全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·281·
益气养阴活血中药减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤作用研究
李玉红，李妍妍，樊官伟，周 昆，段真珍，于佳慧，高秀梅*
天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室，天津 300193
摘 要：目的 研究益气养阴活血中药（参麦注射液与丹参注射液联合应用，YYH）通过激活 PI3K-Akt与 ERK1/2 信号通
路，抑制 mPTP 开放，减轻心肌缺血再灌注（I/R）损伤，发挥心肌保护作用。方法 应用大鼠离体心脏 I/R 损伤模型，灌
流 2.5、5、10 μL/mL YYH 及 PI3K特异性抑制剂 LY294002，检测心脏功能指标、灌流液肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）
活性、TTC染色观察心肌梗死面积、透射电镜观察心肌超微结构、Western blotting检测相关蛋白表达。YYH预处理离体心
脏后进行 I/R，分离心肌线粒体，以 mPTP 特异性抑制剂环孢素 A（CsA）作对照，检测线粒体通透性转换孔（mPTP）开放
情况；药物与线粒体孵育后检测 mPTP开放。结果 YYH 10 μL/mL 预处理能改善离体心脏功能指标，减少心肌梗死面积，
减轻心肌组织超微结构损伤，5、10 μL/mL 降低心脏灌流液中 CK、LDH活性；其改善心功能指标、减少心肌梗死面积的作
用被 LY294002部分或完全抵消；YYH处理后心肌组织 p-Akt、p-ERK1/2、p-GSK-3β 蛋白表达上调，LY294002阻断了 YYH
诱导的 p-Akt、p-GSK-3β 蛋白表达上调；在外源性钙刺激下，YYH预处理组 mPTP比模型组更容易开放；YYH、参麦注射
液能够直接抑制 mPTP 开放。结论 YYH预处理通过激活 PI3K-Akt与 ERK1/2 信号通路，抑制 mPTP 开放，减轻心肌 I/R
损伤，发挥心肌保护作用；其抑制 mPTP开放的作用机制与 CsA不完全相同。
关键词：参麦注射液；丹参注射液；心肌缺血再灌注损伤；线粒体通透性转换孔；PI3K-Akt；ERK1/2
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)02 - 0281 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.02.017
Cardioprotective effects of Yiqi Yangyin Huoxue Injection against
ischemia-reperfusion injury in isolated hearts of rats
LI Yu-hong, LI Yan-yan, FAN Guan-wei, ZHOU Kun, DUAN Zhen-zhen, YU Jia-hui, GAO Xiu-mei
Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine, Institute of Traditional Chinese Medicine Research, Tianjin University
of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Abstract: Objective To clarify the cardioprotective effects of Yiqi Yangyin Huoxue (YYH) Injection exert against ischemia-reperfusion
(I/R) injury, and the mechanisms involving activation of specific survival signals reperfusion injury salvage kinase (PI3K-Akt pathway and
ERK1/2 pathway), hence inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening (mPTP). Methods A Langendorff model of
myocardial ischemia-reperfusion injury was employed. The rats were randomly divided into seven groups: control group, I/R group, YYH
2.5, 5, and 10 μL/mL groups, LY294002 + YYH 10 μL/mL group, and LY294002 group. The cardiac parameters of left ventricular
developed pressure (LVDP), maximal rise/fall of left ventricular pressure (± dp/dtmax), and rate-pressure product (RPP) were monitored.
Creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) released from effluents were measured. Infarct size was estimated by TTC
staining. Transmission electron microscopy (TEM) was performed to assess morphological difference between cardiac mitochondrial
isolated I/R rats and YYH pretreated rats. Western blotting was used to determine some protein expression. MPTP opening in mitochondria
isolated from Langendorff rat hearts pretreated with YYH was measured. Incubation of isolated cardiac mitochondria with YYH and
mPTP opening was measured. Results YYH 10 μL/mL can significantly improve ventricular function, ameliorate the level of myocardial
tissue lesions. YYH (5 and 10 μL/mL) reduced CK and LDH release. And these protections were accompanied by a significant increase in
p-PKB/Akt, p-ERK1/2, and p-GSK-3β (Ser-9). LY294002 abolished the protective effects of YYH on cardiac function and infarct size and
inhibited YYH-induced phosphorylation of PKB/Akt and GSK-3β. MPTP opening in mitochondria isolated from YYH-pretreated
occurred more readily in vitro than I/R mitochondria. YYH (2.5, 5, 10, and 20 μL/mL), Shenmai injection (2.5, 5, 10, and 20 μL/mL)

收稿日期：2015-06-15
基金项目：“973”计划项目（2012CB518404）；国家自然科学基金资助项目（81202779）
作者简介：李玉红（1976—），女，河北武安人，副研究员，研究方向为心血管、代谢性疾病中药药理。Tel: (022)59596163 E-mail: yhltcm@126.com
*通信作者 高秀梅 Tel: (022)59596168 E-mail: yanjiuyuanbangongshi@gmail.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·282·
resulted in a significant inhibition of Ca2+-induced mitochondrial swelling. Conclusion YYH produces direct cardioprotective actions.
Inhibition of mPTP is a key event by which it mediates myocardial protection against I/R injury. And this effects involve activation of
PI3K-Akt and ERK1/2 signal pathway. The mechanism of its action is different from that of CsA.
Key words: Shenmai Injection; Danshen Injection; myocardial ischemia reperfusion injury; mPTP; PI3K-Akt; ERK1/2

