全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 7 期 2014 年 4 月

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• 药材与资源 •
金荞麦花青素合酶基因的克隆及其表达与花青素量的相关性研究
卜星星，雒晓鹏，白悦辰，李成磊，陈 惠，吴 琦*
四川农业大学生命科学学院，四川 雅安 625014
摘 要：目的 获取金荞麦花青素合成途径关键酶花青素合成酶（anthocyanins synthase，ANS）基因的全长序列，并进行序
列分析；对花期金荞麦 ANS 基因在各组织中表达水平与花青素量的相关性进行分析。方法 利用同源克隆技术获得 ANS 基
因 cDNA 序列；采用半定量 RT-PCR 对 ANS 表达量进行分析；采用分光光度法测量花青素量。结果 金荞麦 ANS 基因 cDNA
包含一个 1 077 bp 的 ORF，编码 358 个氨基酸，命名为 FdANS。生物信息学分析表明，该基因编码蛋白与其他植物 ANS 蛋
白氨基酸序列同源率较高。FdANS 在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明，其表达量花＞叶＞茎＞根，花青素量为花＞叶＞
茎＞根。结论 在金荞麦中首次获得 ANS 基因的 cDNA 序列，编码蛋白具有 ANS 同源蛋白的典型特征。FdANS 基因在金荞
麦根、茎、叶和花中的表达量与花青素量具有相关性。
关键词：金荞麦；花青素合酶；基因克隆；cDNA 序列；花青素
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)07 - 0985 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.07.017
Gene cloning of anthocyanin synthase in Fagopyrum dibotrys and correlation
between its expression level and anthocyanin content
BU Xing-xing, LUO Xiao-peng, BAI Yue-chen, LI Cheng-lei, CHEN Hui, WU Qi
College of Life Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China
Abstract: Objective To obtain the full-length cDNA sequence of anthocyanins synthase (ANS) gene from Fagopyrum dibotrys (FdANS),
and to analyze the expression of FdANS in each tissue and the total anthocyanin content during florescence of F. dibotrys. Methods The
cDNA sequence of ANS gene was cloned by homology cloning from F. dibotrys. The expression of ANS was analyzed by semi-quantitative
RT-PCR. The content of total anthocyanin was measured by spectrophotometry. Results The open reading frame (ORF) of FdANS was 1 077
bp and encoded a protein with 358 amino acids named FdANS. Bioinforamtion analysis suggested that the amino acid sequence of FdANS had
the higher homology with those in other plants. Both the gene expression FdANS in different tissues during florescence of F. dibotrys and the
total anthocyanin content were in the order of flowers > leaves > stems> roots. Conclusion The cDNA sequence of FdANS is firstly obtained
from F. dibotrys and its coding protein has the typical characteristic of ANS homologous protein. The gene expression of FdANS shows the
correlation to the total anthocyanins content in the flowers, leaves, stems, and roots of F. dibotrys.
Key words: Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara; anthocyanin synthase; gene cloning; cDNA sequence; anthocyanin

金荞麦 Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara是蓼
科（Polygonaceae）荞麦属 Fagopyrum Mill. 多年
生草本植物，又名赤地利、金锁银开、天荞麦、荞
麦、三七等，原产于中国西南，分布于陕西、江苏、
四川及云南等省区[1]。作为一种营养丰富并具有重
要药用价值的资源植物[2]，其性平、微凉、味苦，
酸涩，具有清肺排痰、活血散瘀、健脾利湿之效，
主治肺脓疡、咽喉肿痛、菌痢、痛经等。金荞麦
的块根活性提取物具有显著的抗癌，以及消炎抗
菌等重要的作用[3-5]。而其中主要的抗癌活性成分
为一类原花青素的缩合性鞣质混合物[6]。目前，
由于人工栽培的金荞麦产量和品质的限制以及人
们对其价值的重视，大量的市场需求促进了对野
生金荞麦的掠夺式采集，致使金荞麦种源不断减

