全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 4 期 2016 年 2 月

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• 药材与资源 •
灰毡毛忍冬 MADS-box 基因家族 AGL15 基因的克隆、生物信息学和表达
分析
易刚强 1，蔡嘉洛 2，朱贻霖 2，陈 林 2，樊 悦 2，刘 峰 3，张亚丽 2，欧阳琳 1，刘湘丹 2，童巧珍 2*
1. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410000
2. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208
3. 湖南省农业科学院，湖南 长沙 410000
摘 要：目的 基于前期对灰毡毛忍冬 Lonicera macranthoides 转录组测序结果，从灰毡毛忍冬 RNA 中克隆灰毡毛忍冬
MADS-box 基因家族蕾期延长相关基因 AGL15，并对其进行生物信息学及表达分析。方法 对灰毡毛忍冬总 RNA 进行反转
录酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和 cDNA 末端快速扩增反应（rapid amplification of cDNA ends，RACE），
获得完整的开放阅读框（ORF）。运用生物信息学的方法对该序列进行同源性分析和相似性比较，预测编码蛋白，并对其进
行各种理化性质分析。运用半定量 PCR 测得该基因在灰毡毛忍冬不同部位的表达情况。结果 获得 AGL15 基因，ORF 长
795 bp，编码 264 个氨基酸，与葡萄 Vitis vinifera 中 MADS-box 基因家族 AGL15 基因相似性最高，且包含 MADS 和 K-box
的保守序列。AGL15 蛋白无跨膜区域，定位于细胞质中，在灰毡毛忍冬各部位均有表达。结论 首次从灰毡毛忍冬中克隆
得到可能控制蕾期延长的基因，分析了其在灰毡毛忍冬不同部位表达差异性，为灰毡毛忍冬蕾期延长研究提供参考。
关键词：灰毡毛忍冬；蕾期延长；基因克隆；生物信息学分析；基因表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)04 - 0640 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.04.019
Cloning of MADS-box gene AGL15 from Lonicera macranthoides and analysis on
its bioinformatics and expression
YI Gang-qiang1, CAI Jia-luo2, ZHU Yi-lin2, CHEN Lin2, FAN Yue2, LIU Feng3, ZHANG Ya-li2, OUYANG Lin1,
LIU Xiang-dan2, TONG Qiao-zhen2
1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410000, China
2. Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China
3. Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410000, China
Abstract: Objective To clone the MADS-box gene denoted AGL15 from total RNA of Lonicera macranthoides based on previous
transcriptome sequencing data and analyze the bioinformatics and expression of the gene. Methods The gene containing intact open reading
frame (ORF) was cloned by reverse transcription-PCR (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The similarity comparison
and homology analysis on the sequence were carried out using bioinformatic method, the coding protein was predicted and the
physicochemical properties were analyzed. The expression of the gene in different locations of L. macranthoides was determined by
semiquantitative PCR using gene-specific primers. Results The Lm-AGL15 gene, containing a 795 bp ORF that encoded 264 amino acids,
was cloned. The deduced protein sequence had the most similarity to the AGL15 in Vitis vinifera and exhibited two conserved motifs (MADS
and K-BOX). Without transmembrane domain, Lm-AGL15 was located in cytoplasm and expressed only in each part. Conclusion For the
first time from L. macranthoides cloning could prolong the period of bud of gene, analysis of the gene expression in different parts of L.
macranthoides which would provide a reference for the study of prolonging L. macranthoides bud stage.
Key words: Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.; bud stage prolonging; clone; bioinformatic analysis; gene expression

收稿日期：2015-09-21
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81203007）；湖南省自然科学基金资助（13JJ9010）；湖南省教育厅科技创新平台（14K071）；湖南省
研究生科研创新项目（CX2014B368）；湖南省“中药学”重点学科建设项目资助（湘教通[2011]76 号：zy201403，zy201505）
作者简介：易刚强（1965—），男，副教授，主要从事中药资源及中药新药研究。E-mail: ygq8228@163.com
*通信作者 童巧珍（1971—），女，教授，主要从事中药资源与质量研究。E-mail: qztong88@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 4 期 2016 年 2 月

