全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 20期 2015年 10月

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高速逆流色谱分离制备裂叶独活中香豆素类成分
严志宏 1，黄秀珍 2，顿珠次仁 3，刘志勇 1，熊耀坤 1，谢一辉 1，朱根华 1*
1. 江西中医药大学，江西 南昌 330004
2. 抚州市第一人民医院，江西 抚州 344000
3. 西藏藏医学院，西藏 拉萨 850000
摘 要：目的 建立高速逆流色谱（HSCCC）法从裂叶独活根中分离制备高质量分数的香豆素类成分。方法 利用高效液
相色谱-二极管阵列检测器分析优化溶剂体系，选择正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水（1.5∶2.5∶2∶1.5）为 HSCCC 溶剂系统，上
相为固定相，下相为流动相，主机转速为 850 r/min，体积流量为 3 mL/min，检测波长为 323 nm。所接收馏份在 50 ℃减压
浓缩，静置得到蛇床子素晶体、二氢欧山芹醇乙酸酯晶体和二氢欧山芹醇当归酸酯晶体，应用核磁共振氢谱、碳谱、质谱、
红外光谱等进行鉴定，并用 HPLC测定质量分数。结果 进样量为 300 mg浸膏，得到二氢欧山芹醇乙酸酯 6.3 mg、蛇床子
素 10.6 mg、二氢欧山芹醇当归酸酯 6.4 mg，三者的质量分数均达到 96.0%以上。结论 HSCCC法可用于裂叶独活中高质量
分数香豆素类成分的快速分离制备。
关键词：高速逆流色谱；裂叶独活；香豆素；二氢欧山芹醇乙酸酯；蛇床子素；二氢欧山芹醇当归酸酯
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)20 - 3023 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.20.010
Separation and purification of coumarins from Heracleum millefolium by
high-speed counter-current chromatography
YAN Zhi-hong1, HUANG Xiu-zhen2, DUN Zhu-ciren3, LIU Zhi-yong1, XIONG Yao-kun1, XIE Yi-hui1,
ZHU Gen-hua1
1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
2. The First People’s Hospital of Fuzhou, Fuzhou 344000, China
3. College of Tibetan Medicine, Lhasa 850000, China
Abstract: Objective To separate and purify coumarins from Heracleum millefolium by high-speed counter-current chromatography
(HSCCC). Methods HPLC was used to analyze and optimize the solvent system and hexane-ethyl acetate-water-methanol (1.5∶
2.5∶2∶1.5) was chosen as the two-phase solvent system of HSCCC, in which the upper phase was used as the stationary phase, while
the lower phase was used as the mobile phase with flow rate of 3 mL/min, the revolution speed was set at 850 r/min, and detected at 323
nm. Three compounds were obtained as crystals by vacuum concentration at 50 ℃, and determined through HPLC, then their
structures were identified by IR, ESI-MS, 1H-NMR, and 13C-NMR. Results Columbianetin acetate (6.3 mg), osthole (10.6 mg), and
columbianadin (6.4 mg) were obtained from crude sample (300 mg) extracts and their purity were above 96.0%. Conclusion HSCCC
is a powerful technique for the rapid separation and purification of coumarins from crude extract of H. millefolium.
Key words: high-speed countercurrent chromatography; Heracleum millefolium Diels; coumarins; columbianetin acetate; osthole;
columbianadin

裂叶独活Heracleum millefolium Diels为伞形科
（Umbelliferae）独活属，又名藏当归（青海）、千叶
独活（秦岭植物志），产于我国西藏、青海、甘肃、
四川、云南，属于高海拔药材。裂叶独活传承了藏

收稿日期：2015-03-19
基金项目：江西省科技支撑计划（20112BBG70021）；江西中医药大学道地药材及特色中药资源研究专项；西藏自治区自然科学基金资助项目
（2015ZR-14-65）
作者简介：严志宏（1977—），男，讲师，研究方向为新型材料及化学分析技术研究。Tel: (0791)87118768 E-mail: yanzhihong03@126.com
*通信作者 朱根华，男，讲师，研究方向为中药学。Tel: (0791)87118825 E-mail: zgh971029@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 20期 2015年 10月

