全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月

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制备色谱分离竹叶黄酮中异荭草苷和荭草苷
许 将，范康梅，钱俊青*
浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014
摘 要：目的 建立制备型高效液相色谱（PHPLC）分离竹叶黄酮中异荭草苷和荭草苷的方法。方法 竹叶黄酮经 AB-8 树
脂吸附洗脱纯化后，采用 PHPLC 分离异荭草苷和荭草苷，制备色谱条件：流动相为甲醇-0.3%乙酸水溶液（32∶68），体积
流量为 5 mL/min，柱温为 20 ℃，检测波长 330 nm，进样体积为 400 μL，上样质量浓度为 15.3 mg/mL。结果 HPLC 检测
表明，异荭草苷的质量分数＞99%，荭草苷的质量分数＞93%，加样回收率分别为（92.7±2.92）%和（85.1±3.45）%。单
体结构通过核磁共振碳谱和氢谱鉴定，确定为异荭草苷和荭草苷。结论 该法分离效果较好，低毒，回收率高，可用于竹叶
黄酮中 2 种黄酮苷的分离制备。
关键词：竹叶黄酮；异荭草苷；荭草苷；制备色谱；分离纯化
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)15 - 2184 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.15.012
Isolation of isoorientin and orientin from bamboo leaf flavones using preparative
high-performance liquid chromatography
XU Jiang, FAN Kang-mei, QIAN Jun-qing
College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China
Abstract: Objective To establish a method for preparation of orientin and isoorientin from bamboo leaf flavones (BLF) using
preparative high-performance liquid chromatography (PHPLC). Methods After BLF was purified by AB-8 resin-based column
chromatography, PHPLC was employed to isolate orientin and isoorientin, using a mobile phase consisting of methyl alcohol-water
with 0.3% acetic acid (32 : 68). The flow rate was 5 mL/min while the column temperature was maintained at 20 ℃. The injection
volume was 400 μL and the concentration of sample was 15.3 mg/mL. Signal was monitored at 330 nm with the diode array detector.
Results HPLC analysis showed that the purities of isoorientin and orientin were > 99% and > 93%, respectively, and the recovery
rates were (92.7 ± 2.92)% and (85.1 ± 3.45)%, respectively. The confirmation of chemical structures was performed by 1H-NMR and
13C-NMR. Conclusion The method is simple, with low toxicity but high recovery rate, and can be applied to the separation and
preparation of isoorientin and orientin.
Key words: bamboo leaf flavones; isoorientin; orientin; preparative high performance liquid chromatography; isolation and purification

竹叶抗氧化物是《食品添加剂使用标准》GB
2760—2011 中允许使用的一种天然食品添加剂，因
具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、抗菌及保护
心脑血管的作用[1-7]而被广泛应用于食品、医药和化
妆品当中，已经受到国内外市场的广泛关注。
竹叶黄酮中主要包括黄酮、内酯和苯酚类物
质[8-9]，其中黄酮类的 2 种主要成分是荭草苷和异荭
草苷[10]。由于竹叶黄酮中单体的价格极为昂贵，对
进一步定性定量研究其生理活性及结构修饰造成了
不便。异荭草苷和荭草苷是一对同分异构体。Zhang
等[10]曾使用树脂吸附洗脱，制备型高效液相色谱
（PHPLC）分离和结晶 3 步来分离竹叶黄酮中的 4
种碳苷黄酮，其中，PHPLC 分离选择了较低体积分
数的乙腈水梯度洗脱，分离时间较长，且分离纯度
不理想（仍需进一步结晶纯化）。本实验考察了甲醇
水比例，进行等度洗脱，并做了单因素条件的优化，
分离时间大大缩短，且分离所得单体的质量分数和
回收率都达到了理想的结果。

收稿日期：2014-02-19
基金项目：浙江省重点科技创新团队项目（2010R50032）
作者简介：许 将（1984—），男，硕士。Tel: (0571)88320903 13989476321 E-mail: coolxjly@163.com
*通信作者 钱俊青，教授，博士生导师。Tel: (0571)88320903 E-mail: qjq@zjut.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月