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灰毡毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.
为忍冬科植物。干燥花蕾或带初开的花为中药[1]，
具有清热解毒，凉散风热的功效，临床上广泛用
于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热
感冒、温热发病等症，也可作为提取绿原酸或挥
发油的原料，长期以来如何解决灰毡毛忍冬蕾期
短、采摘不及时是灰毡毛忍冬生产和应用中一个
棘手的问题。常规品种的灰毡毛忍冬花蕾期长仅
3～4 d，开花后第 2 天即开始凋谢[2]，采收时间仓促，
有时与农时相冲突来不及采摘，直接影响灰毡毛忍
冬药材的产量与质量。杨苗等[3]和耿世磊等[4]对灰毡
毛忍冬不同发育阶段花结构与绿原酸量变化关系
进行了研究，结果表明花中细胞分化较早绿原酸
量较高，分化越成熟量越低。以上说明，灰毡毛
忍冬绿原酸的富集在蕾期较多，其量随着花冠展
开而下降。花期太短不仅对采摘灰毡毛忍冬药材
带来麻烦，还将直接影响灰毡毛忍冬的产量和品
质。因此，灰毡毛忍冬蕾期长短是生产中亟待解
决的关键瓶颈问题。
20 世纪 90 年代末，发现了一株灰毡毛忍冬
自然变异株，表现为花蕾整齐，花蕾期长，花冠
不开放，花蕾初期呈青绿色，逐渐转为绿白色和
白色，20 多天才开始凋谢等性状。该变异性状为
灰毡毛忍冬的采摘、质量及农事操作等提供了有
力的保障，于 2004 年 6 月通过省级鉴定，命名为
湘蕾灰毡毛忍冬，被广泛引种栽培。湘蕾灰毡毛
忍冬具有以上诸多优点，为灰毡毛忍冬的开发利
用开创了新的纪元，也因此促使了诸多研究学者
对变异株变异的根本原因进行探索，期望能找到
调控优良性状的原因，为其他花类药材、食品、
切花等领域指引新的方向。
目前大量不同植物种类的 MADS 家族基因已
经被成功克隆，MADS-box 基因是真核生物中一类
重要的转录调控因子，在生长发育调控和信号传导
中发挥着重要作用，同时在植物中参与花器官的发
育，开花时间的调节，但灰毡毛忍冬 MADS-box 相
关基因的研究并不多[5]。因此，研究灰毡毛忍冬
MADS-box 家族基因对于阐明灰毡毛忍冬蕾期控制
相关分子机制有重要意义[6]。
本课题组前期对常规灰毡毛忍冬和湘蕾灰毡毛
忍冬转录组进行了测序和分析，获得多条差异明显
基因，同时有数条预测为有控制发育功能的编码序
列（coding sequence，CDS）的 MADS-box 家族成
员，其中 Unigene17356 基因差异明显，根据其序列
设计引物，对湘蕾型灰毡毛忍冬总 RNA 进行逆转
录（reverse transcription）反应和 cDNA 末端快速扩
增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE），
获得完整的开放阅读框（ ORF ），并命名为
Lm-AGL15，首次成功从灰毡毛忍冬总 RNA 中克隆
到可能参与控制蕾期延长的基因 AGL15。运用生物
信息学的方法对该序列进行同源性分析，理化性质
分析，并预测 Lm-AGL15 编码蛋白。最后通过半定
量 PCR 技术对 Lm-AGL15 基因在灰毡毛忍冬不同
部位的表达进行差异对比分析，为后续进一步通过
功能分析找出控制湘蕾灰毡毛忍冬花蕾期长度、抑
制花冠展开的系列功能基因，为将来进一步通过转
基因技术将这些功能基因转入其他品种的灰毡毛忍
冬、金银花或其他药用、食用、切花、香精香料原
料等植株中，培育出花蕾期长、或花冠不展开的新
优良品种打下前期基础，具有广泛的开发和应用前
景，有望带来巨大的社会效益和经济效益。
1 材料
样品均采自湖南中医药大学药用植物培植基
地，经湖南中医药大学药学院周日宝教授鉴定为湘
蕾型灰毡毛忍冬与常规型灰毡毛忍冬 Lonicera
macranthoides Hand. -Mazz.。立即用锡箔纸包裹置
于液氮中保存。
Biospin 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒（杭
州博日科技有限公司）、琼脂糖凝胶回收试剂盒、
Trans2K DNA Marker（全式金生物科技有限公司）；
EASY-T1 Cloning 试剂盒、RevertAidTM First Strand
cDNA Synthesis Kit（反转录试剂盒）（北京智杰方
远科技有限公司）；3’-RACE 试剂盒、5’-Full RACE
Kit with TAP 试剂盒、Ex TaqDNA 聚合酶，Ex TaqHS
DNA 聚合酶（Takara 公司）；其余试剂均为国产分
析纯；扩增所用引物及获得片段的序列测定委托上
海生工生物工程有限公司完成（表 1）。
2 方法
2.1 灰毡毛忍冬总 RNA 的提取与 cDNA 第一条链
的合成
参照 Biospin 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒
说明书，以 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整
性，紫外分光光度计检测 RNA 纯度。以提取的 RNA
样品为模板，使用北京智杰方远科技有限公司的反
转录 cDNA 第一链合成试剂盒合成第一条链，获得
cDNA 样品于−20 ℃贮存备用[6]。
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表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物 序列 (5’-3’) 引物用途
Lm-AGL15F ATGGGTCGAGGGAAGATTGAG 核心片段上游引物
Lm-AGL15R TTAACATTTCAATTTCATTTC 核心片段下游引物
AGL15GSP1 GATTACGCCAAGCTTCAAGGCAGAGGAACCTAAGGAGGTGGAT 3’-RACE 上游特异性引物
AGL15GSP2 GATTACGCCAAGCTTTCCACCTCCTTAGGTTCCTCTGCCTTGT 5’-RACE 下游特异性引物