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药效果快、药力强、纯净、天然、无污染的特点，
以干燥全草入药，味苦、辛，性平，消散肿胀、破
除癥结痞块。饶高雄等[1]从裂叶独活中分离鉴定了
11个化学成分，其中香豆素类成分有 4个。文献调
研显示裂叶独活化学成分研究报道较少，因此，进
一步阐明裂叶独活中的化学成分，对研究其药效物
质基础、质量控制、现代藏药的开发等具有重要意
义。查阅大量文献，未见关于裂叶独活活性成分的
研究。据报道，香豆素成分广泛存在于独活属植物
中，其中二氢欧山芹醇当归酸酯具有很好的抗炎、
镇痛效果[2]；蛇床子素在癌症和肝脏、脑部疾病等
方面发挥重要作用[3-5]；二氢欧山芹醇乙酸酯可以明
显抑制大鼠体外血小板的聚集[6]。
高 速 逆 流 色 谱 （ high-speed countercurrent
chromatography，HSCCC）是 20世纪 80年代发展
起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，
被广泛应用于中药、食品、抗生素、蛋白质和多肽
等分离制备方面[7-13]。传统的制备分离单体方法存
在耗时、溶剂消耗量大，而且污染环境等缺点，
HSCCC 具有无污染、无吸附、一次制备量大、操
作简单、耗材低廉、所用溶剂少、分离时间短、制
备样品纯度高等优点，甚至可用于制备高质量分数
的标准品[14]。
本研究中采用溶剂提取法和液-液萃取法得到
裂叶独活粗提物，以此粗提物为原料利用 HSCCC
进行化学成分的分离纯化，得到 3种香豆素类化合
物蛇床子素、二氢欧山芹醇乙酸酯和二氢欧山芹醇
当归酸酯，质量分数均达到 96.0%以上。该法简单、
快速、高效，分离纯度高。目前还未见关于利用
HSCCC 法从裂叶独活中一次性分离纯化 3 种高质
量分数的香豆素类成分的报道。该研究结果可为裂
叶独活的药理药效、物质基础研究和临床应用研究
提供有用参考和信息，同时也为香豆素类成分的制
备分离提供一种快速、简单、高效的方法。
1 仪器与材料
TBE-300C 型高速逆流色谱仪，上海同田生物
技术股份有限公司；Agilent1260型自动进样高效液
相色谱仪、Agilent1260DAD检测器、Agilent C18色
谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国安捷伦公司；
Bruke Avance 400型超导核磁共振仪、VERTEX70
型红外光谱仪，瑞士布鲁克公司；X-4A 数字熔点
测定仪，北京福凯仪器有限公司；N7001型旋转蒸
发仪，厦门精艺兴业科学仪器有限公司；Triple
QUAD 5500，ABsciex公司；高速多功能粉碎机，
永康市绿可食品有限公司；SZ-93A型自动双重纯水
蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；Milli-Q超纯水制备
系统，美国Millipore公司；真空干燥箱，上海恒科
学仪器有限公司；万分之一电子天平，北京赛多利
斯仪器系统有限公司。
石油醚（AR），沸程 60～90 ℃，天津市恒兴
化学试剂制造有限公司；正己烷（AR）、醋酸乙酯
（AR）、95%乙醇（AR），上海泰坦科技公司，甲醇
（AR），上海试一化学试剂有限公司；HPLC流动相
中所使用的水均为 Milli-Q 超纯水，其他用水为双
蒸水；甲醇为色谱级，美国 Tedia试剂公司。
裂叶独活根采集于拉萨市当雄县，经西藏藏医
学院实验标本中心达瓦讲师鉴定为裂叶独活
Heracleum millefolium Diels的根，晒干后用于实验。
样品保存于江西中医药大学药学院实验标本中心。
2 方法和结果
2.1 裂叶独活粗提物的制备
将裂叶独活在 45 ℃下真空干燥 12 h，粉碎过
60目筛，称取 1 000 g，用 5倍量 95%乙醇常温浸
泡 24 h，重复 3次，合并上清液。将上清液减压浓
缩得浸膏，加适量水混悬，用 3 倍量石油醚萃取 5
次，合并萃取液，减压浓缩得到 20.9 g浸膏，得率
为 2.1%，常温保存备用。
2.2 溶剂系统筛选
以试管法结合 HPLC法，测定 HSCCC溶剂系
统的分配系数（K）。取 1 mg裂叶独活粗提物溶于
上、下相各 1 mL的溶剂体系中，振摇，静置，重
新分层后，取等量的上、下相溶液分别用 HPLC
检测 I、II、III号峰，用上相峰面积除以下相峰面
积即得到 K值。HSCCC最佳的 K 值一般为 0.5～
2.0，如果 K值＞2.0，则目标成分分离时间延长；
当 K值＜0.5时，目标成分与其他成分重叠而不能
分开[10]，以此为依据，共考察了 5 个不同体积比
的溶剂体系，见表 1。根据 K值，选择了第 3种溶
剂体系。
2.3 分离条件的优化
预实验结果表明，当流动相体积流量为 2
mL/min时，III号峰完全出来共用了将近 330 min，
实验时间太长，尝试将体积流量改为 3 mL/min，拟
达到不影响分离效果的前提下缩短实验时间的目
的，实验时间缩短为 250 min；固定进样体积为 20
mL，依次加大进样质量浓度为 5、10、15、20、25、
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表 1 不同溶剂体系 3个组分 K值
Table 1 K values of three compounds in different solvent systems
溶剂体系
K值
组分 I 组分 II 组分 III
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水 5∶5∶5∶5 0.89 3.72 4.58
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水 5∶5∶6∶4 0.57 0.67 0.81
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水 1.5∶2∶2.5∶1.5 0.68 1.17 1.36
石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水 5∶5∶5∶5 0.51 3.25 3.78
石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水 5∶5∶6∶4 0.32 2.47 3.45