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1 仪器与材料
WatersTM 600 型制备液相色谱仪，Waters 2487
双波长紫外检测器，六通进样阀，美国 Waters 公司；
Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪，安捷伦科技公
司；核磁共振波谱仪 AVANCE III 500 MHz，瑞士
Bruker 公司；BS124S 电子分析天平，赛多利斯科
学仪器有限公司；KQ—2200 超声波清洗器，昆山
市超声仪器有限公司；ULUP—I 微量分析型超纯水
机，成都超纯科技有限公司；R—201 旋转蒸发仪，
上海申生科技有限公司。
AB-8 树脂，南开大学化工部，颗粒粒径：0.3～
1.25 mm；竹叶黄酮，由浙江圣氏生物公司提供，
批号 20121114，荭草苷和异荭草苷的质量分数分别
为 3.7%和 1.6%；异荭草苷对照品（批号 110120）、
荭草苷对照品（批号 110319），质量分数均＞98%，
上海融禾医药科技发展有限公司；乙腈，色谱纯，
Promptar 有限责任公司；水为超纯水，其他试剂均
为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
分析条件：采用 C18 反相色谱柱（150 mm×4.6
mm，5 μm，Sigma），柱温 30 ℃，流动相为乙腈-0.3%
乙酸水溶液，梯度洗脱条件：0～16 min，11%乙腈；
16～18 min，11%～13%乙腈；18～40 min，13%～
16%乙腈；40～42 min，16%～18%乙腈；42～60
min，18%～100%乙腈；60～65 min，100%～11%
乙腈；进样量为 20 μL，体积流量为 0.7 mL/min，
检测波长为 330 nm，运行时间为 70 min。
PHPLC 条件：使用 C18 反相半制备色谱柱（250
mm×10 mm，5 μm，SunFireTM），柱温为 20 ℃，
甲醇-0.3%乙酸水溶液（33∶67），进样体积 400 μL，
体积流量 5 mL/min，检测波长 330 nm，运行时间为
40 min。
2.2 样品的吸附洗脱
称取 50 g 的竹叶黄酮（HPLC 检测见图 1-a），
使用 500 mL 无水乙醇溶解，真空抽滤除去极性大
的多糖类物质，然后将清液旋干，再使用 1 L 纯水
溶解，真空抽滤除去极性小的黄酮内酯类的物质。
将处理好的样品用超纯水稀释至 4 L（质量浓度约
为 8 g/L），并调节 pH 值为 5，上样于装好 AB-8 树
脂的常压玻璃柱中（10 cm×60 cm）[11]，依次使用
1.5 BV 的 0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、
65%乙醇溶液洗脱，收集时每 500 毫升为 1 瓶，其
中 40%乙醇洗脱条件下，得到异荭草苷（质量分数
18.0%）和荭草苷（质量分数 10.1%）的洗脱液（HPLC
检测见图 1-b）。



图 1 竹叶黄酮色谱图 (a) 和 40%乙醇洗脱后的竹叶黄酮色谱图 (b)
Fig. 1 HPLC of original BLF (a) and 40% ethanol fraction of BLF (b)

2.3 荭草苷和异荭草苷单体的 PHPLC 分离
将“2.2”项所得的洗脱液（质量浓度为 4.2
mg/mL），按“2.1”项中的 PHPLC 条件进行单体分
离。分别收集组分 1、2，经一步分离即可得到高质
量分数的荭草苷和异荭草苷单体，通过减压蒸馏，
真空干燥得到产品粉末，竹叶黄酮苷类化合物的
PHPLC 图见图 2。
2.4 PHPLC 单因素的考察
2.4.1 流动相的选择 在柱温 15 ℃，体积流量为 3
mL/min，上样质量浓度为 4.2 mg/mL，上样体积为
200 μL 的条件下，考察了不同比例的甲醇和水对黄
酮苷的分离效果的影响，从相邻峰的分离度和收集
馏分的效率综合分析，选取了甲醇-0.3%乙酸水溶液
33∶67 作为流动相的比例，结果见表 1。
异荭草苷
异荭草苷
荭草苷
0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70
t / min
a b
荭草苷
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图 2 PHPLC 分离竹叶黄酮的色谱图
Fig. 2 PHPLC of BLF

表 1 流动相组成对分离的影响 ( x ±s, n＝2)
Table 1 Effect of composition of mobile phase
on separation ( x ±s, n＝2)
tR / min 甲醇-0.3%乙酸
水溶液
分离度
荭草苷 异荭草苷
25∶75 ＞2.5 ＞90 ＞90
30∶70 ＞2.5 ＞90 ＞90
33∶67 2.34±0.03 39.01±0.02 43.79±0.02
35∶65 1.95±0.02 33.76±0.01 37.57±0.01
37∶63 1.37±0.01 22.13±0.02 23.89±0.03
40∶60 0.95±0.06 16.89±0.05 17.86±0.04
50∶50 0 4.30±0.02 4.30±0.02

