012) 我们推测 WRKY68
或许也有这方面的功能。
44摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
图 5摇 pWRKY68 颐 颐 GUS转基因植株的 GUS染色情况
A. 16 天大的幼苗; B. 12 天大的幼苗; C. 果荚; D. 茎生叶
Fig. 5摇 GUS staining of pWRKY68 颐 颐 GUS transgenic plants
A. 16 d鄄old seedling; B. 12 d鄄old seedling; C. siliques; D. cauline leaves
3摇 讨论
AtWRKY68 作为第域类 WRKY 蛋白, 目前
其基因功能的研究没有相关报道。 本研究采用定
量 RT鄄PCR检测了 WRKY68 在不同组织器官中的
表达, 结果显示 WRKY68 在根、 茎、 叶、 花、 果
荚中都有表达, 但在根中的表达量较高, 叶和果
荚中的表达次之, 在花中的表达量最少, 而且在
老的果荚中的表达量比幼嫩的果荚中高。 GUS
染色分析显示 WRKY68 在根和幼嫩的叶中有表
达, 与定量 RT鄄PCR的结果一致。
植物的生长时刻面临着生物和非生物逆境,
植物激素对植物的正常生长起着很重要的作用,
当植物处于逆境时, 植物体内的激素可能会发生
变化, 从而通过影响植物的生理生化活动来产生
抵御胁迫的能力。 为了研究 WRKY68 的诱导表达
情况, 我们分析了 WRKY68 在不同处理条件下的
表达情况。 我们以拟南芥莲座叶为处理材料, 首
先分析了 WRKY68 基因对生物逆境 PstDC3000 和
Botrytis的响应, WRKY68 受 PstDC3000 轻微诱导
而受 Botrytis 的强烈抑制。 非生物逆境和激素
(NaCl、 高温、 甘露醇、 PEG、 聚乙二醇、 脱水、
IAA、 MeJA、 SA、 ABA、 NAA、 ACC) 处理条件
下的结果显示 WRKY68 的表达受 IAA 和高温的
明显诱导, 受 MeJA、 SA、 NAA的轻微诱导和其
它因素的抑制。 另外, 我们还分析了 IAA 处理
后 pWRKY68 颐 颐 GUS 的染色情况, 结果与我们的
定量 RT鄄PCR 一致, 说明 WRKY68 的表达受 IAA
诱导。
541 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王学兰等: 拟南芥 WRKY68 转录调控因子的表达谱分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
生长素 ( Auxin) 是最早被发现的植物激
素, 在植物的生长和发育过程中发挥着重要的作
用。 生长素影响植物细胞的分裂、 分化及伸长,
植物向光性和向地性反应, 下胚轴和主、 侧根的
发育, 维管组织的发育和根毛的形成, 以及花和
叶片的发育等, 对植物早期的发育和形态建成都
具有重要意义。 生长素的极性运输、 稳态调控和
信号转导影响叶片发育的过程。 如生长素的相关
基因 PIN1、 IAA18、 YUCCA等都能调控叶片的发
育。 外源生长素对暗培养条件下植物下胚轴的伸
长无影响, 但是在光照条件下, 生长素的合成引
起下胚轴长度的增加。 PINOID 正调节拟南芥根
毛细胞的生长素外运, 根毛细胞过量表达 PID
抑制根毛生长 (Lee和 Cho, 2006)。 大量的研究
表明生长素调控侧根的起始和伸长。 生长素相关
突变体 axr1、 axr4 及 iaa28鄄1 的侧根数量明显减
少 (Rogg等, 2001)。 pin1 突变体在其整个发育
过程中都表现出多向性的缺失, 且通常不会开
花, 表明生长素对花原基的形成起到了重要作
用。 pin1 基因编码跨膜转运蛋白, 并参与了生长
素的极性运输 (Wis忆niewska等, 2006)。
许多植物在生殖发育时期对温度都非常敏
感, 易受高温的影响。 很多实验表明温度影响生
长素的合成和代谢, 在高温逆境条件下, 植物体
内的生长素含量会有不同程度的变化。 水稻灌浆
期遭受高温逆境时, 生长素等激素的含量降低而
导致结实率下降, 这也是我国粮食减产的原因之
一。 研究表明高温抑制大麦 (Barley) 和拟南芥
花药发育过程中生长素合成基因 YUCCA的表达,
从而抑制了线粒体和叶绿体中 DNA的复制 (Os鄄
hino等, 2011)。 还有研究表明向日葵热激效应
因子 HaHSFA9 是 Aux / IAA 蛋白阻遏子 HaIAA27
的靶基因, HaHSFA9 与种子的寿命和胚胎的脱
水耐性有关系, 研究发现这些进程有可能是生长
素参与调节的 (Carranco 等, 2010)。 最近的研
究表明: 与 WRKY68 亲缘关系最近的 WRKY23 与
拟南芥根发育过程中生长素的分布有关, WRKY23
在根尖中表达, 而且其表达水平与生长素的浓度
有密切的关系 (Grunewald等, 2012)。
我们的实验数据表明 WRKY68 受激素 IAA
和高温的诱导, 结合 WRKY68 在根中、 幼嫩的叶
片和老的荚果中的表达量相对较高, 我们推测
WRKY68 可能参与温度和生长素调控的植物形态
的建成和发育, 有关分子机制方面需进一步深入
研究。
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