全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月

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香菇多糖 LNT2的提取分离纯化、结构及体外抗肿瘤活性研究
李石军 2，王凯平 1，汪 柳 2，辜 明 2，曾 芳 2，张 玉 2*
1. 华中科技大学同济医学院药学院，湖北 武汉 430030
2. 华中科技大学同济医学院协和医院 药剂科，湖北 武汉 430020
摘 要：目的 从香菇子实体中分离纯化得到精制香菇多糖，并对其结构和体外抗肿瘤活性进行研究。方法 采用碱提-
醇沉法提取香菇粗多糖，并通过脱色、超滤分离纯化得到精制香菇多糖，命名为 LNT2。苯酚-硫酸法测定总糖量，高效凝胶
色谱法测定相对分子质量，紫外光谱检测蛋白质和核酸，旋光度实验测定比旋光度。综合运用酸水解、高碘酸氧化、甲基化
等化学分析法和傅里叶红外光谱、核磁共振光谱等光谱分析法对 LNT2的化学结构进行分析；通过刚果红实验对 LNT2的糖
链构象进行考察；采用四甲偶氮唑盐（MTT）比色法测定 LNT2对小鼠肝腹水瘤 H22细胞增殖的抑制率。结果 经测定香菇
多糖 LNT2为均一组分多糖，其相对分子质量（MW）为 1.852×105、含糖量为 94.99%，比旋光度为＋8.03°；紫外光谱显示
LNT2在 280 和 260 nm 处无吸收峰。综合化学分析和光谱分析推出 LNT2为 β构型的葡聚糖，其主链由 1-3 连接的葡聚糖组
成，分支点位于糖的 6 位，侧链由末端葡萄糖残基组成；刚果红实验表明 LNT2分子在较低浓度 NaOH 溶液中呈三螺旋构象。
体外抗肿瘤实验表明 LNT2 能显著抑制小鼠肝腹水瘤 H22 细胞的增殖，且呈量效依赖性。结论 精制香菇多糖 LNT2 为均一
相对分子质量的多糖组分，其结构为 β 构型 1-3 连接葡聚糖；初步表明 LNT2为三股螺旋结构，且具有一定的抗肿瘤活性，
为其进一步的开发利用奠定了一定的基础。
关键词：香菇多糖；抗肿瘤；构象分析；MTT 法；H22细胞
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)09 - 1232 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.09.007
Isolation, purification, structural elucidation, and antitumor activity in vitro
of lentinan LNT2
LI Shi-jun2, WANG Kai-ping 1, WANG liu2, GU ming2, ZENG fang2, ZHANG Yu2
1. School of Pharmacy, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
2. Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China
Abstract: Objective To purify the lentinan from sporophore of Lentinus edodes and to study the structure and antitumor activity in
vitro of lentinan. Methods A refined lentinan, named LNT2, was isolated from the sporophore of L. edodes by alkali extraction and
alcohol precipitation, and further purified by hydrogen peroxide decoloration and ultrafiltration. The molecular weight and sugar
content of LNT2 were measured by HPLC and phenol-sulfuric acid method, respectively. UV was used to detect the protein and nucleic
acid in LNT2, and specific rotation was detected. The chemical structure of LNT2 was determined by acid hydrolysis, periodate
oxidation, methylation analysis, Fourier infrared spectrum, and NMR experiments. The chain conformation of LNT2 was evaluated by
Congo-red test. The inhibitory effect of LNT2 on H22 tumor cells growth was evaluated using MTT assay. Results The molecular
weight, sugar content, and 20D]α[ value of LNT2 were estimated to be 185 200, 94.99%, and +8.03°, respectively. UV spectrum showed
that there were no peaks at 280 and 260 nm. Chemical and spectroscopic analyses illustrated that LNT2 had a backbone chain of
β-(1→3)-linked glucopyranosyl residues and had branches of single glucosyl stubs at C-6 of terminal glucose sugar residues.
Congo-red test revealed that LNT2 exhibited a triple helix comformation in low concentration of NaOH solution. Results of the
antitumor activity in vitro demonstrated that LNT2 could exhibit the strong effect against the growth of H22 tumor cells and showed a
dose-dependent manner. Conclusion LNT2 is composed of β-(1→3)-linked glucan and has a triple helix comformation. Moreover, LNT2
could present the certain antitumor activities in vitro. Our study lays a solid foundation for the development and utilization of LNT2.
Key words: lentinan; antitumor; structure analysis; MTT method; H22 cells

