全 文 ：蒟蒻薯属 (薯蓣科) 植物 DNA条形码研究*
赵月梅1,2, 张摇 玲1**
(1 中国科学院西双版纳热带植物园, 云南 勐腊摇 666303; 2 中国科学院研究生院, 北京摇 100049)
摘要: 蒟蒻薯属 (Tacca) 植物种间在形态上差别不大, 导致分类上存在一定的困难。 DNA 条形码是一种
利用短的 DNA标准片段来鉴别和发现物种的方法。 本研究利用核基因 ITS 片段和叶绿体基因 trnH鄄psbA,
rbcL, matK片段对蒟蒻薯属 6 个种的 DNA 条形码进行研究, 对 4 个 DNA 片段可用性, 种内种间变异,
barcode gap进行了分析, 采用 Tree鄄based和 BBA 两种方法比较不同序列的鉴定能力。 结果显示: 单片段
ITS正确鉴定率最高, 片段组合 rbcL+matK正确鉴定率最高。 支持 CBOL植物工作组推荐的条码组合 rbcL+
matK可作为蒟蒻薯属物种鉴定的标准条码, 建议 ITS片段作为候选条码。 丝须蒟蒻薯 Tacca integrifolia 采
自西藏的居群与马来西亚居群形成了 2 个不同的遗传分支, 且两者在形态上也存在一定的差异, 很可能是
一个新种。
关键词: 蒟蒻薯属; DNA条形码; ITS; matK; rbcL; trnH鄄psbA
中图分类号: Q 75, Q 949摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)06-674-09
Using DNA Barcoding in Genus Tacca (Dioscoreaceae)
ZHAO Yue鄄Mei1,2, ZHANG Ling1**
(1 Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Mengla 666303, China;
2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: Tacca (Dioscoreaceae) is a small genus which is taxonomically difficult because of a lack of obvious
morphologically differences among species. DNA barcoding is a new method of rapid species identification and dis鄄
covery using short, standardized genes or DNA regions. In this study, four candidate DNA barcoding regions that
three ( rbcL, matK, trnH鄄psbA) from chloroplast genome and one (ITS) from the nuclear genome, were evaluated
among 36 accessions representing 6 species of Tacca. The capability of those regions were evaluated by intra鄄 and in鄄
ter鄄specific divergence and barcode gap analyses, and the identification efficiency was assessed using Tree鄄based and
BBA methods. The results indicated that both ITS and the core barcode rbcL+matK proposed by CBOL exhibited the
highest resolution as a single and combined data respectively. Based on overall performance: matK+ rbcL can be
considered as a potential barcode for identifying the species of Tacca, ITS can be used as a supplementary barcode.
DNA barcoding revealed two distinct lineages of T. integrifolia distributed allopatrically in Tibet and Malaysia. And
these two lineages with morphological variations may potentially represent new species.
Key words: Tacca; DNA barcoding; ITS; matK; rbcL; trnH鄄psbA
摇 蒟蒻薯属 (Tacca) 属于薯蓣科 (Dioscoreac鄄
eae), 全世界约有 10 种, 中国有 6 种 (Drenth,
1972; 张玲, 2006)。 该属皆为草本, 属泛热带
分布型, 分布于印度鄄马来地区及中南半岛, 向