收稿日期：2013-12-12
基金项目：四川农业大学“211 工程”双支计划（00770106）
作者简介：卜星星（1987—），男，研究生，硕士，生物化学与分子生物学专业。E-mail: bxx0918@163.com
*通信作者 吴 琦（1973—），男，教授，博士，研究方向为植物分子生物学。E-mail: wuqiwqwq@gmail.com
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少，濒临灭绝。鉴于此，我国已将其列为国家二级
保护植物[7]。
花青素生物合成途径是类黄酮物质合成途径的
一个分支。植物花青素合成是以苯丙氨酸为前体，
经不同的羟基化、糖基化、甲基化或酰基修饰后形
成花青素被转运到液泡中 [8] 。花青素合成酶
（anthocyanin synthase，ANS）是花青素合成通路末
端的关键酶，催化以无色花青素到有色花青素的转
变，即催化无色翠雀素、无色矢车菊色素和无色天
竺葵色素生成翠雀素、矢车菊色素和花葵素[9-11]。
催化反应需要 2-酮戊二酸、铁、抗坏血酸和盐酸酸
化，在 C-3 位羟基化无色花色素或直接形成 C-3 位
酮基[12]。目前，ANS 的 cDNA 序列已在拟南芥
（AEI99590.1）等多种植物中得到克隆。各植物中
ANS 基因表达调控机制的差异，正是引起花青素量
差异的主要原因。因此，了解克隆金荞麦花青素合
酶（FdANS）基因表达与花青素量之间的关系，对
进一步提高金荞麦的药用价值和促进其野生资源保
护具有重要意义。
1 材料及主要试剂
2013 年 9 月中旬样品采集于雅安老板山，经四
川农业大学植物学教研室袁明副教授鉴定为金荞麦
Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara 。大肠杆菌
Escherichia coli 菌株 DH5α 由生物化学与分子生物
学实验室保存。克隆载体 pMD19-T、胶回收试剂盒、
DNA A-Tailing Kit、PrimSTART（日本 TaKaRa 公司），
RNA 提取试剂植物 RNAout试剂盒（天泽基因公司），
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit
（Fermentas 公司），DNA 聚合酶、PCRMaster Mix（Bio
Med 公司），T4 DNA 连接酶（北京天恩泽有限公司），
其他化学药品均为进口或国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 金荞麦总RNA 的提取及 cDNA第一链的合成
按照天泽基因公司“植物 RNAout 试剂盒”说
明书，分别提取花期金荞麦根、茎、叶和花的总
RNA。利用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis
Kit（Fermentas 公司）试剂盒以 Oligo-dT18 和 Random
Hexamer Primer 为引物，进行 cDNA 的反转录，将
合成的 cDNA 第一链保存于−20 ℃冰箱中，备用。
2.2 FdANS 基因 cDNA 序列的克隆
参照甜荞 FeANS（HM149791.1）基因 cDNA
全长序列，设计并合成一对特异性引物 ANSf 和
ANSr（表 1），以合成的 cDNA 为模板，进行 PCR
扩增。PCR 体系：cDNA 1 μL，PrimSTART 12.5 μL，
特异性引物 ANSf 和 ANSr 各 1.25 μL，ddH2O 9 μL，
共 25 μL。PCR 条件：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变
性 50 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 20 s，30 个循
环，72 ℃延伸 10 min。回收 PCR 产物加 A 后，与
pMD19-T Vector 载体连接，转化大肠杆菌 DH5α感