2.2 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 核心片段的克隆
根据前期灰毡毛忍冬转录组测序获得的长度
为 765 bp Unigene17356 序列，设计特异性引物，
上游引物 Lm-AGL15F，下游引物 Lm-AGL15R。
以“2.1”项方法获得的 cDNA 为模板进行 PCR
扩增，反应体系 25 μL，其中引物 Lm-AGL15F 和
Lm-AGL15R 各 2.5 μL，10×Ex Taq 缓冲液 2.5 μL，
2.5 mmol/L dNTP 1 μL，模板 cDNA 3 μL，Ex
TaqDNA 聚合酶 1 μL，补 ddH2O 12.5 μL 至 25 μL。
反应条件为 95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 50 s，
53 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，34 个循环后
72 ℃延伸 10 min。经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检
测后，回收核心片段，连接和转化过程参考全式
金 pEASY-T1 Cloning Kit 试剂盒说明书，转化
Trans1-T1 感受态细胞。
菌液 PCR 体系：25 μL 体系含 1 μL 菌液，2 μL
dNTPs，1 μL Taq酶，2.5 μL 10×Buffer，引物各1 μL，
17.5 μL ddH2O。94 ℃预变性7 min；94 ℃变性1 min，
53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，循环扩增 34 次；
72 ℃延伸 10 min。将 PCR 鉴定的阳性克隆，按质
粒提取试剂盒方法提取质粒 DNA，送上海生工生物
工程有限公司测序。
2.3 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 3’末端序列的获得
使用 TaKaRA 3’-RACE 试剂盒将灰毡毛忍冬总
RNA 反转录为 cDNA，以 AGL15GSP1 进行灰毡毛
忍冬 3’端 PCR 扩增。
PCR 50 μL 反应体系：2 μL 反转录反应液，8 μL
1xcDNA Dilution Buffer II，2 μL AGL15GSP1（10
μmol/L），2 μL 3’-RACE Primer（10 μmol/L），5
μL10×PCR Buffer II（Mg2+ Free），3 μL MgCl2（25
mmol/L），0.5 μL Taq 酶（2.5 U/μL），28.5 μL ddH2O。
94 ℃、5 min，94 ℃、55 s，55 ℃、1 min，72 ℃、
90 s；共 32 个循环；72 ℃、10 min。
PCR 产物经凝胶回收、连接和转化，挑取阳性
克隆送上海生工生物工程有限公司测序。
2.4 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 5’末端序列的获得
使用 TaKaRA 5’-RACE 试剂盒将灰毡毛忍冬总
RNA 反转录为 cDNA，以 AGL15GSP2 进行灰毡毛
忍冬 5’端 PCR 扩增。
PCR 50 μL 反应体系：2 μL 反转录反应液，9 μL
1×cDNA Dilution Buffer II，3 μL 10×PCR Buffer II
（Mg2+ free），3 μL MgCl2（25 mmol/L），0.5 μL Taq 酶
（2.5 U/μL），2 μL AGL15 GSP2 Primer（10 μmol/L），
2 μL 5’-RACE Outer Primer（10 μmol/L），28.5 μL
ddH2O。94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 40 s、55 ℃、
35 s，72 ℃、90 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min[7-8]。
取 PCR 反应液各 10 μL，使用 1.0%的琼脂糖凝
胶进行电泳检测，切胶回收电泳条带，连接、转化，
挑取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。
2.5 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 基因 cDNA 全长序列
的拼接
根据已测定的核心片段、5’和 3’端序列及其重
叠区域，使用 Bioedit 软件进行序列分析及拼接，获
得 Lm-AGL15 基因 cDNA 全长序列。将获得的序列
上传到 NCBI 的 ORF Finder 平台（http://www. ncbi.
nlm.nih.gov/gorf/），确定是否获得全长 ORF。将确
定 的 ORF 片 段 上 传 到 NCBI 的 CD-search
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/ cdd），对预测的
氨基酸序列进行保守区域搜索，验证该 ORF 片段是
否完整[6-10]。
2.6 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 基因的表达水平分析
根据全长序列，设计可扩增 Lm-AGL15 基因
全长的特异性引物，预计扩增长度为 760 bp。分
别按“2.1”项方法提取 RNA 后反转录为 cDNA。
利用扩增 Lm-AGL15 基因，反应条件同“2.2”
项。取 10 μL PCR 产物在 1.0%琼脂糖凝胶上电
泳检查。
3 结果与分析
3.1 灰毡毛忍冬总 RNA 的提取
使用 Biospin 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒
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法提取同一批 5 份（1～5）灰毡毛忍冬总 RNA，非
变性琼脂糖凝胶电泳结果如图 1 所示，总 RNA 无
DNA 残留和蛋白质杂质，电泳结果显示 28 S、18 S
条带清晰，无拖尾现象。说明 RNA 具有良好的完
整性。紫外分光光度法测定 A260 nm/A230 nm值在 2.11，
A260 nm/A280 nm值在 2.01，说明 RNA 纯度高，能满足
后续实验要求。