益气养阴活血中药（参麦注射液与丹参注射液联
合应用，YYH）临床常用于治疗休克、冠心病、心
肌缺血再灌注（I/R）损伤、心力衰竭、急性脑梗死
等[1-4]。研究显示，急性心肌梗死患者冠状动脉介入
治疗后早期联合应用参麦注射液与丹参注射液能够
降低患者丙二醛（MDA）水平、升高超氧化物歧化
酶（SOD）活性，减少白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏
死因子-α（TNF-α）等细胞因子，减轻炎症反应，减
轻心肌 I/R损伤，对缺血心肌具有一定的保护作用[1]。
线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability
transition pore，mPTP）是存在于线粒体内膜的一种
非特异性通道，众多研究证实，mPTP 开放是引起
心肌 I/R 损伤的关键因素，缺血心肌的功能恢复也
与 mPTP开放程度相关，故抑制其开放成为心肌保
护作用的最终效应器[5-6]。导致 mPTP开放的因素主
要包括线粒体钙超载、线粒体源性活性氧类物质爆
发产生引起的脂质过氧化反应。PI3K-Akt和ERK1/2
信号通路成为心肌 I/R 损伤中介导心肌保护的重要
信号转导通路[7-8]，再灌注期间激活 PI3K-Akt 及
ERK1/2 信号通路，能够抑制 mPTP 开放，在线粒
体水平发挥心肌保护作用[9-10]。
大鼠离体心脏 I/R 损伤模型通过灌流液的调整
或阻断模拟全心 I/R，是常用的研究 I/R的体外模型。
本实验应用此模型，观察 YYH对心脏的保护作用，
及其通过激活 PI3K-Akt与 ERK1/2信号通路，抑制
mPTP开放，发挥心肌保护作用的机制。
1 材料
1.1 动物
健康雄性 SD大鼠，体质量 300～340 g，北京
华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号
SCXK（京）2009-0004。
1.2 药品与试剂
YYH，即参麦注射液（批号 1107201）、丹参注
射液（批号 1208162）按 1∶1配制，两种注射液均
由正大青春宝药业有限公司提供。环孢素 A（CsA，
批号 C3662-5mg）、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）、
PD98059、钙离子载体 A23187，Sigma-Aldrich公司；
肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，中
生北控生物科技股份有限公司；Akt、 p-Akt
（Ser-473）、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK-3β、p-GSK-3β
（Ser-9）抗体，Cell Signaling Technology，Inc.；PI3K
选择性抑制剂 LY294002（LY），Apollo Scientific有
限公司；线粒体提取试剂盒、抗霉素，北京索莱宝
科技有限公司。
Krebs-Henseleit（K-H）缓冲液（mmol/L）：NaCl
118、NaHCO3 24.0、KCl 4.7、MgSO4 1.2、KH2PO4
1.2、葡萄糖 11.1、CaCl2 2.5，实验前 1～2 h通入
95% O2、5% CO2混合气体，维持 pH值 7.2～7.4。
线粒体肿胀液（mmol/L）：① KSCN 150、3-(N-
吗啉基)丙磺酸 20、Tris 10、次氮基三乙酸 2、鱼藤
酮 0.5 μmol/L、抗霉素 0.5 μmol/L、A23187 2 μmol/L
（pH值为 7.2）。② KCl 120、Tris或 Tris-HCl 10、
丙磺酸 20、KH2PO4 5。
线粒体重悬液（mmol/L）：蔗糖 320、Tris-HCl
或 Tris 10（pH值为 7.4）。
1.3 仪器
Langendorff离体心脏灌流系统、MLP844压力
换能器，澳大利亚 ADInstrument Pty有限公司；日
立 7020全自动生化分析仪，日本 HITACHI公司；
Philips EM400ST 型透射电子显微镜，荷兰 Philips
Tecnai 公司；LKB-V 型超薄切片机，瑞典 LKB 公
司；UC750超声波破碎仪，美国 SONICS公司；蛋
白电泳转印系统、多板制胶机，BIO-RAD；Enspire
多功能读板机，美国 Perkinselmer公司。
2 方法
2.1 大鼠离体心脏的制备
按照文献方法制备大鼠离体心脏[11]，戊巴比妥
钠（50 mg/kg，ip）麻醉大鼠，开胸迅速取出心脏，
置于 4 ℃ K-H 缓冲液中，剥离残留的肺脏或周围
组织，立即将心脏连接到灌流装置，并将主动脉与
灌流装置针头固定，K-H缓冲液逆行灌流。MLP844
压力换能器监测冠脉灌注压。将一自制的封闭球囊
置于左心室，进行等容心室内压力监测，反映心脏
功能[12]。调节球囊大小，使左心室舒张压（LVEDP）
维持在 0.66～1.33 kPa，心脏功能用 LVEDP、左心
室收缩压（LVSP）、左室发展压（LVDP）、左心室
内压最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室内压最大下
降速率（−dp/dtmax）及心率压力乘积（RPP）等指
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·283·
标进行评价[13]。调节冠脉流量在 10～15 mL/min内，
使灌注压维持在 8.64 kPa左右，进行恒压灌注[12]。
2.2 分组及 I/R模型的制备
采用全心停灌 30 min，再灌注 60 min的方法建
立 I/R模型。具体灌流方法：对照组以 K-H缓冲液
灌流 120 min；模型组以 K-H 缓冲液平衡心脏 30
min，停止灌流 30 min，再灌注 60 min；YYH低、
中、高剂量组以 K-H缓冲液平衡心脏 20 min，用含
终体积分数为 2.5、5、10 μL/mL YYH的 K-H缓冲
液灌流心脏 10 min，灌流冲洗，停灌、再灌注同模
型组；YYH＋LY 组：心脏平衡 15 min 后，用含
15 μmol/L LY的 K-H液灌流心脏 15 min，后 10 min
同时灌流 10 μL/mL YYH，停灌、再灌注同模型组；
LY组：心脏平衡 15 min后，用含 15 μmol/L LY的
K-H液灌流心脏 15 min，停灌、再灌注同模型组；
mPTP开放实验，设立阳性药组：心脏平衡 25 min
后，1 μmol/L 的 mPTP 特异性抑制剂 CsA 灌流 5
min，停灌、再灌注同模型组。停止灌流期间，心
脏用 37 ℃ K-H液恒温浸泡。
2.3 心脏功能的测定
实验分组为对照组，模型组，YYH低、中、高
剂量组，YYH＋LY组，LY组，方法同“2.2”项。
检测±dp/dtmax、LVSP、LVEDP、心率（HR），计算
LVDP、RPP。
LVDP＝LVSP－LVEDP
RPP＝LVDP×HR
2.4 心脏流出液 CK、LDH活性的测定
实验分组为对照组，模型组，YYH 低、中、
高剂量组，方法同“2.2”项。分别在心脏灌注平衡
20 min，再灌注 5、10、20、30、60 min收集冠脉
流出液，全自动生化分析仪测定 CK、LDH活性。
2.5 TTC染色观察心肌梗死面积
实验分组为模型组、YYH 高剂量组、YYH＋
LY组，方法同“2.2”项。TTC染色法[14]确定心肌
梗死面积。−20 ℃冷冻心脏 20 min，取出后沿心脏
短轴切成横切面 1～2 mm厚的切片。切片放入 1%
TTC（pH 7.4，温度 37 ℃）中染色 15 min，10%甲