收稿日期：2014-01-05
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373300）
作者简介：李石军（1986—），男，硕士，药师，研究方向为临床肿瘤。Tel: (027)65650894 18571571986 E-mail: 04yaolishijun@163.com
通信作者：张 玉（1968—），男，博士，教授，研究方向为植物多糖的抗肿瘤作用及其机制。Tel: (027)63559222 E-mail: wkpzcq@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月

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多糖是自然界中最丰富的生物大分子，广泛存在
于动物、植物和微生物（细菌和真菌）中[1]。真菌多
糖作为药物研究始于 20 世纪 50 年代，60 年代后由于
其免疫抑制作用而受到广泛关注，目前从真菌子实体
和菌丝体中已得到数百种真菌多糖，香菇多糖一直是
该领域研究的热点和难点。1969 年，日本学者 Chihara
等[2]首次从香菇 Lentinus edodes (Berk.) Sing. 子实体
中提取得到具有明显抗肿瘤活性的香菇多糖
（lentinan），其结构为 β-(1→3)-D-葡聚糖。现代研究表
明香菇多糖除具有抗病毒[3]、抗肿瘤[4]、调节免疫
力[5]等药理活性外，还有降血糖[6]、抗氧化[7]等多种
功效。
目前学者普遍认为香菇多糖的活性与其理化性
质、化学结构和糖链构象有很大关系。有研究指出，
大多从香菇中提取的活性多糖都具有以下特征：主
链结构为 β-(1→3)-D-葡聚糖，相对分子质量主要分
布在 4×105～8×105，糖链构象为多股螺旋结构；
但也有研究表明相对分子质量小于 4×105 的香菇
多糖也具有较好的抗肿瘤活性[8]。我国近年来也开
展了大量香菇多糖的研究工作，已成功开发出香菇
多糖注射剂及多种相关保健品，作为癌症的辅助治
疗广泛应用于临床[9]。随着我国香菇多糖提取工艺
的研究不断深入，稀碱浸提法已成为最具有代表性
的工艺。与传统的热水浸提法相比，所得粗多糖产
率和纯度更高[10]。本研究采用碱提法从香菇子实体
中提取相对分子质量小于 4×105 的单一组分香菇
多糖，并对其结构、糖链构象以及体外抗肿瘤活性
进行研究，以期为多糖的构效关系和相对分子质量
小于 4×105香菇多糖的开发利用提供基础。
1 仪器与材料
1100 LC/MSD Trap 二维液相色谱-离子阱质谱
联用仪、7890A/5975C 型气相色谱质谱联用仪、
Agilent-HP5 交联毛细管玻璃柱（美国 Agilent 公司），
Lambda 35 紫外可见分光光度计（美国 PerkinElmer
公司），美国 Cary—50 型紫外分光光度仪（美国
Varian 公司），CHRIST 冻干机（德国 Marin Christ
公司），VERTEX 70 傅里叶变换显微红外/拉曼光谱
仪（德国 Bruker 公司），AV400 核磁共振波谱仪（瑞
士 Bruker 公司），酶标仪，XD—101 倒置显微镜，
Air Tech 标准净化工作台（苏净集团安泰公司制造），
FORMAIII CO2水套培养箱（美国 FORMA 公司）。
氢氧化钠，浓硫酸，苯酚，医用酒精，刚果红，5-
氟尿嘧啶（5-FU），实验用水为双蒸水，Dextran-T
系列标准品、葡萄糖（批号 LB60595）、半乳糖（批
号 SL08403）、甘露糖（批号 SL08455）、阿拉伯糖
（批号 10115077）、木糖（批号 LB56239）和鼠李糖
（批号 10137156）对照品（Sigma 公司），其他试剂
均为分析纯。
香菇购自武汉太平洋商城，产地湖北房县，由
华中科技大学同济医学院药学院中药部阮金兰教授
鉴定伞形科香菇属香菇 Lentinus edodes (Berk.) Sing.
的子实体。
昆明小鼠（清洁级），雌性，体质量 18～22 g，
动物合格证号：SCXK 2004-0007。
2 方法与结果
2.1 香菇多糖的提取、分离与纯化
香菇子实体经剪碎、乙醇浸泡 24 h 后，采用沸
水浸提，除去水提液，滤干后的香菇子实体再用碱
提，再经 5 mol/L 的 HAc 溶液调碱提液的酸碱度至
pH 7，离心弃去沉淀，上清液浓缩后醇沉得到粗多
糖；采用 1% H2O2 对粗多糖进行脱色；脱色后粗多
糖依次用超滤膜进行分离，收集中间组分的滤液，
经冻干得到精制香菇多糖，命名为 LNT2。苯酚-硫
酸法测定 LNT2 的含糖量为 94.99%；高效凝胶色谱
法（HPGPC）测定 LNT2的相对分子质量为 1.852×
105（图 1）；LNT2 在 200～400 nm 波长进行扫描，
结果表明在 280、260 nm 处没有吸收峰（图 2），表
明样品中不含蛋白质和核酸；参照《中国药典》2010
年版二部附录VIE旋光度测定的方法进行比旋光度
测定，LNT2 的比旋光度为 20D]α[ ＋8.03°。