M-Marker 1～5-常规灰毡毛忍冬花蕾 RNA
M-Marker 1—5-bud RNA of Xianglei L. macranthoides Hand. -Mazz.
图 1 灰毡毛忍冬总 RNA 电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of total RNA in L. macranthoides
3.2 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 基因的获得
前 期 转 录 组 测 序 获 得 长 765 bp 的
Unigene17356 序列，经 BLAST 分析后发现其可
能为 MADS-box 家族基因，根据该序列设计引
物，扩增出目的核心片段，PCR 产物使用 1.0%
的琼脂糖凝胶电泳，结果见图 2，在 750 bp 左右
有一条明显的亮带，扩增产物大小与预测片段大
小基本相符，初判为目的基因片段。使用胶回收
试剂盒回收目标片段，将回收的产物连接后转
化，取阳性克隆子进行测序，测序结果显示该序
列的长度为 764 bp，将测序结果与 NCBI 数据库
进行 BLAST 对比，该片段与数据库中葡萄 Vitis
vinifera L. AGL15 相似性很高，相似度为 80%，
证明该核心片段为灰毡毛忍冬 AGL15 基因的核
心片段。
利用合成的 3’-RACE 特异性引物，进行 PCR
扩增。3’-RACE PCR 的扩增结果在 800 bp 有一条亮
带（图 3）。将 PCR 产物切胶回收，连接 pEASY-T1
载体后转化，取阳性克隆子进行测序。
利用设计合成的 5’-RACE 特异性引物，进行
PCR 扩增。5’-RACE 扩增结果在 500 bp 左右有一条
亮带（图 4）。将 PCR 产物回收，连接后转化，取
阳性克隆子进行测序。

