全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 5 期 2013 年 3 月
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HPLC 波长切换技术对葛根中 8 种成分的测定及指纹图谱研究
尤春雪,张振秋*,李 峰,侯学智,杨 超
辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600
摘 要:目的 建立高效液相色谱波长切换技术同时测定葛根中 3′-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、
染料木素、芒柄花素、鹰嘴豆芽素 A 8 种成分的量,并建立了葛根的特征指纹图谱,为葛根质量的全面评价提供了科学依据。
方法 采用 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,体积流量
1 mL/min,柱温 30 ℃,进样量 10 μL。结果 3′-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、芒
柄花素、鹰嘴豆芽素 A 的质量浓度分别在 16.10~161.00、103.8~1 038.0、19.82~198.20、2.788~27.880、4.112~41.120、
0.258 4~2.584 0、0.336 2~3.362 0、0.080 5~0.805 0 mg/L 内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系,平均回收率均在 98.0%~
99.4%,RSD 均小于 3.0%(n=6);在指纹图谱研究中,以葛根素为参照峰,标定了 27 个共有峰,指认其中 7 个峰,分析
10 个产地的葛根与共有模式之间具有良好的相似性,相似度均在 0.97 以上。结论 建立的测定方法及指纹图谱分析方法简
便、准确、重复性好、专属性强,为葛根质量的全面评价提供了科学依据。
关键词:葛根;高效液相色谱;波长切换;指纹图谱;葛根素
中图分类号:R286.022 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)05 - 0616 - 06
DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2013.05.023
Determination and fingerprint analysis of eight constituents in Puerariae Radix
by HPLC wavelength switching
YOU Chun-xue, ZHANG Zhen-qiu, LI Feng, HOU Xue-zhi, YANG Chao
Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China
Key words: Puerariae Radix; HPLC; wavelength switching; fingerprint; puerarin
葛根为豆科植物野葛 Pueraria lobata (Willd.)
Ohwi 的干燥根,收载于《中国药典》2010 年版。
具有解肌退热、生津止渴、透疹、通经活络等功效。
临床用于外感发热头痛、项背强痛、麻疹不透、胸
痹心痛等[1]。现代药理研究证明,葛根素、大豆苷
等异黄酮类物质具有降低血压、减缓心率、抑制动
脉硬化、抗肿瘤、神经组织保护等作用[2]。
《中国药典》2010 年版葛根项下对葛根素进行
了测定。目前已有报道采用高效液相色谱法同时测
定葛根中葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素、染
料木素的量,检测波长为 250 nm[3-6]。但还未见采
用HPLC波长切换技术[7-8]同时测定葛根中 8种成分
的研究报道,因此本实验采用高效液相波长切换技
术同时测定了葛根中 3-羟基葛根素、葛根素、大豆
苷等 8 种成分的量,并建立了葛根的特征指纹图谱,
首次标定了27个共有峰,并且指认了其中的7个峰。
此方法简便、准确、稳定、重复性好、专属性强,
为葛根质量的全面评价提供了科学依据。
1 仪器与材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪(配置四元梯度
泵,在线脱气机,VWD 检测器,安捷伦 HP—1100
工作站);AS3120A 超声提取器(天津奥特赛恩斯
仪器有限公司);AR2140 电子分析天平(上海奥豪