图 1 LNT2的 HPGPC 色谱图
Fig. 1 HPGPC of LNT2

图 2 LNT2的紫外扫描图
Fig. 2 UV scanning spectrum of LNT2
0 2 4 6 8 10
t / min
200 250 300 350 400
λ / nm
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2.2 香菇多糖 LNT2 的结构研究
2.2.1 单糖组成分析 采用气相色谱-质谱联用
（GC-MS）对多糖样品进行单糖组成分析。首先将
多糖完全水解成单糖，然后衍生化生成糖氰乙酸酯
进行 GC-MS 分析[11]。将样品以及各单糖对照品制
备成适合进行气相分析的糖氰乙酸酯衍生物后，通
过比对在相同色谱条件下各单糖对照品衍生物色谱
峰的保留时间和色谱峰峰面积，来确定多糖样品中
单糖组成的种类以及比例。
精制香菇多糖 LNT2经 2 mol/L 硫酸水解，水解
产物和各单糖对照品衍生物经 GC-MS 分析，得到色
谱图（图 3、4）。LNT2在 GC-MS 色谱图中的 tR（10.618
min）与标准单糖中 D-葡萄糖的 tR（10.609 min）一致；
与 NIST08 标准质谱库比较，得出 LNT2 全水解衍生
物为 D-吡喃葡萄糖糖氰乙酸酯。综上所述，全水解实
验结果表明 LNT2仅由 D-吡喃葡萄糖组成。