M-Marker R1～R2-AGL15 基因核心片段 PCR 产物
M-Marker R1—R2-PCR product of AGL15 gene core fragment
图 2 AGL15 基因核心片段的 PCR 扩增结果
Fig. 2 PCR result of core fragment of AGL15 gene

M-Marker 1-AGL15 基因 3’-RACE PCR 产物
M-Marker 1-PCR product of AGL15 by 3’-RACE
图 3 AGL15 基因 3’-RACE PCR 结果
Fig. 3 3’-RACE PCR results of AGL15 gene

M-Marker 1-AGL15 基因 5’-RACE PCR 产物
M-Marker 1-PCR product of AGL15 by 5’-RACE
图 4 AGL15 基因 5’-RACE PCR 结果
Fig. 4 5’-RACE PCR results of AGL15 gene
使用 Bioedit 软件将上述测序所得到的核心目
的序列与 3’端、5’端序列进行拼接，得到基因全长
序列，并对其验证。设计全长引物，进行 PCR，回
收、转化及测序，测序结果与拼接结果一致，则说
明已经扩增得到灰毡毛忍冬 AGL15 基因的 cDNA
全长序列，验证后将该基因命名为Lm-AGL15基因，
获得基因登录号为 KR028478。
3.3 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 基因及其编码氨基酸
序列分析
Lm-AGL15 基因全长 1 399 bp，不含内含子序列，
编码 265 个氨基酸（GenBank 登录号为 KR028478，
M 1 2 3 4 5
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M R1 R2
2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
28 S
18 S
M 1
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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结果见图 5。利用 ExPASy Proteomics Server 的在线软
件 Protparam（http://www.cn.expasy.org/tools/ protparm.
html）对 Lm-AGL15 蛋白的理化性质进行预测分析，
推测其分子式为 C1324H2161N376O420S12，相对分子质量
为 30 493，等电点为 6.39，为酸性蛋白，正电残基
（Arg＋Lys）为 40，负电残基（Asp＋Glu）为 42。脂
肪系数为 85.28，其半衰期在体外哺乳动物网织红细
胞为 100 h，在酵母体内大于 20 h，在大肠杆菌体
内大于 10 h。不稳定系数为 52.67，为不稳定蛋白。
对该氨基酸序列进行亲疏水性分析，结果如图 6
所示，横坐标表示氨基酸残基的序号，纵坐标表示
残基的疏水、亲水特性，正值为疏水，负值为亲水。
总平均疏水指数（GRAVY）为−0.201，预测其为
亲水性蛋白。通过 TMHMM 软件分析得知，
Lm-AGL15 编码蛋白质无跨膜区域，全部位于膜
外。通过 Target IP 服务器的分析，判断 Lm-AGL15
蛋白定位于细胞质中。通过 SMART 服务器分析，
Lm-AGL15 蛋白第 1～60 位和第 74～162 位是 2 个
高度保守的结构功能域——MADS 和 K-box，即
MADS-box 家族成员共有的典型结构域[10]。
3.4 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 基因编码的蛋白质结
构与功能预测
运用 Predictprotein 软件预测结果显示，软件预
测 Lm-AGL15 蛋白的二级结构表明该蛋白含有 123
个 α 螺旋，占 46.42%；17 个 β 折叠，占 6.03%；125
个无规卷曲，占 47.55%。SWISS-MODEL 软件三级
结构预测结果显示Lm-AGL15基因编码蛋白质的三
级结构见图 7。

图 5 Lm-AGL15 基因核苷酸序列
Fig. 5 Nucleotide sequences of Lm-AGL15 gene


图 6 Lm-AGL15 编码蛋白的亲水性分析
Fig. 6 Hydrophily analysis on Lm-AGL15-coding protein
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
位置/bp