30 mg/mL，发现以大于 15 mg/mL为进样质量浓度
时会有固定相流失，所以实验选择进样质量浓度为
15 mg/mL，尽量增加一次实验的制备量；升高温度
有利于增加固定相的保留率，但是也会让两相的互
渗性增加，而且主机里的管路容易老化，而降低仪
器寿命，因此保持循环水温度为 25 ℃；转速越快，
分离效果越好，但是转速太快又会缩短主机里的皮
带寿命，综合考虑选择转速为 850 r/min。经优化后，
实验能够达到最优的分离效果，且达到节省时间和
保护仪器的目，固定相保留率达到 73%。
2.4 HSCCC分离制备
以正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水（1.5∶2∶2.5∶
1.5）作为溶剂体系。将这 4种溶剂按比例混合后，
强烈震摇，静置分离上下相并超声脱气 20 min。开
启循环水泵恒温装置，使温度保持在 25 ℃，紫外
检测吸收波长为 323 nm。将上相（固定相）以 30
mL/min的体积流量泵入主机，泵满后，正转，调转
速为 850 r/min，以 3 mL/min的体积流量把下相（流
动相）泵入主机。当只有下相从检测器流出时，及
体系达到流体动力学平衡时，计算保留率为 73%。
取上、下相各 10 mL溶解 300 mg裂叶独活粗提物
浸膏溶液由进样阀注入分离管路。根据 HSCCC 色
谱图手动收集各色谱峰馏份，得到裂叶独活粗提物
的 HSCCC色谱图见图 1。所接收馏份在 50 ℃下减
压浓缩、静置滤过得到晶体，待测。
2.5 HPLC测定分析
香豆素成分的 2 个最大紫外吸收区集中在
280、350 nm附近[14]，经 HPLC-DAD检测可知，
二氢欧山芹醇乙酸酯的最大吸收峰在330 nm附近，
蛇床子素的最大吸收峰在 320 nm附近，二氢欧山
芹醇当归酸酯的最大吸收峰在 325 nm附近，综合
考虑，实验选择 323 nm作为检测波长。将 HSCCC
所得的 3种晶体用甲醇溶解，均制备成质量浓度为



I-二氢欧山芹醇乙酸酯 II-蛇床子素 III-二氢欧山芹醇当归酸酯
I-columbianetin acetate II-osthole III-columbianadin

图 1 裂叶独活粗提取物 HSCCC图谱
Fig. 1 HSCCC of crude extract from H. millefolium

100 μg/mL，进样。流动相为甲醇-水（70∶30），体
积流量为 1.0 mL/min，柱温为 20 ℃，检测波长为
323 nm，进样量 5 μL。用 Agilent1260色谱工作站
进行质量分数分析。按峰面积归一化法计算质量分
数，测定结果为二氢欧山芹醇乙酸酯的质量分数为
98.1%，称定质量为 6.3 mg，得率为 2.1%；蛇床子
素质量分数为 97.3%，称定质量为 10.6 mg，得率为
3.5%；二氢欧山芹醇当归酸酯质量分数为 96.9%，
称定质量为 6.4 mg，得率为 2.1%。3种晶体的 HPLC
图见图 2。
2.6 结构鉴定
组分 I：白色粒状结晶（甲醇-水 70∶30），mp
133～134 ℃； KBrmaxIR ν (cm−1): 1 728（内酯环）, 1 614,
1 580, 1 488, 1 453, 841；ESI-MS m/z: 288 [M]+ (甲
醇), 228, 213, 203, 187, 176, 159, 131, 77, 59；
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.21 (1H, d, J = 18.0
Hz, H-3), 7.65 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-4), 7.28 (1H, d,
J = 8.4 Hz, H-5), 6.76 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 3.30
(2H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz, H-3′), 5.15 (1H, dd, J = 18.0,
16.4 Hz, H-2′), 1.58 (3H, s, H-4′), 1.52 (3H, s, H-5′),
0 50 100 150 200 250
t/min
I
II
III
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I-二氢欧山芹醇乙酸酯 II-蛇床子素 III-二氢欧山芹醇当归酸酯
I-columbianetin acetate II-osthole III-columbianadin