图 3 LNT2 GC-MS 色谱图
Fig. 3 GC-MS chromatogram of LNT2

1-鼠李糖 2-阿拉伯糖 3-木糖 4-甘露糖 5-D-葡萄糖 6-半乳糖
1-rhamnose 2-arabinose 3-xylose 4-mannose 5-D-glucose 6-galactose
图 4 单糖对照品 GC-MS 色谱图
Fig. 4 GC-MS chromatogram of monosaccharide
reference substance
2.2.2 高碘酸氧化 高碘酸可以选择性氧化糖的邻
二羟基或邻三羟基，生成相应的多糖醛、甲醛或甲
酸；反应定量地进行，每开裂 1 个 C-C 键消耗 1 分
子高碘酸，通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放
量，可以判断糖苷键的位置、糖残基的种类和比例。
以高碘酸钠的浓度为横坐标（X），吸光度（A）值
为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到回归方程：Y＝
8.732 4 X＋0.005 3，R2＝0.999 9。根据反应前后 A
值的变化计算高碘酸的消耗量，通过滴定计算甲酸
的生成量。根据多糖的高碘酸氧化规律，计算得
LNT2 中各糖残基的量及比值。结果 1-3 或 1-3-6 连
接的糖残基占 74.4%，C-1, 6 或末端连接的糖残基
占 25.6%，残基比为 2.91∶1。
2.2.3 甲基化分析 甲基化分析常采用改良的
Hakomori 法[12-13]。称取精制香菇多糖 20 mg，溶于
无水 DMSO 中，先与甲基亚磺酰甲基钠反应，再用
碘甲烷进行甲基化，反应液经蒸馏水透析、冻干，
经 IR 检测甲基化样品在 3 500 cm−1 附近无吸收峰，
得到全甲基化样品。全甲基化样品先用 90%甲酸于
100 ℃密闭水解 6 h，再用 2 mol/L 三氟乙酸于 100
℃密闭进一步水解 6 h，减压蒸干后先与 1 mol/L 醋
酸反应，再与醋酸酐反应，得全甲基化糖醇乙酸酯，
最后进行 GC-MS 分析。
由 GC-MS 色谱图（图 5）可知：精制香菇多糖
LNT2 主要由 1-、1-3、1-3-6 连接的 D-吡喃葡萄糖
组成，分支侧链为 1, 3-连接 D-吡喃葡萄糖 C6 位上
的末端葡萄糖基；各连接类型糖残基的物质的量比
为 1∶1.70∶1.08，与高碘酸氧化实验结果基本符
合。LNT2 甲基化实验 GC-MS 结果分析见表 1。
2.2.4 红外光谱解析 取干燥多糖样品（LNT2）约
2 mg，加入 100～200 mg 干燥的 KBr 晶体，在玛瑙
研钵中研磨成均匀粉末，用压片机压片。采用傅里
叶变换红外光谱仪在 4 000～400 cm−1扫描分析。
LNT2 的红外图谱（图 6）显示：3 396 cm−1 处
的吸收峰为 O-H 的伸缩振动峰；1 424 和 2 922 cm−1
处分别为 C-H 的变角振动和伸缩振动峰；896 cm−1
处有弱吸收峰，为 β糖苷键的吸收峰；1 162、1 077
和 1 043 cm−1 处 3 个相关吸收峰为吡喃环上 C-O-C
和 C-O-H 的伸缩振动所致。在 875、813 cm−1 处几
乎无吸收，说明 LNT2中不含甘露糖。由图谱分析可
知，LNT2是多糖类化合物，为 β-吡喃糖环的结构。
2.2.5 核磁共振波谱实验
（1）部分酸水解：称取 100 mg 精制多糖样品，
1
2 3
4
5
6
8.2 8.6 9.0 9.4 9.8 10.2 10.6 11.0
t / min
5.693
10.618
13.194
3.163
3 5 7 9 11 13 15
t / min
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图 5 LNT2甲基化实验 GC-MS 色谱图
Fig. 5 GC-MS chromatogram of methylation of LNT2
加 10 mL 0.1 mol/L 三氟乙酸，封管于 100 ℃水解 1
h。蒸馏水透析后，袋内溶液经冻干后得到 LNT2的
部分酸水解产物，命名为 LNT2-p。
（2）样品测试：称取 LNT2-p 约 50 mg 于核磁
管中，对样品 LNT2-p 进行 1H-NMR 谱、13C-NMR
谱和 DEPT-135 谱测定。根据实验结果，13C-NMR
谱表明LNT2-p所有糖残基的异头碳信号均出现在 δ
103.4，为 β构型糖残基，与红外光谱分析得出的结
果相符，与甲基化标准单糖的 NMR 数据比较[14-15]，
C-3 信号 (δ 86.8) 向低场移动说明含有 C-3 位被取
代的糖残基，C-6 信号 (δ 68.9) 向低场移动表明含
有 C-6 位被取代的糖残基。1H-NMR 谱表明 LNT2-p
有 4 个糖残基，糖残基的异头氢信号分别为 δ 4.52、
4.64、4.91 和 5.17；各糖残基峰强比为 1∶1∶1∶1。
表 1 LNT2甲基化实验结果
Table 1 Results of methylation of LNT2
甲基化产物 tR / min 质谱碎片 (m/z) 连接类型 摩尔比
2, 3, 4, 6-Me4Glc 10.34 43, 71, 101, 129, 161, 205 1-Glc 1.00
2, 4, 6-Me3Glc 13.05 43, 87, 117, 161, 203, 233, 277 1, 3-Glc 1.70
2, 4-Me2Glc 16.92 43, 87, 117, 159, 173, 201, 233 1, 3, 6-Glc 1.08