醛固定隔夜，数码相机拍照。砖红色为正常区域，
白色或灰白色为梗死区域。
2.6 心肌超微结构观察
实验分组为对照组、模型组、YYH高剂量组，
方法同“2.2”项。取约 1.5 mm3大小新鲜固定部位
心尖部组织，3%戊二醛固定（0.1 mol/L PBS，pH 7.2，
4 ℃）过夜，磷酸缓冲液（0.1 mol/L PBS，pH 7.2，
4 ℃）漂洗 10 min，共漂洗 3次，用 1%四氧化锇
固定 2 h，再用磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L PBS，pH
7.2，4℃）漂洗 15 min，共漂洗 3次，经 30%～100%
梯度乙醇（4 ℃）逐级脱水，以包埋剂 SPI-PON 812
环氧树脂包埋，40 ℃ 24 h浸透，60 ℃ 48 h聚合，
LKB-V 型超薄切片机制作超薄切片，柠檬酸铅-乙
酸双氧铀双染色后，在 Philips EM400ST型透射电
子显微镜下观察心肌细胞超微结构。
2.7 Western blotting检测心肌组织蛋白表达
再灌注 10 min，迅速取下心脏，取左室组织约
100 mg，置于预冷的组织裂解液中尽快剪碎，用组
织匀浆机制成 10%匀浆，匀浆液 4 ℃，14 000×g
离心 15 min，吸取上清液，Bradford法进行蛋白浓
度测定。每 4 μL 蛋白样品加入 1 μL SDS-PAGE蛋
白上样缓冲液混合，沸水 3～5 min，使蛋白充分变
性，取 40 μg样品上样至 12.5% SDS-PAGE凝胶电
泳，随后电转膜至硝化纤维膜，Western封闭液封闭
6 h，分别用 Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2 及
GSK-3β、p-GSK-3β 一抗 4 ℃孵育 24 h，二抗室温
缓慢振荡孵育 2 h，显色后底片进行数码拍摄，并用
ImageJ 1.37软件进行半定量灰度分析。
2.8 心肌线粒体的制备
采用差速分级离心法分离线粒体[15]。将大鼠左
心室剪为碎块，匀浆，1 000×g离心 5 min；取上清，
1 000×g再次离心 5 min；取上清 12 000×g离心 10
min，线粒体沉淀在管底；加入线粒体重悬液重悬沉
淀，1 000×g离心 5 min；取上清，12 000×g离心
10 min，高纯度的线粒体沉淀在管底。所有操作均
低温进行，考马斯亮蓝测定蛋白量。
2.9 无能量条件mPTP开放的检测
取下 I/R 心脏制备线粒体，mPTP 的开放以线
粒体在 200 μmol/L CaCl2作用下肿胀产生的 520 nm
处吸光度（A）值的下降来反映[16]。取线粒体用线
粒体肿胀液①稀释至 0.5 g/L蛋白，于 25 ℃，200
μmol/L CaCl2作用于线粒体，连续观察 A值的变化。
该变化反映线粒体肿胀程度，提示 mPTP的开放情
况。当 mPTP 开放时，导致线粒体通透性增加，肿
胀液中的溶质内流入线粒体基质，引起线粒体膨胀，
体积增大，外膜破裂，A值下降[17]。
提取对照组、缺血 30 min/再灌注 3、120 min心
脏线粒体，进行线粒体在无能量条件下mPTP开放实
验以确定再灌注时间；进而按照“2.2”项方法设置模
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·284·
型组、YYH 高剂量组、阳性药组，进行线粒体在无
能量条件下mPTP开放实验（再灌注时间为 3 min）。
2.10 药物与线粒体孵育检测 mPTP的开放
mPTP 的开放以线粒体肿胀产生的 A值下降来
反映[15,17]。制备正常大鼠心脏线粒体，取线粒体与
0、2.5、5、10、20 μL/mL YYH或参麦注射液、丹
参注射液体外 25 ℃孵育 10 min，1 μmol/L CsA和
线粒体孵育 5 min作为阳性药组。用线粒体肿胀液
②稀释至 0.25 g/L蛋白，200 μmol/L CaCl2作用于线
粒体诱发 mPTP的开放，连续观察 A值的变化，反
映 mPTP的开放情况。
2.11 统计学处理
实验数据用 ±x s表示，应用SPSS 17.0统计软件，
多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用 t检验。
3 结果
3.1 对离体心脏功能的影响
再灌注 5、10、20、30、40、60 min，模型组 RPP、
±dp/dtmax绝对值、LVDP显著降低。YYH 10 μL/mL
组上述指标显著升高，与模型组比较，差异显著
（P＜0.05、0.01）。YYH与 LY同时应用，YYH对心
脏功能指标的改善作用部分或完全抵消；LY 单独应
用无显著影响，结果见表 1～4。
表 1 YYH对大鼠离体心脏再灌注不同时间 RPP的影响
Table 1 Effects of YYH on RPP at different time points after reperfusion of rat isolated heart
组别
剂量/
(μL·mL−1)
n
RPP/(kPa·次·min−1)
基础水平 再灌注5 min 再灌注10 min 再灌注20 min 再灌注30 min 再灌注40 min 再灌注60 min
对照 — 6 2 824.4± 359.8 2 310.4±518.3 2 240.0±548.2 2 217.9±453.5 2 176.9±582.0 2 137.4±554.6 2 118.4±543.8
模型 — 12 3 153.0± 806.8 215.1±141.9## 232.7±212.2## 363.3±270.0## 430.5±307.6## 421.0±359.7## 413.3±249.5#
YYH 2.5 6 2 930.5±1 225.9 151.1± 66.0 266.6± 68.8 444.6±175.7 485.2±221.1 469.6±254.4 360.7±218.1
5 6 3 468.3±1 088.2 204.3± 29.3 212.1± 77.2 303.4±103.1 503.2±185.8 583.8±258.5 553.9±180.9
10 11 2 962.4± 504.1 559.7±522.0* 668.3±415.8* 795.1±402.6* 842.4±517.4* 860.5±590.2* 772.3±480.2*
YYH＋LY 10＋15 6 2 881.3±1 015.5 380.8±198.4 425.4± 47.6 452.7±195.7 345.8±234.0▲ 338.3±232.6▲ 319.9±341.8▲
LY 15 μmol·L−1 6 2 882.0± 567.4 229.5±139.0 253.6±211.3 280.2±219.7 270.1±202.3 367.1±307.6 461.6±415.3
与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05；与 YYH 10 μL·mL−1组比较：▲P＜0.05，下同
#P < 0.05 ##P＜0.01 vs control group; *P < 0.05 vs model group; ▲P < 0.05 vs YYH 10 μL·mL−1 group, same as below
表 2 YYH对大鼠离体心脏再灌注不同时间+dp/dtmax的影响
Table 2 Effects of YYH on +dp/dtmax at different time points after reperfusion of rat isolated heart
分组
剂量/
(μL·mL−1)
n
（+dp/dtmax)/(kPa·s−1)
基础水平 再灌注 5 min