2.8
2.1
1.4
0.7
0
−0.7
−1.4
−2.1
−2.8
平
均
疏
水
性

90
180
270
360
450
540
630
720
810
900
1 090
1 180
1 270
1 360
1 450
1 497
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图 7 灰毡毛忍冬 AGL15 蛋白三级结构同源建模
Fig. 7 Homologous modeling of tertiary structure of AGL15
protein in L. macranthoides
3.5 灰毡毛忍冬AGL15基因编码蛋白质的相似性分析
Lm-AGL15 基因编码的氨基酸序列经 NCBI
的 BLASTp 分析，获得与其相似性较高的蛋白，
其中与麻风树 Jatropha curcas L.、葡萄 AGL15 基因
相似性最高，达 67%。使用 GENEDOC 软件将该氨
基酸序列与比对上的前 5 条不同物种的蛋白质序列
进行比对，结果如图 8 所示，相似性由高到低分别
是 葡 萄 AGL15 基 因 [AGL15 isoform X1 ，
731414618]，麻风树 Jatropha curcas L. AGL15 基因
[AGL15 ， 802556094] ，甜橙 Citrussinensis (L.)
Osbeck. AGL15 基因 [AGL15-like，568858840]，梅
Prunus mume Apricot. AGL15 基因 [AGL15，
645251155]，野草莓 Fragaria vesca Duch. AGL15 基
因 [AGL15，470143144]。分析发现 Lm-AGL15 基
因编码的氨基酸序列具有 Mads-box 家族特有的
MADS 与 K-box 保守序列，可进一步确定其为
MADS-box 家族基因[11-15]。
MADS


K-box


图 8 Lm-AGL15 编码蛋白与其他物种 AGL15 基因编码蛋白的相似性分析
Fig. 8 Similarity analysis on Lm-AGL15-coding protein and other AGL15 proteins
3.6 不同物种来源 AGL15 基因的系统进化分析
为了分析灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 基因与其
他 AGL15 基因的进化关系，将获得的 Lm-AGL1
5 基因推导的氨基酸序列与其他植物中已报道的
属于 AGL15 亚家族的成员进行比对，构建系统
发育树状图（图 9），其中包括葡萄、龙眼 Dimo
carpus longan Lour.、白梨 Pyrus bretschneideri
Rehd.、雷蒙德式棉 Gossypium raimondii Ulbr.、
苹果 Malus pumila Mill.、梅、麻风树、橙子以
及野草莓。
从图 9 中可以分析得出 AGL15 亚家族基因大
致归为 3 类，Lm-AGL15 蛋白序列与其他被子植物
门双子叶植物纲的 AGL15 基因有较近的亲缘关系
归为一类，可确定该基因编码 AGL15 亚家族基因

图 9 Lm-AGL15 基因与已知的 AGL15 基因的进化树分析
Fig. 9 Phylogenetic tree for Lm-AGL15 and these from
other species
麻风树
德蒙雷式棉
灰毡毛忍冬
葡萄
野草莓
梅
苹果
白梨
橙子
龙眼
0.02
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类蛋白。Lm-AGL15 和葡萄 AGL15 的距离最近，而
Lm-AGL15 和龙眼 AGL15 的距离最远[16-19]。
3.7 灰毡毛忍冬 Lm-AGL15 基因的表达
PCR 结果显示湘蕾型灰毡毛忍冬植株中的不
同部位，均能检测到符合预期大小的 Lm-AGL15 基
因片段，同时常规型灰毡毛忍冬花蕾中也检测到
Lm-AGL15 基因片段，湘蕾型灰毡毛忍冬植株中花
蕾亮度最高，茎、叶亮度基本一致。说明 Lm-AGL15
基因主要在花育器官部位表达，同时湘蕾型灰毡毛
忍冬植株花蕾中Lm-AGL15基因的表达远高于常规
型灰毡毛忍冬花蕾中的表达（图 10）。