南延至印度尼西亚诸岛, 向北延至我国西南、 华
南地区, 个别种分布到澳洲、 非洲 (T. leontope鄄
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (6): 674 ~ 682
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 11060
*
**
基金项目: 中国科学院知识创新工程重要方向项目 (KSCX2鄄YW鄄Z鄄0904) 和中国科学院大科学装置工程项目 (2009鄄LSF鄄GBOWS鄄01)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: zhangl@ xtbg. org. cn
收稿日期: 2011-04-11, 2011-07-05 接受发表
作者简介: 赵月梅 (1982-) 女, 在读研究生, 主要从事植物群体遗传学研究。 E鄄mail: yezi19820320@ yahoo. com. cn
taloides), 或特产于南美热带 (T. parkeri) (Drenth,
1972)。 蒟蒻薯属植物花的形态奇特, 大苞片包
围着聚伞状的伞形花序, 并有许多长须状的小苞
片, 这些特征使得它们在花卉园艺贸易中广受青
睐。 蒟蒻薯属植物根茎入药, 性凉味苦, 能清热
解毒, 消炎止痛, 主治胃及十二指肠溃疡、 高血
压、 肝炎、 胃痛、 烫伤烧伤、 疮疡等, 具有潜在
的药用价值 (贾敏如和李星炜, 2005)。 由于蒟
蒻薯属植物潜在的药用价值及生境破碎化、 片段
化, 使得该类植物居群数量日渐缩小, 许多种已
近濒危, 大都被列为稀有保护植物 (傅立国和
金鉴明, 1992)。
蒟蒻薯属植物的系统学位置和分类标准一直
争议很大 (Drenth, 1972; Grierson和 Green, 1996;
凌萍萍, 1985), 直到 2003 年 APG II分类系统将
本属置于薯蓣科中才确定了其系统位置 (APG
II, 2003)。 由于该属植物分布范围广, 不同地
区形态上有很大差异, 经常造成该属分类学上的
混乱。 另外, 如老虎须 (T. chantrieri), 扇苞蒟
蒻薯 (T. subflabellata) 和实果蒟蒻薯 (T. ampli鄄
placenta) 等在营养体阶段也很难区分, 因此果
实、 气孔、 染色体等曾一度作为标准进行分类
(凌萍萍, 1985)。 鉴于形态鉴定在分类上的局限
性 ( Knowlton, 1993; Jarman 和 Elliott, 2000 ),
目前迫切需要一种既快速又能弥补形态鉴定的缺
陷的方法。
2002 年, Tautz等 (2002) 首先提出将 DNA
序列用于分类学研究, 即利用一段标准的 DNA
序列作为标记来实现对物种的快速准确的鉴定,
随后, Hebert 等 (2003) 正式提出了 DNA 条形
码的概念, 并利用线粒体的 COI 基因序列对动
物界的条形码分类进行了研究。 由于植物线粒体
进化速度慢和核基因的多拷贝等原因, 植物的
DNA条形码多从叶绿体基因组中选择 ( Chase
等, 2005; Cowan等, 2006)。 植物条形码片段的
筛选受到各种因素的制约, 例如引物通用性, 扩
增和测序的难易以及某片段在特定植物中可能存
在缺失等, 不同的学者提出了不同的片段组合
(Chase等, 2007; Kress 和 Erickson, 2007; Lahaye
等, 2008), 如 ITS+ trnH鄄psbA (Kress 等, 2005),
matK+atpF鄄atpH+ psbK鄄psbI 和 matK + atpF鄄atpH +
trnH鄄psbA 两个组合 (Kim unpublished, 2007)。
CBOL植物工作组 (2009) 提出了 rbcL+matK 片
段组合作为陆地植物的核心条形码。
本研究以蒟蒻薯属的 6 个种的 36 个个体为
材料, 对四个 DNA条形码片段 ITS、 matK、 rbcL
和 trnH鄄psbA的效用进行评价, 并尝试筛选出适
用于该属植物物种鉴定的的 DNA 条形码片段或
片段组合, 为该属植物的数字化鉴定及物种保护
提供参考依据。
1摇 材料与方法
1. 1摇 研究材料
本研究选取了蒟蒻薯属 6 个种的 36 个个体为材料,
每个种包括了 2 ~ 8 个个体, 材料信息见表 1。 实验材料
均为野外采集后经硅胶快速干燥的叶片以备 DNA 的提
取。 凭证标本分别存放于中国科学院西双版纳热带植物
园标本馆 (HITBC), 中国科学院昆明植物研究所标本
馆 (KUN) 和美国国家标本馆 (NMNH)。
1. 2摇 研究方法
DNA提取采用 CTAB 法提取全基因组 DNA (Doyle
和 Doyle, 1987), 将 DNA 溶于 TE 溶液中, 终浓度大约
为 50 ng·uL-1。 PCR 扩增反应在 PERKIN ELMER (PE)
9700 型 PCR 仪上进行。 本研究中各 DNA 片段使用的
PCR扩增和测序引物相同 (表 2)。 matK、 trnH鄄psbA 和
rbcL三个叶绿体片段扩增反应程序均采用: 97益预变性
3 min, 94益变性 1 min, 52益退火 1 min, 72益 延伸 1