斯公司);Mettler AB135—S 十万分之一电子天平
(瑞士);U—3010 紫外-可见分光光度计(日立公
司);101 型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪
器厂);中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A
(国家药典委员会);SPSS 14.0 统计软件。
葛根素(批号 752-9002)、大豆苷(批号
111738-200501)、染料木苷(批号 111709-200501)、
收稿日期:2012-08-19
基金项目:辽宁省教育厅课题——中药材品质评价体系研究(2008S145)
作者简介:尤春雪(1987—),女,辽宁凤城人,辽宁中医药大学研究生,研究方向为中药质量控制。Tel: 13841542716 E-mail: youchunxue@163.com
*通信作者 张振秋 Tel: (0411)87586058 E-mail: zhangzhenqiu@sina.com
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大豆苷元(批号 1502-200101)、染料木素(批号
111704-200501)、芒柄花素(批号 111703-200602)、
鹰嘴豆芽素 A(批号 111708-200501)对照品均购
于中国食品药品检定研究院;3′-羟基葛根素(批号
101103,经 HPLC 归一化法测定,质量分数为
98.5%)购于四川省维克奇生物科技有限公司。葛
根经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为豆科植物野
葛 Pueraria lobata (Willd.) Ohwi 的干燥根,来源见
表 1。乙腈、甲醇为色谱纯,水为纯净水,其他试
剂均为分析纯。
表 1 样品来源信息
Table 1 Sources of samples
编号 来源 收集时间
1 辽宁 2010-03
2 北京 2010-07
3 广西 2010-07
4 上海 2010-07
5 河北 2010-07
6 山东 2010-08
7 浙江 2010-08
8 江苏 2010-08
9 吉林 2010-03
10 黑龙江 2010-03
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6
mm,5 μm),流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液
(B),梯度洗脱 0~3 min,5% A;3~25 min,9% A;
25~50 min,12% A;50~65 min,13% A;65~75 min,
16% A;75~100 min,22% A;100~110 min,32% A;
110~125 min,42% A;125~140 min,60% A;体
积流量 1 mL/min;柱温 30 ℃,进样量 10 μL,检测
波长:247 nm(0~25 min,3′-羟基葛根素)、250 nm
(25~47 min,葛根素)、259 nm(47~56 min,大豆
苷)、261 nm(56~90 min,染料木苷)、248 nm(90~
110 min,大豆苷元)、261 nm(110~120 min,染料
木素)、248 nm(120~125 min,芒柄花素)、261 nm
(125~140 min,鹰嘴豆芽素 A)。指纹图谱检测波长
除了(25~47 min)改为 280 nm 外,其他同测定条
件。在上述色谱条件下,理论塔板数以葛根素色谱
峰计不低于 25 000,分离度>1.5。混合对照品溶液、
供试品溶液、空白溶剂色谱图见图 1。
2.2 对照品溶液的制备
2.2.1 对照品储备液的制备 分别精密称取 3′-羟
1-3′-羟基葛根素 2-葛根素 3-大豆苷 4-染料木苷 5-大豆苷元 6-染料木素 7-芒柄花素 8-鹰嘴豆芽素 A
1-3′-hydroxypuerarin 2-puerarin 3-daidzin 4-genistin 5-daidzein 6-genistein 7-formomonetin 8-biochanin A
图 1 混合对照品溶液 (A)、葛根供试品溶液 (B) 和空白溶剂 (C) 色谱图
Fig. 1 Chromatograms of mixed reference solution (A), sample solution of Puerariae Radix (B), and blank solvent (C)
基葛根素、葛根素对照品适量,加 30%甲醇分别制成