M-Marker 1-actin内参基因 2-湘蕾型花蕾 3-常规型花蕾 4-茎 5-叶
M-Marker 1-acting gene 2-xianglei’s Bud 3-changgui’s bud
4-stem 5-leaf
图 10 灰毡毛忍冬不同品种及部位中 Lm-AGL15 基因的表达
Fig. 10 Expression of Lm-AGL15 genes in different parts
and varieties of L. macranthoides
4 讨论
灰毡毛忍冬作为山银花主要药材来源，其生物
活性物质高、产量高的特点被人们广泛熟知与接受，
但如何解决灰毡毛忍冬蕾期短、采摘不及时是灰毡
毛忍冬生产和应用中一个棘手的问题。因此克隆并
研究湘蕾灰毡毛忍冬控制蕾期长短的相关基因，对
于灰毡毛忍冬药用价值的开发及利用具有积极的促
进作用。本研究通过对灰毡毛忍冬 MADS-box 基因
家族中的 Lm-AGL15 基因的研究，为从基因水平探
索灰毡毛忍冬的生理生化研究奠定基础。
MADS-box 基因参与植物花发育不同环节的调
控，该基因家族可能形成复杂的复合物来调控花器
官的特征以及控制花发育的过程。研究通过同源基
因克隆，利用多聚酶链式反应（PCR）结合 3’-RACE、
5’-RACE 技术，克隆了灰毡毛忍冬 MADS-box 基因
AGL15 的 cDNA 全长序列，命名为 Lm-AGL15 基
因，将其提交到 GenBank 数据库，获得基因登录号
为 KR028478。该基因的核苷酸序列全长为 1 399
bp，该基因序列的第 1～222 位核苷酸为基因的
5’UTR，第 1 018～1 399 位核苷酸为基因的 3’UTR，
含有 16 bp 的 PolyA 结构，其中包括一个 795 bp 的
完整开放阅读框（ORF）编码 264 个氨基酸。同时
研究表明，Lm-AGL15 基因编码蛋白的二级结构以
α-螺旋为主，Lm-AGL15 在结构上有很高的同源
性，与 MADS-box 家族基因相比都含有 MADS 与
K-box 两个保守的功能区域，且分成 4 个区，N
端是 60 个氨基酸的 MADS 结构域，蛋白的中部
为 69 个氨基酸 K-box，MADS 区和 K 区之间为
27 个氨基酸的 I 区，C 端区域包含 57 个氨基酸，
该基因还含有 MADS-box 基因 D 类基因特有的
AG motif I 和 AG motif II，表明 Lm-AGL15 是灰
毡毛忍冬的 AGAM（AG）类基因。经 BLASTp
分析发现其与多条 AGL15 基因具有较高相似性，
且含有一个相同的 CArG（C-[A/T]rich-G）基序的
DNA 结合元件，此结构推测能够激活或抑制特异
基因的表达[20-23]。
同时研究发现胚珠发育时，AG 基因得以表
达，在拟南芥 Arabadopsas thaliana (L.) Heynh.
的研究中，AG 同源基因均有类似的表达特征，
拟南芥 AGL15 基因有控制拟南芥蕾期长短的作
用，当该基因过表达时，拟南芥花蕾期延长且不
易开花。这些基因在将要产生雄蕊和心皮原基的
分生组织、雄蕊和心皮原基、雄蕊和心皮以及胚
珠中表达。在对葡萄 AGL15 基因的研究中发现
其在胚珠中特异表达，表明葡萄 AGL15 有类似
AGAMOUS 基因的功能。定量 PCR 分析表明，
Lm-AGL15 基因在湘蕾型花蕾中高度表达且远高
于常规型花蕾中的表达量，与 AGL15 基因在拟
南芥花中的表达类似，与相同属葡萄 AGL15 基
因的表达一致，推测 Lm-AGL15 基因在灰毡毛忍
冬蕾期延长发育的过程中具有重要的调控作用。
这也丰富了 D 类基因在其他植物中的分布[24]。
因此获得 Lm-AGL15 基因的 cDNA 全长序列，
并利用生物信息学对Lm-AGL15基因的功能域和结
构 进 行 分 析 和 预 测 ， 发 现 Lm-AGL15 具 有
MADS-box 家族基因典型特征，为对于探明一些蕾
期延长型突变的分子机制和利用基因调控技术进行
蕾期延长育种具有重要意义。同时为开展该基因的
表达研究，进一步确定其功能奠定了基础[25]。
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250 bp
100 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 4 期 2016 年 2 月

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