min, 32 个循环后, 72益延伸 10 min; ITS片段扩增反应
程序采用: 97益预变性 3 min, 95益变性 2 min, 54益退
火 1. 5 min, 72益延伸 1 min。 32 个循环后, 72益延伸 7
min。 扩增反应采用 20 滋L 的反应体系: 包括 30 ~ 60 ng
的模板 DNA, 2 滋L 10伊buffer, 0. 5 单位的 Taq DNA聚合
酶 (5 U·滋L-1), 1. 5 滋L的 MgCl2 (25 mmol·L-1 ), 1. 5
滋L的 dNTPs (10 mmol·L-1 ), 正反向引物各 2 滋L (5
滋mol·L-1), 再添加蒸馏水至 20 滋L。 扩增得到的 PCR
产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后, 用上海生物工程技
术服务有限公司的纯化试剂盒纯化并测序。 为保证序列
的准确性, 所有片段均采用双向测序。
由于裂叶蒟蒻薯的 ITS 片段使用引物 ITS4 / ITS5 时
PCR扩增失败, 所以我们也使用了 ITS1 替代 ITS5 用于
PCR扩增 (表 2)。
1. 3摇 数据分析
用 Contigexpress (version 10. 1, Invitrogen) 进行序列
的拼接, 拼接好的序列用 Clustal X2. 0 (Larkin等, 2007)
进行序列的比对并进行人工校正。 将 4 个片段的 DNA数
据进行单独及联合构建矩阵, 联合矩阵中去除序列不足
的个体。
5766 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵月梅和张玲: 蒟蒻薯属 (薯蓣科) 植物 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 1摇 采样信息表
Table 1摇 Samples for testing potential barcodes
Taxa Locality Voucher Code Taxa Locality Voucher Code
水田七 Tacca plantaginea 实果蒟蒻薯 T. ampliplacenta
1 广西桂林 Guilin Guangxi XTBGZL001 T. plantaginea 001 1 云南盈江 Yingjiang Yunnan XTBGZL039 T. ampliplacenta 039
2 广西桂林 Guilin Guangxi XTBGZL002 T. plantaginea 002 2 云南盈江 Yingjiang Yunnan XTBGZL040 T. ampliplacenta 040
3 广西全州 Quanzhou Guangxi XTBGZL005 T. plantaginea 005 3 云南芒市 Mangshi Yunnan XTBGZL043 T. ampliplacenta 043
4 广西全州 Quanzhou Guangxi XTBGZL006 T. plantaginea 006 4 云南潞西 Luxi Yunnan XTBGZL044 T. ampliplacenta 044
5 贵州荔波 Libo Guizhou XTBGZL009 T. plantaginea 009 老虎须 T. chantrieri
6 贵州荔波 Libo Guizhou XTBGZL010 T. plantaginea 010 1 云南盈江 Yingjiang Yunnan XTBGZL037 T. chantrieri 037
裂叶蒟蒻薯 T. leontopetaloides 2 云南盈江 Yingjiang Yunnan XTBGZL040 T. chantrieri 040
1 云南勐腊 Mengla Yunnan XTBGZL003 T. leontopetaloides 003 3 广西宣州 Xuanzhou Guangxi XTBGZL048 T. chantrieri 048
2 云南勐腊 Mengla Yunnan XTBGZL004 T. leontopetaloides 004 4 云南普洱 Pu爷er Yunnan XTBGZL049 T. chantrieri 049
3 泰国清迈 Chiang mai Thailand XTBGZL015 T. leontopetaloides 015 5 云南勐腊 Mengla Yunnan XTBGZL050 T. chantrieri 050
4 泰国清迈 Chiang mai Thailand XTBGZL016 T. leontopetaloides 016 6 云南勐腊 Mengla Yunnan XTBGZL051 T. chantrieri 051
5 马达加斯加 Madagascar XTBGZL017 T. leontopetaloides 017 7 云南马关 Maguan Yunnan XTBGZL052 T. chantrieri 052
6 马达加斯加 Madagascar XTBGZL018 T. leontopetaloides 018 8 云南马关 Maguan Yunnan XTBGZL053 T. chantrieri 053