再灌注 10 min 再灌注20 min 再灌注30 min 再灌注40 min 再灌注60 min
对照 — 6 275.7± 43.4 255.4±60.0 248.5±60.0 246.4±54.8 243.9±47.7 237.8±45.4 237.3±44.2
模型 — 12 292.2± 77.6 19.9±11.7## 20.1±13.5## 31.3±21.5## 40.7±32.2## 45.0±39.4## 40.1±27.2##
YYH 2.5 6 258.9± 86.9 24.2±18.0 24.4±13.5 51.0±14.7 62.6±21.0 58.6±25.2 52.3±27.7
5 6 302.0±135.7 19.0±12.0 19.5±12.3 28.7±12.6 49.6±23.2 60.4±32.9 58.9±25.8
10 11 278.1± 81.0 59.2±59.9* 59.0±63.6* 67.9±70.6* 84.7±78.0* 92.6±70.9* 88.1±56.8**
YYH＋LY 10＋15 6 316.3±107.7 26.2±19.0 41.2±23.1 40.9±20.6 33.5±21.9▲▲ 32.1±18.7▲▲ 25.5±16.5▲▲
LY 15 μmol·L−1 6 280.9± 43.6 26.5±19.7 27.0±23.4 26.8±23.6 37.4±24.8 43.7±36.4 58.6±50.2
与模型组比较：**P＜0.01；与 YYH 10 μL·mL−1组比较：▲▲P＜0.01，下同
**P < 0.01 vs model group; ▲▲P < 0.01 vs YYH 10 μL·mL−1 group, same as below
3.2 对冠脉流出液中 CK、LDH水平的影响
再灌注 5、10、20、30、60 min，模型组 CK、
LDH 释放量显著升高（P＜0.01）。再灌注 60 min
时，YYH 5 μL/mL组 CK、LDH释放量显著降低，
再灌注 20、60 min时，YYH 10 μL/mL组 CK、LDH
释放量显著降低，与模型组比较，差异显著（P＜
0.05、0.01）。结果见图 1。
3.3 对心肌梗死面积的影响
1% TTC染色后，模型组心脏缺血区域呈白色或
灰白色，YYH 10 μL/mL组白色或灰白色区域减少，
鲜红色或砖红色区域增多。YYH 与 LY 同时灌流，
YYH对心脏的保护作用被部分或完全抵消，见图 2。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·285·
表 3 YYH对大鼠离体心脏再灌注不同时间−dp/dtmax的影响
Table 3 Effects of YYH on −dp/dtmax at different time points after reperfusion of rat isolated heart
分组
剂量/
(μL·mL−1)
n
(−dp/dtmax)/(kPa·s−1)
基础水平 再灌注5 min 再灌注10 min 再灌注20 min 再灌注30 min 再灌注40 min 再灌注60 min
对照 — 6 −173.9±37.1 −169.1±51.2 −163.3±50.1 −158.6±43.9 −156.2±40.8 −149.6±40.8 −144.8±40.0
模型 — 12 −191.4±57.8 −17.3± 8.8# −17.2±10.3# −24.4±14.6# −29.9±21.7# −31.7±24.6# −29.0±16.0#
YYH 2.5 6 −186.0±62.0 −24.1±13.7 −25.5±17.6 −40.1±15.0 −47.9±15.9 −45.6±18.5 −42.4±21.1
5 6 −221.9±82.9 −17.8± 8.3 −16.4± 4.8 −23.4± 7.9 −34.7±14.9 −39.0±16.7 −37.2±12.0
10 11 −205.0±53.4 −41.5±29.4* −47.6±37.8* −51.5±41.8* −55.9±43.5* −60.4±38.0* −56.8±30.0*
YYH＋LY 10＋15 6 −200.6±74.7 −29.8±23.7 −40.3±14.5 −36.6±13.8 −27.1±15.6▲ −27.1±17.5▲ −22.0±15.7▲
LY 15 μmol·L−1 6 −178.8±29.1 −18.3±10.2 −19.2±14.4 −20.3±15.6 −27.4±16.6 −31.2±21.0 −44.0±30.3
表 4 YYH对大鼠离体心脏再灌注不同时间 LVDP的影响
Table 4 Effects of YYH on LVDP at different time points after reperfusion of rat isolated heart
分组
剂量/
(μL·mL−1)
n
LVDP/kPa
基础水平 再灌注5 min 再灌注10 min 再灌注20 min 再灌注30 min 再灌注40 min 再灌注60 min
对照 — 6 9.6±1.2 8.6±2.0 8.3±2.0 8.2±1.7 8.1±1.5 8.0±1.6 7.8±1.6
模型 — 12 11.2±3.3## 1.4±0.8# 1.2±0.6# 1.6±0.9# 1.9±1.3# 2.1±1.5# 1.8±1.0#
YYH 2.5 6 10.4±3.6 1.9±1.1 1.7±1.2 2.7±0.8 3.2±0.9 3.1±1.2 2.9±1.4
5 6 11.2±3.6 1.9±0.3 1.5±0.7 1.5±0.7 2.1±1.4 2.1±1.2 2.0±1.1
10 11 10.7±2.6 3.8±2.7** 3.6±2.7** 2.9±1.3* 3.7±2.7* 4.0±2.4** 3.7±1.9**
YYH＋LY 10＋15 6 11.2±3.2 2.2±1.8 2.9±1.4 2.9±1.3 2.0±1.3▲ 2.2±1.2▲ 2.0±1.0▲
LY 15 μmol·L−1 6 9.9±2.6 2.0±1.0 1.8±1.0 1.8±1.1 2.2±1.1 2.3±1.4 3.4±1.5