含 0.805 mg/mL 3′-羟基葛根素、1.298 mg/L 葛根素的
对照品储备液;精密称取大豆苷、染料木苷、大豆苷
元、染料木素、芒柄花素、鹰嘴豆芽素 A 对照品适量,
加甲醇分别制成含大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染
料木素、芒柄花素、鹰嘴豆芽素 A 0.708 0、0.398 4、
0.875 0、0.184 6、0.186 8、0.016 1 mg/mL 的对照品
储备液。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密量取上述
对照品储备液适量,加水制成含 3′-羟基葛根素、葛
根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、
芒柄花素、鹰嘴豆芽素 A 分别为 80.5、519.0、99.1、
13.94、20.56、1.292、1.681、0.402 5 μg/mL 的混合
对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取葛根 0.5 g(粉碎,过 40 目筛),精密称定,
置 100 mL圆底烧瓶中,精密加入 70%乙醇 20 mL,
称定质量,回流提取 2 次,每次 2 h,放冷,再称
0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140
1
2
3
4 5 6 7 8
1
2
3
4 5 6 7 8
6
7
8
A B C
t / min
115 120 125 130
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定质量,用 70%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤
过;精密量取 5 mL,置 10 mL 量瓶中,加 30%乙
醇至刻度,摇匀,过 0.45 μm 微孔滤膜,取续滤
液,即得。
2.4 定量测定
2.4.1 线性关系考察 分别取“2.2.2”项下的混合
对照品溶液用甲醇稀释成 6 个不同质量浓度的对照
品溶液,每个质量浓度平行测定 3 次,以质量浓度
为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲
线,计算回归方程,结果见表 2。
2.4.2 精密度试验 精密吸取葛根样品的供试品溶
液 10 μL,连续进样 6 次,测得 3′-羟基葛根素、葛
表 2 8 个成分的线性回归方程、相关系数和线性范围
Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients, and linear ranges of eight constituents
成分 线性回归方程 r 线性范围 / (mg·L−1)
3′-羟基葛根素 Y=60.39 X+58.23 0.999 2 16.10~161.00
葛根素 Y=44.91 X-1 009.70 0.999 4 103.8~1 038 0
大豆苷 Y=37.02 X-188.65 0.999 4 19.82~198.20
染料木苷 Y=56.31 X-45.10 0.999 4 2.788~27.880
大豆苷元 Y=67.37 X-81.90 0.999 4 4.112~41.120
染料木素 Y=80.12 X-4.87 0.999 2 0.258 4~2.584 0
芒柄花素 Y=63.17 X-7.31 0.999 4 0.336 2~3.362 0
鹰嘴豆芽素 A Y=66.23 X-1.18 0.999 3 0.080 5~0.805 0
根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、
芒柄花素、鹰嘴豆芽素 A 峰面积的 RSD 分别为
1.8%、1.6%、2.0%、2.3%、2.0%、2.4%、2.9%、
2.7%。结果表明,仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验 取 1 号样品 6 份(粉碎,过 40
目筛),每份约 0.5 g,精密称定,按“2.3”项下方
法平行制备成供试品溶液,分别进样 10 μL 进行测
定。结果 3′-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、染料木
苷、大豆苷元、染料木素、芒柄花素、鹰嘴豆芽素
A 量的平均值(n=6)分别为 3.840、29.32、4.519、