图 6 LNT2的 IR 扫描图
Fig. 6 IR scanning spectrum of LNT2
DEPT-135 谱表明 LNT2-p 含有 C-6 位 (δ 61.4) 未被
取代的糖残基。综合以上分析，可以初步推断 LNT2
的基本结构单元见图 7。
2.2.6 刚果红实验 称取一定量的刚果红，用蒸馏
水配制成 0.2 mmol/L 的刚果红溶液、2 mg/mL 的
LNT2 样品溶液和不同浓度的 NaOH 溶液（0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L），备
用。将多糖溶液（2 mg/mL）和刚果红溶液（0.2
mmol/L）等体积混合（各 2 mL）再加入 4 mL 不同
浓度的 NaOH 溶液后，混合摇匀，依次测定混合液
在 0～0.5 mol/L 的 NaOH 溶液中各溶液最大吸收波
长（λmax）的变化。
LNT2 的刚果红实验结果（图 8）表明，LNT2
O
H
HO
H
O
H
H
OHH
O
OH
O
H
HO
H
H
H
OHH
O
OH
O
H
HO
H
H
H
OHH
O
O
O
HHO
H
HO
H
H
HO
H
OH
n

图 7 LNT2的基本化学结构
Fig. 7 Basic chemical structure of LNT2

图 8 LNT2刚果红实验结果
Fig. 8 Results of Congo-red test of LNT2
与刚果红形成络合物在 NaOH 溶液 0～0.5 mol/L 内
λmax 的变化如下：在 0～0.1 mol/L NaOH 溶液中，
络合物的 λmax 出现红移，并当 NaOH 溶液浓度为 0.1
mol/L 时达到最大值，可能是 LNT2 在弱碱环境下其
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
C / (mol·L−1)
刚果红对照
多糖刚果红复合物
520
510
500
490
480
λ m
ax
/
nm