图 1 YYH对大鼠离体心脏冠脉流出液体 CK和 LDH水平的影响 ( x±s, n = 6)
Fig. 1 Effects of YYH on CK and LDH levels in coronary effluent of rat isolated heart ( x±s, n = 6)

图 2 离体大鼠心脏 TTC染色
Fig. 2 TTC staining of rat isolated heart
3.4 对心肌超微结构的影响
对照组大鼠心肌微观结构基本正常，细胞无水
肿，细胞核无肿胀，核膜完整，异染色质和常染色
质清晰可见。肌纤维排列较整齐，肌丝和肌小节结
构清晰，可见 A带、I带与 H 带及 M线与 Z线；
线粒体膜完整，聚集在一起，嵴密集；糖原颗粒较
多；心肌间小血管结构正常，偶有肌膜肿胀呈指状
突起现象。模型组心肌细胞水肿，肌浆网扩张，空
泡化；细胞核固缩、周边凝集，核染色质溶解；肌
小节明暗带模糊不清，肌丝多发性灶性坏死、溶解
对照
模型
YYH 2.5 μL·mL−1
YYH 5.0 μL·mL−1
YYH 10.0 μL·mL−1
# # # #
#
**
600
400
200
0
**
200
150
100
50
0
*
5 10 20 30 60