0.707 7、1.012、0.103 4、0.090 3、0.017 70 mg/g;
RSD 分别为 2.2%、1.8%、2.0%、2.2%、2.1%、2.6%、
2.8%、2.9%。
2.4.4 稳定性试验 取 1 号样品的供试品溶液,在
室温下放置,分别在 0、2.5、5.0、7.5、12.0、24.0 h
进样 10 μL,测得 3′-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、
染料木苷、大豆苷元、染料木素、芒柄花素、鹰嘴
豆芽素 A 峰面积的 RSD(n=6)分别为 1.9%、1.6%、
1.9%、2.5%、1.9%、2.5%、2.8%、2.8%。结果表明,
供试品溶液中上述 8 个成分在 24 h 内稳定性良好。
2.4.5 加样回收率试验 取已知测定的 1 号样品 6
份(粉碎,过 40 目筛),每份约 0.25 g,精密称定,
分别置圆底烧瓶中。精密加入 3′-羟基葛根素、葛根
素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、芒
柄花素、鹰嘴豆芽素 A 的对照品储备液各 1.2、3.0、
1.6、0.45、0.30、0.14、0.12、0.28 mL,按“2.3”
项下的方法制备供试溶液,在上述色谱条件下分别
进样 10 μL 进行测定,计算回收率,8 个成分的平
均回收率分别为 98.1%、98.9%、98.0%、99.2%、
99.4%、98.8%、98.4%、98.5%,RSD 分别为 1.7%、
1.6%、1.5%、2.2%、1.6%、2.2%、2.7%、2.6%。
2.4.6 样品测定 取各产地葛根 0.5 g(粉碎,过 40
目筛),精密称定,按“2.3”项下的方法制备供试品
溶液,在上述色谱条件下分别进样 10 μL 进行测定,
外标法计算样品中 8 种成分的量,结果见表 3。
2.4.7 样品测定结果分析 采用 HPLC 波长切换方
法对 10 个不同产地的葛根进行了定量测定。3′-羟
基葛根素的量为 3.118~7.561 mg/g,葛根素的量为
27.65~43.34 mg/g,大豆苷的量为 4.399~9.130
mg/g,染料木苷的量为 0.653 4~0.947 0 mg/g,大
豆苷元的量为 0.624 8~1.267 0 mg/g,染料木素的
量为 0.050 20~0.110 40 mg/g,芒柄花素的量为
0.042 46~0.103 00 mg/g,鹰嘴豆芽素 A 的量为
0.006 289~0.042 240 mg/g。《中国药典》2010 年版
规定葛根中葛根素的量大于 2.4%,结合本实验研究
数据表明,不同产地的葛根中葛根素量均符合药典
要求。根据葛根素量的高低,不同产地葛根质量排序
为上海>浙江>北京>广西>河北>山东>江苏>
辽宁>黑龙江>吉林。但其他 7 个指标性成分的量
差异较大,只用葛根素量高低不能准确评价葛根的
质量,所以本实验通过加权系数综合评分法、灰关
联度法和聚类分析法对测定结果进行综合分析,以
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表 3 不同产地葛根中 8 个成分测定结果
Table 3 Determination of eight constituents in Puerariae Radix from different habitats
质量分数 / (mg·g−1) 编号
3′-羟基葛根素 葛根素 大豆苷 染料木苷 大豆苷元 染料木素 芒柄花素 鹰嘴豆芽素 A
1 4.121 30.31 4.704 0.724 3 1.047 0 0.110 40 0.091 10 0.017 920
2 6.475 39.05 7.523 0.829 0 0.788 0 0.076 38 0.103 00 0.009 530
3 7.352 36.80 7.868 0.723 6 0.910 0 0.064 60 0.064 73 0.042 240
4 7.561 43.34 9.130 0.947 0 0.624 8 0.050 20 0.042 46 0.006 289
5 3.118 35.72 5.354 0.701 0 1.267 0 0.067 73 0.097 70 0.010 970
6 5.520 33.55 6.642 0.772 6 1.072 0 0.079 92 0.074 36 0.009 510
7 6.670 41.72 8.950 0.892 0 0.984 0 0.067 45 0.050 08 0.008 430
8 4.230 32.09 4.596 0.653 4 1.021 0 0.090 90 0.066 81 0.012 050