7 美国夏威夷 Hawaii USA XTBGZL020 T. leontopetaloides 020 丝须蒟蒻薯 T. integrifolia
8 美国夏威夷 Hawaii USA XTBGZL021 T. leontopetaloides 021 1 马来西亚芙蓉市 Seremban Malaysia XTBGZL022 T. integrifolia 022
扇苞蒟蒻薯 T. subflabellata 2 马来西亚芙蓉市 Seremban Malaysia XTBGZL023 T. integrifolia 023
1 云南河口 Hekou Yunnan XTBGZL011 T. subflabellata 011 3 马来西亚芙蓉市 Seremban Malaysia XTBGZL024 T. integrifolia 024
2 云南河口 Hekou Yunnan XTBGZL012 T. subflabellata 012 4 西藏墨脱背崩 Beibeng Motuo Tibet XTBGZL029 T. integrifolia 029
3 越南老街 Laocai Vietnam XTBGZL013 T. subflabellata 013 5 西藏墨脱背崩 Beibeng Motuo Tibet XTBGZL030 T. integrifolia 030
4 越南老街 Laocai Vietnam XTBGZL014 T. subflabellata 014 6 西藏墨脱汗密 Hanmi Motuo Tibet XTBGZL007 T. integrifolia 007
表 2摇 四个片段的引物信息表
Table 2摇 Primer pairs used for the four DNA markers ITS,
rbcL, matK, and trnH鄄psbA
Region Primers (sequence 5忆-3忆)
ITS
ITS5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC
rbcL 1F: ATGTCACCACAAACAGAAAC724R: TCGCATGTACCTGCAGTAGC
trnH鄄psbA psbA: GTTATGCATGAACGTAATGCTCtrnH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
matK 390F: CGATCTATTCATTCAATATTTC1326R: TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT
衡量 DNA条形码的一个重要指标是 “barcode gap冶
是否存在, 即序列的种内变异要足够小而种间变异要足
够大, 从而在中间形成一个明显的间隔区 (Meyer 和
Paulay, 2005)。 本文用Meier等 (2006) 的 TaxonDNA软
件结合一般的统计软件构建出能够体现种间、 种内的遗
传距离的分布频度的柱形图。 通过 Wilcoxon 秩和检验来
检验序列之间的变异性差异。
用 MEGA 4. 0 (Tamura 等, 2007) 软件计算各 DNA
片段的种内和种间的 Kimura鄄2鄄parameter (K2P) 成对遗
传距离。 同时构建单独片段以及片段组合的邻接树
(NJ), 靴带值以 5 000 次重复运算。 参考 Hollingsworth
等 (2009) conspecific individuals ‘ grouping together爷 原
则, 即每个种的所有个体都聚为一个单系分支则被认为
该种鉴定正确。 另外, 利用 TaxonDNA (Meier等, 2006)
软件中的 “Best match冶、 “Best close match冶 和 “All spe鄄
cies barcodes冶 (简称 BBA法) 对物种的鉴定率进行评估。
本研究中, 由于丝须蒟蒻薯 (T. integrifolia) 的样
品在所有的 DNA片段中均聚为 2 个不同的单系分支, 为
了避免与传统分类混淆, 我们在本文中将两个分支处理
为丝须蒟蒻薯马来西亚分支和丝须蒟蒻薯西藏分支, 连
同其余 5 个种 (即老虎须, 实果蒟蒻薯, 水田七, 裂叶
蒟蒻薯, 扇苞蒟蒻薯) 对条码进行评价。
2摇 结果
2. 1摇 PCR扩增和测序成功率
PCR扩增和测序成功率存在较大的差异,
trnH鄄psbA的扩增效率最高, 为 100% , rbcL 和
matK的 PCR 扩增成功率相同, 均为 94% , ITS
的 PCR扩增成功率最低, 为 78% (表 3)。 PCR
扩增成功的样品其测序率均为 100% 。 trnH鄄
psbA, rbcL和 matK三个叶绿体片段所有种中均
能扩增成功, 只是个别个体扩增失败。 ITS 片段
PCR扩增成功率低的主要原因是裂叶蒟蒻薯所
有样品均扩增失败, 尽管我们使用了两对 ITS 引
物 (ITS5 / ITS4 和 ITS1 / ITS4), 并对 PCR反应条
件进行了优化。
2. 2摇 序列信息
所选用的 4 个 DNA 片段的长度、 变异位点
等信息见表 3。 ITS 片段的矩阵长度包括 740 个