C
K
/(U
·L
−1
)
5 10 20 30 60

对照
模型
YYH 2.5 μL·mL−1
YYH 5.0 μL·mL−1
YYH 10.0 μL·mL−1
LD
H
/(U
·L
−1
) # #
#
#
#
*
**
再灌注时间/min
**
再灌注时间/min
模型
YYH
YYH＋LY
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·286·
断裂，部分细胞肌膜崩解；线粒体肿胀、嵴溶解，
可见灶性空化，基质内有钙盐样致密颗粒。YYH 10
μL/mL组病变显著减轻，肌原纤维排列整齐，偶见
小区域灶性溶解，肌小节结构清晰，线粒体稍肿胀，
嵴规则致密；肌浆网轻度扩张。结果见图 3。
3.5 对 Akt、ERK1/2、GSK-3β 及其磷酸化蛋白表
达的影响
Western blotting结果显示，各组 Akt、ERK1/2、
GSK-3β 蛋白表达无显著差异。与对照组比较，模
型组 p-Akt/Akt、(p-ERK1/2)/ERK1/2蛋白表达升高；
YYH 预处理后 p-Akt/Akt、(p-ERK1/2)/ERK1/2、
p-GSK-3β/GSK-3β 升高，提示 YYH能上调 3种蛋白
磷酸化表达；YYH＋LY组 p-Akt、p-GSK-3β 蛋白表
达显著降低，提示 LY 阻断了 YYH 诱导的 p-Akt、
p-GSK-3β 蛋白表达上调，结果见图 4。
3.6 对 mPTP开放的影响
3.6.1 YYH预处理对离体 I/R心脏分离的线粒体无
能量条件下mPTP开放的影响 对照组心脏线粒体



对照 模型 YYH 10 μL·mL−1
图 3 透射电镜观察心肌超微结构改变
Fig. 3 Transmission electron micrographs of myocardial ultrastructure






图 4 离体大鼠心脏 p-Akt、Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、p-GSK-3β、GSK-3β 蛋白表达
Fig. 4 Expression of p-Akt, Akt, ERK1/2, and p-ERK1/2 protein in rat isolated heart
* 0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
p-
A
kt
/A
kt
(n
=
3
)
对照 模型 YYH YYH＋LY
p-Akt
Akt
GAPDH



(p
-E
RK
1/
2)
/(
ER
K
1/
2
)(n
=
3
)
对照 模型 YYH YYH＋LY

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
▲▲
#
**
p-ERK1/2
ERK1/2
GAPDH



对照 模型 YYH

对照 模型 YYH
对照 模型 YYH YYH＋LY LY

×3 400
×11 000
p-GSK-3β
GSK-3β
GAPDH



中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·287·
A 值显著下降，线粒体肿胀率很高，提示在外源性
钙刺激下 mPTP大量开放；再灌注 120 min组线粒
体肿胀率较低，与对照组比较，差异显著（P＜0.01）。
再灌注 3 min组线粒体肿胀率较高，与对照组比较，
差异不显著。结果见图 5。选择再灌注 3 min进行
接下来的实验。
10 μL/mL YYH组心脏分离线粒体，A值显著下
降，与模型组比较，更容易开放，差异显著（P＜0.01）；
CsA部分抑制了 A值显著下降，与模型组比较，差
异显著（P＜0.05），结果见图 6。



图 5 缺血再灌注损伤心肌线粒体去能量条件下 mPTP 开
放实验 ( x±s, n = 4)
Fig. 5 mPTP opening in isolated de-energised mitochondria
with I/R injuried myocardia ( x±s, n = 4)


图 6 YYH对缺血再灌注损伤心肌线粒体 mPTP开放的影
响 ( x±s, n = 6)
Fig. 6 Effects of YYH treatment of perfused rat hearts on
mPTP opening in subsequently isolated mitochondria ( x±
s, n = 6)
3.6.2 YYH、参麦注射液、丹参注射液与线粒体孵
育对 mPTP开放的影响 CsA、YYH（2.5、5、10、
20 μL/mL）、参麦注射液（2.5、5、10、20 μL/mL）
均显著抑制 A值下降，线粒体肿胀率与对照组比较，
差异显著（P＜0.01）。丹参注射液（2.5、5、10、20
μL/mL）对线粒体肿胀率无显著影响。结果见图 7。
4 讨论
参麦注射液可以显著降低急性心肌梗死患者
病死率、心衰发生率、再灌注心律失常发生率等[18]。
丹参具有抑制血小板聚集、降低血黏度、改善微循
环、保护缺血缺氧心肌细胞的作用。二者合用具有