9 3.698 27.65 4.399 0.713 4 0.910 0 0.073 47 0.087 80 0.014 930
10 3.846 28.41 4.418 0.687 7 0.971 0 0.101 60 0.079 19 0.017 800
全面评价葛根的质量。
加权系数综合评分法:每个成分的权重系数均设
为 0.125, 10 个不同产地葛根(1~10)综合评分依
次如下 0.707 4、0.749 6、0.797 6、0.688 6、0.673 5、
0.695 5、0.730 2、0.632 1、0.619 0、0.657 2。根据综
合评分,不同产地葛根质量排序为广西>北京>浙
江>辽宁>山东>上海>河北>黑龙江>江苏>吉林。
灰关联度法:通过测定不同产地葛根中 8 个指
标性成分量,采用灰关联度法[9],以定义的相对关联
度为测度,构建质量评价模型。10 个不同产地葛根
相对关联度 ri依次如下:0.472 1、0.535 5、0.546 3、
0.500 0、0.454 6、0.471 3、0.532 3、0.352 9、0.375 0、
0.407 0。ri值愈大,评价单元愈佳,因此根据各评价
单元 ri 的大小,不同产地葛根质量排序为广西>北
京>浙江>上海>辽宁>山东>河北>黑龙江>吉
林>江苏。
聚类分析法:以上述 8 个指标性成分的量为一
般变量,得到 10×8 阶原始数据矩阵,运用 SPSS
14.0 统计软件进行聚类分析研究。采用分层聚类分
析(hierarchical cluster analysis)方法,以欧式距离
(euclidean distance)作为样品间的相似性测度,采
用组间联结(between groups linkage)方法,对 10
个产地葛根进行聚类分组,结果见图 2。若将 10 个
不同产地葛根分为两类,由图可知,辽宁、河北、
山东、江苏、吉林、黑龙江的为一类,北京、广西、
上海、浙江的为一类。
综上所述,单纯以葛根素量高低评价葛根的质
量,与以葛根中 8 个指标性成分为指标,运用加权
系数综合评分法、灰关联度法综合评价葛根质量的
结果差别很大,加权系数综合评分法和灰关联度法
图 2 不同产地葛根 8 个指标性成分聚类分析图
Fig. 2 Cluster analysis for eight constituents in
Puerariae Radix from different habitats
评价葛根质量的结果只是中间 3 个产地质量排序不
统一。结合聚类分析法,可以看出灰关联度法更加
合理,若将 10 个产地葛根分为两类,恰好是灰关联
度法中前 4 位为一类,后 6 位为一类,即大体可将
10 个产地的葛根分为质量好和质量稍差两类。
2.5 指纹图谱研究
2.5.1 精密度试验 精密吸取 1 号样品的供试品溶
液 10 μL,连续进样 5 次,以葛根素为参照峰,计
算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 值。
结果显示,各共有色谱峰的相对保留时间的 RSD 均
小于 1%,相对峰面积的 RSD 均小于 3%,表明精
密度良好。
2.5.2 重复性试验 取 1 号样品 5 份(粉碎,过 40
目筛),每份约 0.5 g,精密称定,按“2.3”项下方
法平行制备成供试品溶液,分别进样 10 μL 进行测
定,以葛根素为参照峰,计算共有峰的相对保留时
间和相对峰面积的 RSD 值。结果显示,各共有色谱
峰的相对保留时间的 RSD 均小于 1%,相对峰面积
的 RSD 均小于 3%,表明方法重复性良好。
2.5.3 稳定性试验 取 1 号样品的供试品溶液,在
9
10
1
8
5
6
4
7
2
3
0 5 10 15 20 25
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室温下放置,分别在 0、2.5、5.0、7.5、12.0、24.0 h
进样 10 μL,以葛根素为参照峰,计算共有峰相对
保留时间和相对峰面积的 RSD 值。结果显示,各共
有色谱峰的相对保留时间的 RSD 均小于 1%,相对
峰面积的 RSD 均小于 3%,表明供试品溶液在 24 h
内稳定性良好。
2.5.4 葛根指纹图谱共有模式的建立 精密吸取不
同产地葛根供试品溶液各 10 μL,注入液相色谱仪,
按上述色谱条件进行测定,运用药典委员会中药色
谱指纹图谱相似度评价系统 2004A 进行分析,将实
验数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件,设
定参照图谱,将各色谱峰匹配,然后生成对照图谱。
见图 3。共标定 27 个共有峰,指认其中 7 个峰。