受态细胞，筛选 3个菌落PCR检测为阳性的克隆子，
送 Invitrogen 基因有限公司测序。
2.3 FdANS 基因核酸与蛋白序列分析
所得测序结果使用 NCBI 在线工具 BLAST 进
行序列比对。采用 Expacy 网站 PROSITE 数据库进
行结构域和生物学活性位点识别。采用 Clustalx1.81
软件进行植物 ANS 蛋白氨基酸序列的多重序列比
对，采用 MEGA 4.1 软件经邻接法构建系统发育进
化树，并以 Bootstrap 对进化树构建结果进行验证。
采用 SOPMA（http://pbil.ibcp.fr）对 FdANS 蛋白质
二级结构进行预测；利用 Swiss-Model 在线同源建
模软件进行蛋白质三级结构同源建模。采用 Expacy
网站在线工具 ProtParam对 FdANS蛋白进行理化性
质分析。
2.4 花期 FdANS 的半定量 RT-PCR
设计一对特异引物 ANSsmf 和 ANSsmr，以荞麦
持家基因组蛋白编码基因 H3（FdH3，HM628903）
为内参（表 1），分别检测 FdANS 基因在金荞麦根、
茎、叶、花中的表达量，PCR 产物用琼脂糖凝胶电
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物名称 引物序列 引物用途 预扩增长度 / bp
ANSf
ANSr
5’-TTCCATTACGTCTTCGAGAGTTGAG-3’
5’-CCAATCACGCCTCTCTTATTCCTTT-3’
FdANS cDNA 扩增 1 300
ANSsmf
ANSsmr
5’-GGAAGATTACTTTTTTCACCTTGCCTACC-3’
5’-GAATGCTTTGGCGGCTCACAGA
FdANS 半定量 RT-PCR 引物 500
H3-semf
H3-semr
5’-GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG-3’
5’-CCAACAAGGTATGCCTCAGC-3’
H3 半定量 RT-PCR 引物 200
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泳检测，每条特定电泳条带的光密度通过 Quantity
One 软件扫描获得，以 FdANS 光密度值与内参基因
FdH3 的光密度值的比值来表示 FdANS 基因在根、
茎、叶、花中的表达量。
2.5 花期金荞麦花青素的提取及定量测定
采用Ronchi等[13]和Park等[14]的方法略作改动，
提取金荞麦花期各组织中的花青素。分别取金荞花
期与提 RNA 相同部位的根、茎、叶、花的样品研
磨加入 1 mL 1%盐酸的甲醇溶液 25 ℃过夜，随后
在提取液中加入 2/3体积的双蒸水和 1体积的氯仿，
13 000 r/min 离心 3 min 后取上清，最后用紫外分光
光度计测定 530 nm 和 657 nm 处的吸光度值。计算
花青素的量（花青素＝[(A530－0.33×A657)×鲜质
量]。实验结果为 3 次独立测定的平均值。
2.6 数据的分析和处理
采用 IBM SPSS Statistics 20 统计软件对金荞麦
FdANS 基因的表达量与其对应样本花青素的量进
行相关性分析。
3 结果与分析
3.1 金荞麦总 RNA 的提取
提取的金荞麦总 RNA 电泳结果显示，28 S 及
18 S rRNA 2 条主带清晰可见，见图 1。二者条带亮
度比大致符合 2∶1，且不含有 DNA 及蛋白质杂带，
可用于 RT-PCR 制备 cDNA 第一链。
3.2 FdANS 基因 cDNA 序列的克隆
以合成的 cDNA 第一链为模板，PCR 扩增出一
条大小约为 1 300 bp 的特异条带，见图 2。测序结
果表明该片段为 1 284 bp，经 Blast 比对显示其中包
含了 1 077 bp 的 OFR 序列，与 Genbank 中甜荞
FeANS（HM149791.1）和部分苦荞（HQ003254.1）
相似度最高，分别为 93%和 99%，与其他植物 ANS
的相似度为 74%～85%。