位点, 其中含有 181 个变异位点 (24. 5% ) 和 6
个插入 /缺失位点, 老虎须所有样品在 106 ~ 110
位点处的有一个 4 bp的插入 /缺失; trnH鄄psbA片
段的矩阵则包括 349 个位点, 其中 22 个为变异
位点, 还包括 4 个插入 /缺失位点, 而这 4 个插
入 /缺失位点均为种特有位点, 其中丝须蒟蒻薯
的马来西亚居群在 54 ~ 61 位点含有一个 8 bp 的
缺失, 裂叶蒟蒻薯在 117 ~ 126 位点有一个 10 bp
的插入, 水田七在 132 ~ 142 位点有一个 11 bp
的缺失, 裂叶蒟蒻薯在 144 ~ 150 位点含有一个
7 bp 的插入; matK 基因的矩阵长度为 742 个位
点, 包括了 62 个变异位点 (8. 36% ) 和 1 个 6
bp插入 /缺失位点, 这个插入 /缺失位点为丝须
蒟蒻薯马来西亚居群特有; rbcL 基因的序列长
度在种间无差异, 均为 651 bp, 其矩阵中仅含有
10 个变异位点 (1. 54% )。 在 4 个 DNA片段中,
表 3摇 基于 “条码分类冶 的 7 个种的 4 个片段的 PCR, 测序, 变异位点信息
Table 3摇 Summary of PCR, sequencing success and variability of the 4 DNA barcode regions. The species resolution,
intraspecific and interspecific distance was caculated based on the 7 barcode “taxon冶 names (mean依SE)
Region PCRSuccess / %
Sequencing
Success / %
No. of
Variable sites / %
Indels
( length)
Aligned
length / bp
Intraspecific
K2P鄄distance
Interspecific
K2P鄄distance
trnH鄄psbA 36(100) 100 22 (6. 30) 4 (7, 8, 10, 11) 349 0. 0010依0. 0004 0. 0138依0. 0028
rbcL 34(94) 100 10 (1. 54) 0 651 0. 0005依0. 0003 0. 0049依0. 0008
matK 34(94) 100 62 (8. 36) 1 (6) 742 0. 0017依0. 0010 0. 0223依0. 0027
ITS 28(78) 100 181 (24. 5) 6 (1-4) 740 0. 0033依0. 0018 0. 0903依0. 0165
7766 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵月梅和张玲: 蒟蒻薯属 (薯蓣科) 植物 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
种内遗传距离均明显小于种间遗传距离;ITS 片
段具有最大的种内遗传距离和种间遗传距离,其
次为 matK和 trnH鄄psbA,而 rbcL 则具有最小的种
内遗传距离和种间遗传距离(表 3)。
2. 3摇 DNA Barcode gap 的评估及种间种内差异
的统计学检验
从 4个 DNA片段种间和种内遗传变异的分布
图可以看出 (图 1), ITS 片段除了 2. 0% ~ 2. 5%
处稍有重叠外, 种内变异和种间变异之间的界限
明显, 表明存在明显的 “barcode gap冶; 但是三个
叶绿体片段 matK、 trnH鄄psbA、 rbcL的种内和种内
遗传变异的分布并不存在 “barcode gap冶 (图 1)。
利用 Wilconxon秩和检验对不同序列种内种
间的变异性进行统计分析, 结果表明 ITS 序列具
有最大的种间分异率, 而 rbcL 具有最小的种间
分异率, 其种间的分异率依次为 ITS >matK >
trnH鄄psbA>rbcL (表 4); 而 4 个 DNA 片段的种
内变异不存在显著性差异 (表 5)。
2. 4摇 物种分辨率
本文采用 Tree鄄based 和 BBA两种方法对蒟蒻
薯属的物种鉴定率进行了分析。 基于 Tree鄄based
方法中, 在基于单个片段的 NJ 树中, ITS 表现最
好 (图 2: B), 可以区分所有 6 个种 (因裂叶蒟
蒻薯扩增失败没有获得 ITS 序列), matK 可以区
分 7个种中的 5 个种 (71. 43%), trnH鄄psbA可分
辨 7个种中的 4 个种 (57. 14%), rbcL 鉴定能力
最差, 只能区分 7 个种中的 3 个种 (42. 86%)
(表 6)。 片段组合中除了 rbcL+trnH鄄psbA (57.14%)
图 1摇 4 个候选片段种间种内 K2P距离频率直方图. X轴表示 K2P距离, Y轴表示是出现的累计频率
Fig. 1摇 The frequency distribution of inter鄄 and intra鄄specific Kimura 2鄄parameter (K2P) distances for 4 candidate regions.