2.4.2 流动相体积流量的影响 在柱温 15 ℃，上
样浓度为 4.2 mg/mL，上样体积为 200 μL 的条件下，
以甲醇-0.3%乙酸水溶液（33∶67）作为流动相，由
于体积流量超过 5 mL/min 时，压力超过 27.58 kPa，
制备柱会渗漏，故本实验只考察了 3、5 mL/min 对
黄酮苷分离效果的影响，结果见表 2。

表 2 流动相的体积流量对分离的影响 ( x ±s, n＝2)
Table 2 Effect of current velocity of mobile phase
on separation ( x ±s, n＝2)
tR / min 体积流量 /
(mL·min−1)
分离度
荭草苷 异荭草苷
3 2.34±0.03 39.01±0.02 43.79±0.02
5 2.29±0.01 26.93±0.02 30.51±0.01

2.4.3 柱温的影响 在体积流量为 5 mL/min，上样
质量浓度为 4.2 mg/mL，上样体积为 200 μL 的条件
下，以甲醇-0.3%乙酸水溶液（33∶67）作为流动相，
考察了不同柱温对黄酮苷分离效果的影响，结果见
表 3，本实验选择了 20 ℃作为分离的柱温。
2.4.4 上样量的考察 在柱温为 20 ℃，体积流量
为 5 mL/min 的条件下，以甲醇-0.3%乙酸水溶液
（33∶67）作为流动相，考察了不同上样量对分离效
果的影响，结果见表 4。

表 3 柱温对分离的影响 ( x ±s, n＝2)
Table 3 Effect of column temperature on separation
( x ±s, n＝2)
tR / min 温度 / ℃ 分离度
异荭草苷 荭草苷
15 2.31±0.01 28.90±0.02 32.16±0.03
20 2.32±0.03 27.27±0.01 30.79±0.06
30 1.38±0.05 25.24±0.06 28.57±0.05

表 4 进样量对分离的影响 ( x ±s, n＝2)
Table 4 Effect of loading quantity of sample
on separation ( x ±s, n＝2)
tR / min 质量浓度 /
(mg·mL−1)
进样体
积 / μL
分离度
荭草苷 异荭草苷
4.2 200 2.58±0.02 26.93±0.03 30.52±0.02
30.7 200 无法分离
30.7 100 无法分离
20.5 200 2.28±0.10 27.78±0.02 32.45±0.01
20.5 300 1.92±0.00 28.11±0.07 33.70±0.08
20.5 400 无法分离
15.3 400 2.73±0.01 27.87±0.05 32.91±0.05

2.5 产品质量分数分析和回收率计算
用外标法定量，异荭草苷的进样质量浓度为
39.3～275.3 μg/mL，荭草苷的进样质量浓度为
50.4～402.5 μg/mL 时，进样质量浓度（X，μg/mL）
与峰面积（Y）呈良好的线性关系。线性回归方程分
别为异荭草苷 Y＝0.017 7 X＋0.096 1，R2＝0.999 8；
荭草苷 Y＝0.016 0 X－3.125 4，R2＝0.999 7。
分离得到荭草苷和异荭草苷的 HPLC 图谱见
图 3，荭草苷和异荭草苷的质量分数通过面积归一
法计算分别为（93.38±0.33）%，（99.44±0.37）%；
回收率通过外标法计算分别为（85.1±3.45）%，
（92.7±2.92）%。
2.6 产品结构表征
组分 1（荭草苷）溶液除去溶剂后溶解于氘代
DMSO 中，做核磁共振分析，与文献报道[12-13]比对
后，氢谱和碳谱核磁数据归属如下。13C-NMR (126
MHz, DMSO) δ: 182.45 (C-4), 164.46 (C-2), 162.20
(C-7), 159.93 (C-5), 156.97 (C-9), 148.43 (C-4′),
146.46 (C-3′), 122.44 (C-1′), 119.44 (C-6′), 116.14
组分 2
组分 1
0 10 20 30 40
t / min
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图 3 组分 1 (a) 和组分 2 (b) 的检测色谱图
Fig. 3 Aanalytical HPLC of fractions 1 (a) and 2 (b)