图 1 金荞总 RNA 的提取
Fig. 1 Total RNA extracted from F. dibotrys

1～2 为 FeANS 扩增产物
PCR products of FeANS
图 2 金荞麦 FdANS 基因的扩增
Fig. 2 Amplification of FdANS from F. dibotrys
3.3 FdANS 编码蛋白的序列分析
3.3.1 FdANS 编码的氨基酸序列 利用 Dnaman 软
件，对 FdANS 的 ORF 序列进行翻译，其编码的氨
基酸序列为“MVSITSSRVESLASSGIQSIPKEYVRP
EEELTSIGDVFEEEKKEGPQVPTIDIKDIASDDKE
VRAKAIEELKKAATEWGVMHLVNHGIPDELTTR
VKNAGATFFELPIEEKEKYANDQASGKIQGYGS
KLANNASGQLEWEDYFFHLAYPEDKRDLSVWP
QTPSDYIPSTSEYAKELRSLATKIMSALSLALGLE
EDRLEKEVGGIEELLLQMKINYYPKCPQPELALG
VEAHTDVSALTFILHNMVPGLQLFYEGKWVTAK
CVPNSIIMHIGDTLTILSNGKYKSILHRGLVNKEK
VRISWAVFCEPPKHSIILKPLPELVSESEPAEFPPRT
FAQHIEYKLFRKTQELQAAPASKE”。
3.3.2 FdANS 的进化分析 16多种植物来源的
ANS 蛋白序列经 Clustalx 1.81软件多序列比对后表
明，用于比对的序列相似性总体较高（48.15%～
87.11%），具有共同的保守区域。经 MEGA 4.0软件
邻接（Neighbour Joining，NJ）法构建系统发育树，
结果见图3。由图可知，十字花科的芥蓝 Brassica
alboglabra L. H. Bailey 和拟南芥 Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh. 进化关系较近，金荞麦和甜荞
Fagopyrum esculentum Moench 同源关系最近。
3.3.3 FdANS 的生物信息学分析 SOPMA 预测表
明，FdANS 二级结构以 α-螺旋与无规则卷曲为主，
其中 α-螺旋为 40.22%，β-转角为 11.45%，无规则
卷曲为 30.73%，延伸链为 17.60%。
Swiss-Model 对 FdANS 蛋白同源建模，所得结
果与已知结构和功能的拟南芥 ANS 蛋白的三级结
构类似，ANS 有两个保守功能域，其中一个具有异



4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp

根 茎 叶 花 Marker
28 S
18 S
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
Marker 1 2
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图 3 金荞麦 FdANS 与其他植物来源 ANS 蛋白序列的
系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree based on protein sequences of FdANS
from F. dibotrys and ANS from other plants
青霉素 N 合成酶和双加氧作用；另一个是 2-酮戊二
酸-Fe2+-双加氧酶家族的保守结构域，行使双加氧
作用。其中 Fe2+结合在 His232、His288 和 Asp234 上，
2-酮戊二酸的 5-羧基与保守残基 Arg298 形成静电作
用[15]。这些特征与其他植物 ANS 及双加氧酶家族
的黄烷酮 3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）
和黄酮醇合成酶（flavonol synthase，FLS）的催化
活性中心特征一致，表明 FdANS 属于典型的依赖
2-酮戊二酸双加氧酶家族，与在类黄酮合成途径中
同属此家族的 F3H 和 FLS 具有保守的同源关系[16]。
ProtParam 分析表明， FdANS 蛋白分子式为
C1810H2856N472O547S9，相对分子质量为 4.027×104，
理论 PI 值为 5.38。不稳定常数 II（instability constant
II）为 53.74，在酵母和大肠杆菌体内半衰期分别超
过 20 h 和 10 h，为典型不稳定型蛋白。
3.4 花期金荞麦FdANS 半定量RT-PCR与花青素
的测定及其相关性分析
3.4.1 FdANS 的半定量 RT-PCR 花期金荞麦不同
部位 FdANS 的半定量 RT-PCR 结果见图 4。经
Quantity one（version 4.6.2）软件分析，并进行高斯
建模（Gauss-Model）计算光密度值，各基因表达量
用相对光密度值 ROD（relative optical density）表示。
分析表明，FdANS 基因在根、茎、叶和花中均有表
达。其中花和叶中表达量最高，相对表达量分别为
92.12%和 81.32%；根和茎中相对较低分别为 49.04%
和 52.06%。
3.4.2 花青素的测定 金荞花期各个组织的花青素
的测定结果见图 5。由图可知，金荞麦的花中花青
素量最高为 3.38 mg/g，其次为叶和茎，分别为 1.60、
1.05 mg/g，根部花青素量最低为 0.9 mg/g。