The X axis relates to the K2P distances, and the Y axis corresponds to the number of occurrences
876摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
表 4摇 4 个候选序列种间变异的Wilcoxon秩和检验
Table 4摇 Wilcoxon signed rank tests of the inter鄄specific divergence among the 4 candidate regions
W+ W鄄 Relative Ranks, n, P value Result
ITS rbcL W+=20, W鄄=190, N=20, P<=0. 0007076 ITS>rbcL
ITS trnH鄄psbA W+=36, W鄄=195, N=21, P<=0. 006035 ITS>trnH鄄psbA
ITS matK W+=42, W鄄=189, N=21, P<=0. 01117 ITS>matK
rbcL matK W+=1, W鄄=230, N=21, P<=7. 424e鄄05 matK>rbcL
rbcL trnH鄄psbA W+=208, W鄄=23, N=21, P<=0. 001385 trnH鄄psbA>rbcL
matK trnH鄄psbA W+=10, W鄄=221, N=21, P<=0. 0002628 matK>trnH鄄psbA
表 5摇 4 个候选序列种内变异的Wilcoxon秩和检验
Table 5摇 Wilcoxon signed rank tests of the intra鄄specific divergence among the 4 candidate regions
W+ W鄄 Relative Ranks, n, P value Result
ITS rbcL W+=15, W鄄=0, N=5, P<=0. 0625 ITS= rbcL
ITS trnH鄄psbA W+=18, W鄄=3, N=6, P<=0. 1562 ITS= trnH鄄psbA
ITS matK W+=12, W鄄=3, N=5, P<=0. 3125 ITS=matK
rbcL matK W+=1, W鄄=5, N=3, P<=0. 5 matK= rbcL
rbcL trnH鄄psbA W+=0, W鄄=15, N=5, P<=0. 0625 trnH鄄psbA= rbcL
matK trnH鄄psbA W+=9, W鄄=6, N=5, P<=0. 8125 matK= trnH鄄psbA
图 2摇 基于 K2P距离的叶绿体 matK+rbcL联合矩阵 (A) 和核基因 ITS (B) 得到的无根 NJ树 (分支上显示高于 50%支持率)
Fig. 2摇 Unrooted neighbour鄄joining (NJ) tree based on the K2P鄄distance of cpDNA matK+rbcL (A)
and nrDNA ITS (B) used, Bootstrap values over 50% were shown above the branches
9766 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵月梅和张玲: 蒟蒻薯属 (薯蓣科) 植物 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 6摇 基于 “Tree鄄based冶 和 “best match冶, “best close match冶, “all species barcodes冶 的鉴定成功率
Table 6摇 Identification successes (% ) based on “Tree鄄based冶 and “best match冶, “best close match冶, “all species barcodes冶
Region Tree鄄based
Ps
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 BBA摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Best match
SI AI MI
Best close match
SI AI MI NM
All species barcodes
SI AI MI NM
ITS 100 100 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0
rbcL 42. 86 41. 17 58. 82 0 41. 17 58. 82 0 0 100 0 0 0
matK 71. 43 79. 41 20. 85 0 79. 41 20. 85 0 0 88. 23 11. 76 0 0