(C-5′), 113.67 (C-2′), 109.44 (C-8), 104.67 (C-10),
102.37 (C-3), 98.67 (C-6), 83.66 (C-5″), 80.65 (C-3″),
75.37 (C-l″), 73.38 (C-2″), 72.91 (C-4″), 62.11
(C-6″)；1H-NMR (500 MHz, DMSO) δ: 13.18 (1H, s,
5-OH) 7.54 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6′), 7.47 (1H,
d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.87 (1H, d, J = 8.4 Hz, 5′-H),
6.65 (1H, s, 3-H), 6.25 (1H, s, 6-H), 4.70 (1H, d, J =
9.7 Hz, H-1″), 3.72 (1H, d, J = 11.8 Hz, H-6a″), 3.46
(1H, d, J = 11.8 Hz, H-6b″), 3.17～3.46 (3H, m, H-3″,
4″, 5″)。
组分 2（异荭草苷）溶液除去溶剂后溶解于氘
代甲醇中，做核磁共振分析，氢谱和碳谱核磁数据
归属如下。13C-NMR (126 MHz, CD3OD) δ: 184.40
(C-4), 166.62 (C-2), 164.99 (C-7), 162.15 (C-5),
159.45 (C-9), 151.10 (C-4′), 147.09 (C-3′), 123.47
(C-1′), 120.38 (C-6′), 116.86 (C-5′), 114.23 (C-2′),
109.23 (C-6), 105.25 (C-10), 103.98 (C-3), 95.30
(C-8), 82.65 (C-5″), 80.18 (C-3″), 75.38 (C-1″), 72.69
(C-4″), 71.83 (C-2″), 62.89 (C-6″)；1H-NMR (500
MHz, CD3OD) δ: 7.36 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6′),
7.36 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.90 (1H, d, J = 8.4 Hz,
H-5′), 6.53 (1H, s, H-3), 6.48 (1H, s, H-8), 4.64 (1H,
d, J = 9.7 Hz, H-1″), 3.85 (1H, m, H-2″), 3.73 (1H, d,
J = 11.8 Hz, H-6a″), 3.43 (1H, d, J = 11.8 Hz, H-6b″),
3.30～3.31 (3H, m, H-3″, 4″, 5″)。
3 讨论
与分析色谱比较，PHPLC 要求在尽可能短的时
间内获得更多的目标产物，属于非线性色谱。目标
产物的质量分数、产量、消耗时间和成本等往往是
PHPLC 的主要考虑因素[14]。本实验以 2 种组分的分
离度和保留时间作为考察指标来综合评价分离质量
和分离效率，分别考察了流动相的比例和体积流量、
温度、上样量对色谱分离的影响。
本实验室曾选择乙腈体系分离，分离纯度和分
离效率都比较理想（2 种单体质量分数都可达到
99%），与甲醇体系洗脱比较，荭草苷和异荭草苷在
2 种体系的出峰时间顺序正好相反，且在甲醇体系
中靠近荭草苷的一点杂质（可能为荭草素-2″-O-β-L-
半乳糖苷）仅旋光性与之不同，故很难分开，而乙
腈则有一定的手性拆分能力[15]，所以乙腈体系可以
得到高质量分数的荭草苷。但考虑到乙腈毒性大，
选择了甲醇体系作为流动相。
对于半制备色谱，其他色谱条件确定后，进样
量是最重要的参数，它直接决定生产量的大小和制
备单体的质量分数。实验结果表明，当样品质量浓
度达到 30 mg/mL，色谱分辨率急剧下降，即使减少
上样体积，也不能实现理想的分离，以 20 mg/mL
作为上样质量浓度，上样体积超过 400 μL 时，出现
峰形不对称，表明上样量已超过等温吸附的线性范
围。确定上样量为 6 mg 后，进一步将上样质量浓
度减小为 15.3 mg/mL 时，可以得到更理想的分离
度，最终确定上样质量浓度 15.3 mg/mL，上样体积
400 μL，单次上样量为 6.12 mg。
本实验通过单次 PHPLC 分离，即可得到异荭
草苷和荭草苷单体，整个过程用时短（仅需 40 min），
毒性低，分离效果较好，可连续进样制备。分离所
得的产品异荭草苷的质量分数＞99%，荭草苷的质
量分数＞93%，适于新药研发的分析样品。
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荭草苷 异荭草苷
0 10 20 30 0 10 20 30
t / min
a b
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