图 7 YHH、参麦注射液和丹参注射液体外对正常心肌线粒体 mPTP开放的影响 ( x±s, n = 8)
Fig. 7 Effects of YYH, Shenmai Injection, and Danshen Injection on mPTP opening in isolated mitochondria ( x±s, n = 8)
益气养阴、活血化瘀的功效，符合祖国医学“扶正
祛邪”的治疗原则。药物处理后的离体心脏提取线
粒体，常用“无能量条件 mPTP 开放实验”，考察
药物对 mPTP的抑制情况，文献报道[19]，心脏遭受
I/R 损伤后提取的线粒体在 Ca2+诱发下，A 值显著
下降，而心脏保护药物、缺血预处理、低温预处理
能显著抑制 A值下降，抑制 mPTP的开放。也有文
献报道[20]，缺血预处理后提取的心脏线粒体在体外
更容易开放。
故首先提取了未经缺血、缺血后再灌注 3 min、
再灌注 120 min心脏线粒体，进行了 mPTP开放实
验，结果提示，未经缺血的心脏线粒体，在外源
性钙刺激下 A 值急剧降低、mPTP 大量开放；再
灌注 120 min 的线粒体 A 值下降不明显，可能由
于 mPTP 在体时已经基本全部开放，细胞已经发
生凋亡或坏死。并参考相关文献报道[19,21]，故选
取了缺血 30 min/再灌注 3 min进行离体心脏给药后
mPTP开放实验。结果表明，YYH处理的离体心脏
对照 CsA 2.5 5 10 20
YYH/(μL·mL−1)


4
3
2
1
0
模型 CsA YYH
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
对照 3 120
再灌注/min
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 线
粒
体
肿
胀
率
/(×
10
4 ·A
·s−
1 ) 2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
对照 YYH 2.5 5 10 20
参麦注射液/(μL·mL−1)

对照 YYH 2.5 5 10 20
丹参注射液/(μL·mL−1)

#
**
*
#
# # #
#
#
#
#
#
# #
细
胞
肿
胀
率
/(×
10
4 ·A
·s−
1 )
细
胞
肿
胀
率
/(×
10
4 ·A
·s−
1 )
线
粒
体
肿
胀
率
/(×
10
4 ·A
·s−
1 )
线
粒
体
肿
胀
率
/(×
10
4 ·A
·s−
1 )
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·288·
mPTP 更容易开放，表明其含有较多未开放的线粒
体，提示 YYH 在体时可能减少了诱发 mPTP 开放
的因素，如再灌注期间活性氧类物质的产生及线粒
体钙超载，从而“间接”抑制了 mPTP开放，减少
了其凋亡或坏死的发生，保护了线粒体完整性；而
CsA 抑制 mPTP 开放的机制可能是 CsA 通过和
CyP-D的结合，抑制 CyP-D氨基脯氨酸顺反异构酶
活性，阻止 CyP-D和 ANT的结合，防止了有利于
mPTP开放的 ANT胞浆构象的形成，因而其处理过
的心脏分离的线粒体对外源性 Ca2+不敏感[22]，即使
在体外 mPTP也不容易开放。结果提示，YYH抑制
mPTP开放的作用机制可能与 CsA不完全相同。
除“间接”抑制 mPTP开放外，YYH也可能通
过作用于 mPTP的结构蛋白，提高了线粒体对引起
mPTP 开放因素刺激的耐受性，从而“直接”抑制
mPTP开放，如同 CsA一样。为了进一步研究 YYH
对 mPTP的抑制作用及发挥作用的主要药物，进行
了 YYH、参麦及丹参注射液与线粒体孵育后 mPTP
开放检测。结果显示，YYH、参麦注射液与线粒体
孵育能直接抑制 mPTP开放。
mPTP 开放是引起心肌 I/R 损伤的关键因素，
PI3K-Akt和 ERK1/2通路是在其损伤中介导心肌保
护的重要信号转导通路，再灌注期间激活 PI3K-Akt
及 ERK1/2信号通路，能够抑制 mPTP开放，在线
粒体水平发挥心肌保护作用。结果显示，YYH能够
改善离体心脏 I/R 后血流动力学恢复，降低 CK、
LDH的释放，减少心肌梗死面积，减轻心肌组织超
微结构损伤。当 YYH与 PI3K选择性抑制剂 LY同
时应用时，YYH改善血流动力学、减少心肌梗死面
积的作用被部分或完全消除，YYH 能上调心肌
p-Akt、p-ERK1/2、p-GSK-3β 蛋白表达，而 LY 阻
断了 YYH诱导的 p-Akt、p-GSK-3β 蛋白表达上调，
可见增加 Akt、ERK1/2及 GSK-3β 磷酸化蛋白表达
可能在 YYH减轻心脏 I/R损伤中发挥了重要作用。
综上所述，YYH 可能主要通过激活 PI3K/Akt
和 ERK1/2信号通路，抑制 mPTP的开放，在线粒
体水平发挥心肌保护作用，从而减轻心脏 I/R损伤；
其抑制 mPTP开放的作用机制与 CsA不完全相同；
发挥直接抑制 mPTP开放的药物是参麦注射液。
参考文献
[1] 耿庆信, 朱兴雷, 张兴华, 等. 参麦注射液及复方丹参
注射液合用对急性心肌梗死患者介入治疗后再灌注损
伤的影响 [J]. 中国中西医结合杂志 , 2004, 24(6):
496-499.
[2] 崔文鹏, 杜 冰, 曲 锐. 参麦与丹参注射液治疗冠心
病心绞痛的 Meta 分析 [J]. 时珍国医国药 , 2010,
21(11): 2990-2991.
[3] 张存林, 董耀荣. 参麦注射液联合丹参注射液治疗心
力衰竭的疗效观察 [J]. 中国实用医药, 2008, 3(18):
137-138.
[4] 舒建中, 王恰如. 参麦注射液和复方丹参注射液治疗
急性脑梗死的 Meta 分析 [J]. 现代中西医结合杂志,
2008, 17(7): 973-976.
[5] Halestrap A P, Clarke S J, Javadov S A. Mitochondrial
permeability transition pore opening during myocardial
reperfusion-a target for cardioprotection [J]. Cardiovasc
Res, 2004, 61(3): 372-385.
[6] Heusch G, Boengler K, Schulz R. Inhibition of
mitochondrial permeability transition poreopening: the
holy grail of cardioprotection [J]. Basic Res Cardiol,
2010, 105(2): 151-154.
[7] Hauseuloy D J, Tsang A, Yellon D M, et al. The reperfusion
injury salvage kinase pathway: A common target for both
ischemic preconditioning and postconditioning [J]. Trends
Cardiovasc Med, 2005, 15(2): 69-75.
[8] Hausenloy D J, Tsang A, Mocanu M M, et al. Ischemic
preconditioning protects by activating pro-survival
kinases at reperfusion [J]. Am J Physiol Heart Circ
Physiol, 2005, 288(2): 971-976.
[9] Bopassa J C, Ferrera R, Gateau-Roesch O, et al.
PI3-kinase regulates the mitochondrial transition pore in
controlled reperfusion and postconditioning [J].
Cardiovasc Res, 2006, 69(1): 178-185.
[10] Davidson S M, Hausenloy D, Duchen M R, et al.
Signalling via the reperfusion injury signalling
kinase(RISK)pathway links closure of the mitochondrial
permeability transition pore to cardioprotection [J]. Int J
Biochem Cell Biol, 2006, 38(3): 414-419.
[11] Morrison R R, Teng B, Oldenburg P J, et al. Effects of
targeted deletion of A1 adenosine receptors on
postischemic cardiac function and expression of
adenosine receptor subtypes [J]. Am J Physiol Heart Circ
Physiol, 2006, 291(4): H1875-H1882.
[12] Meng X, Ao L, Brown J M, et al. Nitric oxide synthase is
not involved in cardiac contractile dysfunction in a rat
model of endotoxemia without shock [J]. Shock, 1997,
7(2): 111-118.
[13] Boles Ponto L L, O’Leary D S, Koeppel J, et al. Effect of
acute marijuana on cardiovascular function and central
nervous system pharmacokinetics of [15O] water: effect in
occasional and chronic users [J]. J Clin Pharmacol, 2004,
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