4 6 8 10 12 14 16 18 20
t / min
4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500
波数 / cm−1
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溶解度逐渐增大所致；当 NaOH 溶液浓度大于 0.1
mol/L 时，络合物的 λmax 逐渐减少，并当 NaOH 浓
度为 0.5 mol/L 时，络合物的最大吸收波长下降到与
刚果红溶液一致，表明 LNT2 高度有序的螺旋结构
逐渐解体。综合文献报道[16]，初步得出 LNT2 在较
低浓度 NaOH 溶液中呈三螺旋构象。
2.2.7 LNT2 抑制 H22 肿瘤细胞增殖实验 采用
MTT 法进行肿瘤细胞抑制实验检测。将 H22 细胞注
入小鼠腹腔中进行细胞传代培养，从 H22 腹水瘤小
鼠的腹水中抽取处于对数生长期的 H22 细胞，用
含 10%胎牛血清RPMI 1640培养液调整肿瘤细胞浓
度至 1×105 /mL。接种于 96 孔培养板。每孔加细胞
悬液 100 μL（1×104 个细胞）。实验设对照组（含
10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液），香菇多糖各
浓度（800、400、200、100、50、25、12.5 μg/mL）
组，阳性对照组（5-FU），共 9 组，每组设 6 个复
孔。香菇多糖各浓度组每孔加入 100 μL 的各浓度多
糖溶液，阳性对照组每孔加入 100 μL 200 mg/mL
5-FU 溶液，调整板内各孔液体总量，使其均为 200
μL，不足者补以含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养
液。培养板混匀后置 37 ℃、5% CO2 和 95%湿度条
件下培养 24 h 后，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 磷酸
盐缓冲液 20 μL，同样条件下继续培养 4 h，终止培
养，2 000 r/min 离心 10 min，然后弃去培养孔内的
培养液，每孔加入 150 μL DMSO，震摇 10 min，使
形成的甲臜颗粒充分溶解后，混匀后用酶标仪于
490 nm 波长处测定各孔的吸光度（A490）值，按下
面公式计算细胞生长抑制率。
抑制率=1－实验孔 A490平均值 / 对照孔 A490平均值
采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，数据以
±x s 表示，组间比较用 t 检验。LNT2 体外抗肿瘤
活性结果见表 2。
由表 2 可知，在 12.5～800 μg/mL 时，与对照
组和 5-Fu 组比较，LNT2 对 H22 细胞具有显著的抑
制作用，并且随着浓度的增加，细胞的生长抑制率
也随之升高，呈量效依赖性。当 LNT2 的质量浓度
为 800 μg/mL 时，抑制率最高达到 52.62%。
3 讨论
本实验采用的提取工艺简单、有效，且未使用
有害试剂。得到的精制香菇多糖 LNT2经 HPGPC 和
UV 实验表明为均一相对分子质量的多糖组分，不
含蛋白质和核酸，其相对分子质量为 1.852×105，
比旋光度为+8.03°；进一步的化学分析和光谱分析
表 2 LNT2对肝癌实体瘤细胞 H22生长抑制作用
( ± = 6x s , n )
Table 2 Inhibitory effect of LNT2 on growth of liver cancer
solid tumor cells H22 ( ± = 6x s , n )
组别 ρ / (μg·mL−1) A490值 抑制率 / %
对照 0 0.677±0.068 —
5-FU 50 0.588±0.035*# 13.16
LNT2 800 0.321±0.013*# 52.62
400 0.349±0.025*# 48.40
200 0.350±0.021*# 48.27
100 0.388±0.029*# 42.63
50 0.445±0.034*# 34.25
25 0.456±0.016*# 32.62
12.5 0.491±0.017*# 27.52
与对照组比较：*P＜0.05；与 5-FU 组比较：#P＜0.05
*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs 5-FU group
表明 LNT2 的结构为具有分支侧链的 β-(1→3)-D-葡
聚糖，与大多文献报道[8]的抗肿瘤活性多糖的结构
特征相符。现代研究表明，多糖的活性不仅与其一
级结构有关，而且与糖链的高级构象密切相关，大
量研究表明，只有具有三股螺旋结构的香菇多糖才
具有较强的生物活性[17]。实验结果表明 LNT2 的糖
链构象为三股螺旋构象，具有潜在抗肿瘤活性的研
究价值。为了进一步研究 LNT2 的高级构象，后续
还将进行 X 射线衍射和原子粒扫描（ATM）实验。
体外抗肿瘤实验表明 LNT2 具有明显抑制鼠肝
腹水瘤 H22 细胞的活性。Fan 等[18]和 Joseph 等[19]报
道在体外具有一定抗肿瘤活性的多糖在体内也具有
抗肿瘤作用，因此后续实验将进一步对 LNT2 在小
鼠体内抗肿瘤的活性进行研究，以对其体内、外抗
肿瘤活性进行全面的评估。
大多从香菇中提取的抗肿瘤活性多糖其相对分
子质量主要分布在 4×105～8×105，而本实验从香
菇子实体得到的香菇多糖 LNT2 相对分子质量为
1.852×105，同样具有一定的体外抗肿瘤活性。因
此为相对分子质量小于 4×105 香菇多糖的开发利
用提供了一定基础，在今后研究中，可以对不同相
对分子质量香菇多糖的结构与活性之间的关系进行
探讨，为多糖类药物的研究和开发提供理论依据。
参考文献
[1] Mizuno T. Development of antitumor polysaccharides
from mushroom fungi [J]. Foods Food Ingred J Jpn,
1996, 167: 69-85.
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月

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