trnH鄄psbA 57. 14 63. 88 36. 11 0 63. 88 36. 11 0 0 91. 66 8. 33 0 0
ITS+rbcL 100 100 0 0 100 0 0 0 92. 59 7. 4 0 0
ITS+matK 100 100 0 0 100 0 0 0 92. 59 7. 4 0 0
ITS+trnH鄄psbA 100 100 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0
matK+rbcL 100 100 0 0 100 0 0 0 93. 93 6. 06 0 0
matK+trnH鄄psbA 71. 43 100 0 0 100 0 0 0 94. 11 5. 88 0 0
rbcL+trnH鄄psbA 57. 14 100 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0
ITS+rbcL+matK 100 100 0 0 100 0 0 0 92. 59 7. 4 0 0
ITS+rbcL+trnH鄄psbA 100 100 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0
ITS+matK+trnH鄄psbA 100 100 0 0 100 0 0 0 92. 59 7. 4 0 0
matK+trnH鄄psbA+rbcL 100 100 0 0 100 0 0 0 93. 93 6. 06 0 0
matK+trnH鄄psbA+rbcL+ ITS 100 100 0 0 100 0 0 0 92. 59 7. 4 0 0
注: 成功鉴定 (SI); 模糊鉴定 (AI); 鉴定失败 (MI); 没有匹配 (NM); 物种作为单系的鉴定成功率 (Ps)
Note: SI: successful identification; AI: ambiguous identification; MI: misidentification; NM: no match; Ps: percentages of species resolved as
unique clusters
和 matK+trnH鄄psbA (71. 43% ) 外, 其余所有条
码组合的鉴定率均为 100% (表 6); BBA 检验
法中, 单独片段在 “best match冶 和 “best close
match冶 模式中表现为 ITS最高, 为 100% , 即所
有序列均可鉴定到种, matK 为 79. 41% , trnH鄄
psbA为 63. 88% , rbcL 最小, 为 41. 17% , 所有
片段组合均为 100% , 其中 matK+ trnH鄄psbA 和
rbcL+trnH鄄psbA结果比基于 Tree鄄based 鉴定率更
高, 在 “all species barcodes冶 模型中, 单独片
段 matK 最小, 为 88. 23% , 片段组合中 ITS +
trnH鄄psbA、 rbcL+trnH鄄psbA、 ITS+rbcL+trnH鄄psbA
为 100% , 其他组合都在 90%以上 (表 6)。
3摇 讨论
3. 1摇 DNA条形码的评价
DNA片段引物通用性是条形码评价的重要
标准之一 ( Kress 等, 2005; Hollingsworth 等,
2009; CBOL Plant Working Group, 2009)。 本研
究选用的 4 个 DNA 片段中, trnH鄄psbA 引物的通
用性 (PCR扩增和测序成功率) 表现最好, 为
100% ; rbcL 和 matK 各有少量样品扩增失败,
PCR扩增效率均为 94% , 这可能是因为样品的
DNA 模板的质量较差或实验技术方面的问题。
ITS的 PCR 扩增通用性最低, 为 78% , 主要是
因为裂叶蒟蒻薯 8 个样品中均扩增失败, 这可能
是因为该种在引物区核苷酸发生突变所导致
(Liu等, 2011)。 所有 PCR扩增成功的样品均能
成功测序。
ITS序列具有最大的种间分异率, matK 次
之, rbcL具有最小的种间分异率; 而 4 个 DNA
片段的种内变异无著性差异。 通过对种内和种间
遗传变异分布的分析, ITS 具有明显的 “barcode
gap冶, 物种分辨率为 100% , 而叶绿体片段
matK、 trnH鄄psbA和 rbcL 的 “barcode gap冶 不明
显, 除 matK 外, trnH鄄psbA 和 rbcL 的物种分辨
率均较低。 因此, 在物种分辨率方面 ITS 片段作
为 DNA条码具有明显的优势, 但其较低的引物
通用性可能是其作为该属 DNA 条形码的主要限
制因素; matK的变异虽然小于 ITS, 但其高的引
物通用性和较高的物种鉴别率可作为该属的
DNA条码或条码组合的一部分。 trnH鄄psbA 序列
长度变异较大, 含有多个插入 /缺失位点, 可能
会对序列比对造成困难 ( Hollingsworth 等,
2009), 但利用好插入 /缺失位点会帮助对物种的
086摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
鉴定 (Kress 和 Erickson, 2007; Liu 等, 2011),
trnH鄄psbA在单独或片段组合中较低的物种分辨
率, 可能不适合作为该属的 DNA 条码, 尽管其
通用性最高。 rbcL 序列在 4 个 DNA 片段中变异
最少, 物种鉴别率也最低, 但该片段通用性较高
且容易排序, 并且在部分片段组合中具有较高的
物种分辨率, 因此可作为条码组合中的一个候选
条码。
3. 2摇 蒟蒻薯属的物种分辨率
Tree鄄based方法中, 单片段鉴定能力为 ITS>
matK>trnH鄄psbA>rbcL, ITS可以鉴别所有的 6 个
种, 而 rbcL的物种鉴别率为 42. 86% 。 在片段组
合中, 除 rbcL+ trnH鄄psbA 和 matK+ trnH鄄psbA 组
合分别能分辨 57. 14%和 71. 43%的物种外, 其
它条码组合的物种分辨率均为 100% 。 CBOL 植
物工作组 (2009) 推荐 matK+ rbcL 组合作为陆
地植物的核心条码, 物种分辨率可达 72% 。 在
本研究中, matK+rbcL组合可以区分本文中蒟蒻
薯属所有的种, 物种鉴定率为 100% , 可作为该
种植物的鉴定的标准条码。 虽然在所有含有 ITS
片段的组合条码的物种分辨率也均为 100% , 但
由于 ITS在裂叶蒟蒻薯中不能扩增, 导致该种在
使用 ITS时不能有效鉴定。 如果能解决 ITS 在裂
叶蒟蒻薯中 PCR 扩增的技术瓶颈, 那 ITS 单个
片段或与其它条码 (如 matK和 rbcL等) 的组合
也可以作为该属物种的标准条码。 由于 matK+
rbcL具有三条码组合和四条码组合相同的物种鉴
定效率, 因此, 我们推荐 matK+rbcL组合作为蒟
蒻薯属植物鉴定的标准条码。
3. 3摇 丝须蒟蒻薯新种的发现
DNA条形码技术是形态分类的重要辅助工
具之一, 除帮助鉴定现有的物种外, 还能发现
一些新的物种或隐种 (Newmaster 和 Ragupathy,
2009; Valentini等, 2009)。 由于蒟蒻薯属植物同
一种的不同居群在各自特殊的生境和气候地理环
境的影响下, 有些形态或遗传结构已经发生了变
化, 在物种的形态鉴定上缺乏稳定的性状 (张
玲等, 2006), 因此, 仅依靠形态特征来鉴定物
种具有一定的困难, 需要用 DNA 条形码的方法
结合形态特征来重新评估现有物种的分类地位。
本研究中, 基于形态性状承认的老虎须, 实
果蒟蒻薯, 扇苞蒟蒻薯, 水田七, 裂叶蒟蒻薯 5
个种各自均能形成单系分支, 得到了 DNA 条形
码很好的区分 (图 2: A、 B)。 而丝须蒟蒻薯的
样品并没有形成单系分支, 而是被分成两个独立
的单系分支, 即采自马来西亚居群的丝须蒟蒻薯
马来西分支和采自西藏居群的丝须蒟蒻薯西藏分
支 (图 2)。 ISSR分析结果表明, 丝须蒟蒻薯的
西藏居群和马来西亚居群间存在显著的遗传分化
(张玲等, 2006), 它们可能已分化形成了两个不
同的遗传实体。 从分布范围来看, 丝须蒟蒻薯分
布的范围较广, 从巴基斯坦、 斯里兰卡、 印度东
北部、 柬埔寨、 老挝、 缅甸、 泰国、 越南至西马
来西亚、 印度尼西亚群岛均有分布, 且南北有很
大的地理隔离 (Drenth, 1972)。 在我国仅分布
在西藏东南部的雅鲁藏布江河谷内, 位于热带雨
林的北部的极限, 但由于南北走向的河谷和其中
的高山, 形成了热带性质的局部小气候 (张玲
等, 2006), 这种与中心分布区长期隔离势必会
造成遗传结构的分化 (Hewitt, 2000) 和形态的
变异。 丝须蒟蒻薯的西藏居群和马来西亚居群在
形态上也存在一定的差异, 如西藏居群的大苞片
颜色为白色, 下部略紫, 而马来西亚居群的大苞
片为黑紫色; 二者花期也不同, 西藏居群为 8-9
月, 而马来西亚居群为 5 -6 月。 综合分析, 我
们认为丝须蒟蒻薯西藏居群很可能是一个新种,
但还需要更详细的形态学证据对其分类学地位进
行评价。 本文的结果对于蒟蒻薯属植物的保护和
分类学的认识具有重要的作用。
致谢摇 中国西南野生生物种质资源库分子生物学实验中
心的杨俊波、 李洪涛老师以及 DNA条形码小组的各位同
学在实验和数据处理过程中给予了很多技术指导, 高连
明老师在文章写作及修改过程中提出了大量的宝贵意见
和建议。
也参摇 考摇 文摇 献页
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1866 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵月梅和张玲: 蒟蒻薯属 (薯蓣科) 植物 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
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