图 2 HSCCC分离的 3种晶体的 HPLC图
Fig. 2 HPLC of three crystals obtained by HSCCC

2.01 (3H, s, OAc-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)
δ: 170.1 (OAc-C＝O),160.8 (C-2), 112.3 (C-3), 143.8
(C-4), 128.8 (C-5), 106.6 (C-6), 163.9 (C-7), 113.4
(C-8), 151.3 (C-9), 113.4 (C-10), 27.6 (C-1′), 88.7
(C-2′), 82.1 (C-3′), 22.1 (C-4′), 22.0 (C-5′), 20.9
(OAc-Me)。以上数据与文献报道基本一致[15-16]，故
鉴定为二氢欧山芹醇乙酸酯。
组分 II：无色块状结晶（甲醇-水 70∶30），mp
83～84 ℃； KBrmaxIR ν (cm−1): 1 720 (-C＝O), 1 604,
1 562, 1 499 (Ar), 1 251 (-C-O)；ESI-MS m/z: 244
[M]+ (甲醇), 229, 213, 201, 159, 131, 103, 89, 77, 63,
51；1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.67 (3H, s, H-5′),
1.84 (3H, s, H-4′), 3.52 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-1′), 3.92
(3H, s, OCH3), 5.22 (1H, m, H-2′), 6.83 (1H, d, J = 8.0
Hz, H-6), 7.28 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 7.61 (1H, d,
J = 8.0 Hz, H-4), 6.23 (1H, d, J = 6.2 Hz, H-3)；
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 160.2 (C-2), 113.0
(C-3), 143.6 (C-4), 126.2 (C-5), 107.4 (C-6), 161.2
(C-7), 113.0 (C-8), 152.9 (C-9), 118.1 (C-10), 21.9
(C-1′), 121.2 (C-2′), 132.5 (C-3′), 25.7 (C-4′), 17.8
(C-5′), 56.1 (OCH3)。以上数据与文献报道基本一
致[15]，鉴定为蛇床子素。
组分 III：白色针形结晶（甲醇-水 80∶20），mp
114～115 ℃； KBrmaxIR ν (cm−1): 1 710 (内酯环), 1 616,
1 579, 1 491 (Ar), 1 455, 1 385；ESI-MS m/z: 328
[M]+ (甲醇), 228, 213, 187, 159, 131, 83, 55, 43；
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.21 (1H, d, J = 9.6
Hz, H-3), 7.63 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-4), 7.26 (1H, d,
J = 7.6 Hz, H-5), 6.74 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 3.38
(2H, m, H-3′), 5.13 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-2′), 1.60 (3H,
s, H-4′), 1.64 (3H, s, H-5′), 5.98 (1H, m, H-3″), 1.89
(3H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 3″-CH3), 1.67 (3H, s,
2″-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 160.9 (C-2),
113.0 (C-3), 143.8 (C-4), 128.8 (C-5), 106.6 (C-6),
164.0 (C-7), 112.2 (C-8), 151.3 (C-9), 113.5 (C-10),
89.2 (C-2′), 27.6 (C-3′), 82.0 (C-4′), 21.2 (4′-CH3),
22.3 (4′-CH3), 167.1 (C-1″), 128.7 (C-2″), 137.3
(C-3″), 15.5 (2″-CH3), 20.4 (3″-CH3)。以上数据与
文献报道基本一致[15,17]，鉴定为二氢欧山芹醇当归
酸酯。
3 讨论
本实验采用 HSCCC 法，以正己烷-醋酸乙酯-
甲醇-水（1.5∶2∶2.5∶1.5）作为溶剂体系，一次
性从裂叶独活粗提物中分离制备到 3种香豆素类化
合物，质量分数均高于 96%。裂叶独活作为一种藏
药，相对研究比较少。二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床
子素和二氢欧山芹醇当归酸酯具有多种药理活性，
推断这些成分很有可能是裂叶独活的活性成分。本
实验利用HSCCC一次制备这 3种香豆素成分量大，
这不仅为裂叶独活药性物质基础的研究提供依据，
同样为其他香豆素类的分离制备提供参考。同时，
本研究充分体现了 HSCCC法的简单、高效、快速、
制备量大和制备质量分数高等优点。HSCCC 拥有
众多优势，但其也存在一些缺点，如精密度不如分
析性色谱仪器高，溶剂体系选择方法及理论远不如
其他色谱成熟等。
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0 4 8 12 16 0 4 8 12 16 0 4 8 12 16
t/min
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