·289·
44(7): 751-766.
[14] Freeman I, Grunwald M A, Robin B, et al. Effect of early
reperfusion on use of triphenyltetrazolium chloride to
differentiate viable from non-viable myocardium in area
of risk [J]. Cardiovasc Res, 1990, 24(2): 109-114.
[15] Tanonaka K, Iwai T, Motegi K, et al. Effects of
N-(2-mercaptopropionyl)-glycine on mitochondrial
function in ischemic-reperfused heart [J]. Cardiovasc
Res, 2003, 57(2): 416-425.
[16] Halestrap A P, Woodfield K Y, Connern C P. Oxidative
stress, thiol reagents, and membrane potential modulate
the mitochondrial permeability transition by affecting
nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase
[J]. J Biol Chem, 1997, 272(6): 3346-3354.
[17] Baines C P, Song C X, Zheng Y T, et al. Protein kinase
Ce interacts with and inhibits the permeability transition
pore in cardiac mitochondria [J]. Circ Res, 2003, 92(8):
873-880.
[18] 黄美施. 参麦注射液对急性心肌梗死病死率及其并发
症影响的Meta分析 [D]. 广州: 南方医科大学, 2010.
[19] Townsend P A, Davidson Sean M, Clarke Samantha J, et
al. Urocortin prevents mitochondrial permeability
transition in responseto reperfusion injury indirectly by
reducing oxidative stress [J]. Am J Physiol Heart Circ
Physiol, 2007, 293(2): H928-H938.
[20] Javadov S A, Clarke S, Das M, et al. Ischaemic
preconditioning inhibits opening of mitochondrial
permeability transition pores in the reperfused rat heart
[J]. J Physiol, 2003, 549(Pt 2): 513-524.
[21] Clarke S J, Khaliulin I, Das M, et al. Inhibition of
mitochondrial permeability transition pore opening by
ischemic preconditioning is probably mediated by
reduction of oxidative stress rather than mitochondrial
protein phosphorylation [J]. Circ Res, 2008, 102(9):
1082-1090.
[22] Halestrap A P, Mcstay G P, Clarke S J. The permeability
transition pore complex: another view [J]. Biochimie,
2002, 84(23): 153-166.