图 4 花期金荞麦 FdANS 基因的半定量 RT-PCR 分析
Fig. 4 Semi-quantitative RT-PCR analysis of FdANS
from F. dibotrys during florescence

图 5 花期金荞麦花青素的测定
Fig. 5 Determination of anthocyanin content
from F. dibotrys during florescence
3.4.3 金荞 FdANS 基因表达量与其对应样本花青素
量的相关性分析 IBM SPSS Statistics 20 统计软件对
花期金荞麦 FdANS 基因的表达量与其对应样本花青
素量进行线性回归分析，得出相关系数为 0.875（P＜
0.05），Durbin-Watson 现行检测值为 0.803＜2，因此
可认为金荞麦 FdANS 表达水平与其对应的花青素量
呈正相关关系，其相关方程为 Y＝0.009 X－0.270。
4 讨论
本实验克隆所得FdANS基因cDNA序列经测序
及核酸、蛋白序列比对搜寻结果显示，FdANS 核酸
序列与实验室获得苦荞以及网上公布的甜荞相似度
达 98%和 93%。这说明金荞麦与苦荞的同源关系最
近，和甜荞次之，与 Sharma 的观点一致[17]。
植物中 ANS 的表达量与花青素量密切相关：田
陆地棉 ABM64801.1
可可树 ADD51356.1
龙眼 ACK76231.1
葡糖 ABV82967.1
牡丹 AEN71543.1
甜荞 ADT63066.1
金荞麦
甘蓝 ADK37750.1
拟南芥 AEI99590.1
西洋梨 AGL81351.1
苹果 ABD04052.1
大豆 NP_001239794.1
苜蓿 ABU40983.1
烟草 BAM37963.1
水稻 CAA69252.1
小麦 BAE98276.1 花 叶 茎 根
100
80
60
40
20
0
Fd
AN
S
相
对
表
达
量
/
%

花 叶 茎 根
花
青
素
/
(m
g·
g −
1 )

3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
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佶等[18]研究表明，苹果属海棠的 McANS 基因的表达
量与幼叶，功能叶中花青苷量变化规律呈现明显的
一致性。Aharoni 等[19]在草莓上通过抑制 ANS 基因
的表达量，使花青素的积累明显减少，花冠由粉红
色变为白色，表明该基因对从无色花青素到产生有
色花青素的催化过程是植物红色形成的重要因素之
一。Nakamura 等[20]采用 RNAi 的方法抑制蓝猪耳中
ANS 基因的表达，结果转基因株系花青素的量大大
减少，有一半植株的花朵的颜色变为白色，并且在
温室中种植 3 年花色的遗传稳定。Rosati 等[13]从美国
金钟连翘中克隆得到了 ANS 基因和其启动子，并证
明在连翘 Forsythia suspense (Thunb.) Vahl 的花瓣中
无花色素苷是由于缺少 ANS 基因的表达所致。
Nakatsuka 等[21]发现，ANS 基因的突变是导致龙胆花
变为白色的重要原因。本研究中，FdANS 在金荞麦
花、叶、茎和根中的表达量与花青素变化趋势一致，
表明这些组织中其表达可能与金荞麦花青素的合成
和积累密切相关，这与 Wei 等[22]的研究结果一致。
近年来研究表明，金荞麦籽粒中含有丰富的生
物类黄酮，其质量分数接近苦荞，且超过甜荞[17]，
可作为优质黄酮类物质的天然来源，具有很高的经
济价值。因此，如能通过现代生物技术进一步提高
金荞麦中黄酮类功效物质量，将能够进一步挖掘金
荞麦在保健品和功能食品方面的巨大潜力。
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