5-3′-羟基葛根素 8-葛根素 14-大豆苷 17-染料木苷 22-大豆
苷元 26-染料木素 27-芒柄花素
5-3′-hydroxypuerarin 8-puerarin 14-daidzin 17-genistin
22-daidzein 26-genistein 27-formomonetin
图 3 10 个产地样品指纹图谱
Fig. 3 Fingerprints of Puerariae Radix
from 10 different habitats
2.5.5 指纹图谱相似度分析 10 个不同产地葛根
指纹图谱与葛根指纹图谱共有模式比较,其相似度
依次为 0.999、0.998、0.987、0.995、0.972、0.993、
0.994、0.996、0.989、0.992,均大于 0.97,所以 10
个产地葛根生成的共有模式指纹图谱可作为葛根的
特征指纹图谱。
2.5.6 指纹图谱聚类分析 将 10 个不同产地的葛
根指纹图谱的 27 个共有峰的相对峰面积作为变量,
得到 10×27 阶原始数据矩阵,运用 SPSS 14.0 软件
进行聚类分析研究。采用的聚类分析方法同“2.4.7”
项,对 10 个不同产地葛根进行聚类分组,结果见图
4。若将 10 个不同产地葛根分为两类,由图可知,
河北、山东、江苏、吉林、黑龙江的为一类,辽宁、
图 4 不同产地样品的聚类分析图
Fig. 4 Cluster analysis of Puerariae Radix
from different habitsts
北京、广西、上海、浙江的为一类,与“2.4.7”中不
同产地葛根 8 个指标性成分聚类分析结果大体一致。
3 讨论
将 8 种对照品溶液于 200~400 nm 波长内进行
UV 全波长扫描,测定其最大吸收波长分别为 3′-羟
基葛根素 247 nm、葛根素 250 nm、大豆苷 259 nm、
染料木苷 261 nm、大豆苷元 248 nm、染料木素 261
nm、芒柄花素 248 nm、鹰嘴豆芽素 A 261 nm。基
于葛根中 8 种成分的最大吸收波长不同,为保证各
成分在最大吸收波长处检测,提高灵敏度,减少干
扰,本实验采用 HPLC 波长切换技术测定葛根中 8
种成分的量。
建立的指纹图谱中,在 25~47 min 的检测波长
分别为 250、280 nm,结果表明,25~47 min 的检
测波长为 250 nm 时,葛根素峰太高,与其他峰比
例不适宜,共标定 23 个共有峰;25~47 min 的检
测波长为 280 nm 时,各峰高低比例适宜,共标定
27 个共有峰。所以指纹图谱 25~47 min 的检测波
长选为 280 nm,在此条件下图谱清晰,各峰高比例
适宜,共有峰数目多,灵敏度高,干扰少。
在提取溶剂的选择上,分别考察了甲醇、乙醇、
丙酮、水,结果表明乙醇的提取效果最好;在提取
方法的选择上,分别考察了索氏、回流、超声 3 种
提取方式,结果发现,回流提取的提取效果最好。
在此基础上,采用 L9(34) 正交试验法,选择乙醇浓
度、溶剂倍量、提取时间、提取次数 4 个因素,进
行 3 水平考察,以葛根中 8 个成分的量为评价指标,
采用加权系数综合评分法进行数据分析,最终确定
葛根的最佳提取工艺为 70%乙醇,40 倍量,回流提
取 2 次,每次 2 h。
单以葛根素量高低来评价葛根质量的方法不准
确,葛根的药效物质不只是葛根素一个成分,而是
多种成分的综合作用,本实验采用高效液相色谱波
0 18.84 37.67 56.51 75.35 94.18 113.02 131.86
R
S10
S9
S8
S7
S6
S5
S4
S3
S2
S1
1
2
3 4
5
6 7
8(s)
9
10
11
12
13
14
15 16
17
18
19 20
21
22
23
24
25 26 27
t / min
1
2
4
7
3
6
10
8
9
5
0 5 10 15 20 25
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 5 期 2013 年 3 月
·621·
长切换技术同时测定葛根中 3′-羟基葛根素、葛根
素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、芒
柄花素、鹰嘴豆芽素 A 8 种成分的量,并建立了葛
根的特征指纹图谱。建立的定量测定及指纹图谱分
析方法简便、准确、重复性好、专属性强,既考察
了葛根中多个指标性成分的量,又考察了其指纹图
谱整体相似度,为葛根质量的全面评价提供了科学
依据。
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