全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

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芍药肌动蛋白基因组 DNA 的克隆及分析
范丙友 1*，张文婷 1，徐 杰 1，骞光耀 1，高水平 2，郭丽丽 1，侯小改 1
1. 河南科技大学农学院 河南省高校牡丹工程技术中心，河南 洛阳 471003
2. 河南科技大学林学院，河南 洛阳 471003
摘 要：目的 克隆芍药 Paeonia lactiflora 肌动蛋白（Actin）基因组 DNA 序列并解析基因结构，分析 Actin 基因在芍药不
同组织中的表达情况。方法 根据本课题组报道的芍药 Actin 基因 cDNA 序列（JX310002）设计特异性引物，以芍药栽培品
种“桃花飞雪”总 DNA 为模板，用 KOD-Plus 高保真 DNA 聚合酶扩增芍药 Actin 基因组基因，克隆 PCR 产物并进行测序。
应用生物信息学软件预测芍药 Actin 基因的外显子及内含子，基于 Blastn 程序分析芍药 Actin 基因在核苷酸水平上的同源性，
应用 MEGA5.0 软件构建分子系统进化树；设计跨越内含子的半定量 RT-PCR 扩增引物，分析芍药 Actin 基因在芍药根、茎、
叶、花中的表达情况。结果 测序结果表明芍药 Actin 基因组 DNA 序列全长 1 405 bp，含 4 个外显子和 3 个内含子，3 个内
含子中共 6 个剪接位点均遵循高等真核生物 5’端供位 GU 与 3’端受位 AG 模式；共编码 377 个氨基酸，GenBank 登录号为
KF363830。设计了一对半定量 RT-PCR 扩增引物，其中上游引物跨越了芍药 Actin 基因的第 1 个内含子，可有效防止由 DNA
污染而造成 RT-PCR 扩增的假阳性；半定量 RT-PCR 分析结果表明 Actin 基因在芍药根、茎、叶、花等不同组织中的表达量
保持恒定。结论 首次克隆了芍药 Actin 基因组 DNA 序列并明确了其基因结构，半定量 RT-PCR 分析结果表明 Actin 基因可
以作为芍药功能基因表达分析的内标基因。
关键词：芍药；肌动蛋白；基因组 DNA；克隆；基因结构；表达分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)14 - 2069 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.14.021
Cloning and analysis of Actin from Paeonia lactiflora
FAN Bing-you1, ZHANG Wen-ting1, XU Jie1, QIAN Guang-yao1, GAO Shui-ping2, GUO Li-li1, HOU Xiao-gai1
1. University Engineering Technology Research Center of Tree Peony of Henan Province, College of Agronomy, Henan University
of Science and Technology, Luoyang 471003, China
2. College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China
Abstract: Objective Genomic gene encoding Actin in Paeonia lactiflora was cloned in order to clarify the gene organization and its
expression levels in different tissues in herbaceous peony. Methods Based on cDNA sequences of Actin genes isolated from P.
lactiflora reported by our laboratory, one pair of PCR primers was designed. PCR products of Actin genomic gene were successfully
amplified with total genomic DNA extracted from herbecous peony cv. “Taohuafeixue” as template by high-fidelity DNA polymerase
KOD-Plus, and then they were cloned to pMD18-T vector and be sequenced. The exons and introns of Actin gene were predicted with
bioinformatic softwares. The homology was analyzed by Blastn at the nucleotide level and the molecular phylogenetic tree was
constructed with MEGA5.0 software. Based on sequencing results, one pair of PCR primers was designed, and the expression levels of
Actin gene in the roots, stems, flowers, and leaves in herbaceous peony were semi-quantified. Results The sequencing results showed
that Actin gene of herbaceous peony was 1 405 bp length, which contained four exons and three introns. All the splicing sites in three
introns were conservative at 5’ donor with GU and 3’ receptor with AG. It encoded 377 amino acids, and GenBank accession number
was KF363830. A pair of PCR primers was designed and one of them was spaned the first intron, which could effectively prevent the
false postive by genomic DNA contamination. The semi-quantitative RT-PCR analysis showed that the expression levels of Actin gene
in the roots, stems, leaves, and flowers of herbaceous peony were almost constant. Conclusion It is the first report on cloning and
gene organization clarification of genomic gene encoding Actin in P. lactiflora. The semi-quantitative analyses indicate that Actin gene
can be used as the internal standard gene for the expression analysis of the functional genes in herbaceous peony.
Key words: Paeonia lactiflora Pall.; Actin; genomic DNA; cloning; gene organization; expression analysis

收稿日期：2014-03-16
基金项目：国家自然科学基金资助项目（U1204323）；河南省科技厅国际合作项目（134300510052）
*通信作者 范丙友（1974—），男，教授。E-mail: fanbingyou2005@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

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芍药Paeonia lactiflora Pall. 为芍药科芍药属芍
药组多年生宿根草本植物，除具观赏价值外，芍药
还有重要的药用价值，是我国传统常用中药材[1]。
根据加工方式的差别，可将其分为赤芍和白芍，赤
芍 Paeoniae Rubra Radix 为芍药或川赤芍 Paeonia
veitchii Lynch 的干燥根，白芍 Paeoniae Alba Radix
为芍药栽培品种去皮水煮后的干燥根[2]。二者均含
有芍药苷（paeoniflorin）、芍药内酯苷（albiflorin）、
羟基芍药苷（ oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍药苷
（benzoylpaeoniflorin）等双环单萜类蒎烯型化合物[3]。
芍药苷是赤芍和白芍中具药用价值的主要药效成
分，也是其质量指标成分[2]，具有免疫调节、镇痛、
镇静、解痉、保肝、扩张血管和抗炎等作用[4]。芍药
苷在芍药各部位分布差异明显，在芍药根中富含芍
药苷[5]，根或根茎是《中国药典》2010 年版中规定
的能够加工为赤芍或白芍的原料[2]。研究表明芍药苷
在芍药新鲜的叶和茎中已经存在，推测芍药苷在叶
中就已合成，之后经茎运向根部[5]。对芍药苷的量与
采收时期及采收部位关系的研究已较为深入[5-6]，但
由于芍药背景复杂，兼之其基础研究较为薄弱，芍
药苷的生物合成及其分子调控机制还知之甚少，亟
需应用现代分子生物学手段探明其机制。
肌动蛋白（Actin）是真核生物细胞中普遍存在
的一种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系统，
参与真核生物细胞的许多重要的生命活动[7]。迄今
为止，已相继从百合[8]、桑树[9]、刺五加[10]、芍药[11]
等高等植物中克隆出 Actin cDNA。Actin 表达量大且
基本恒定，因此在功能基因的表达分析时常作为内
标基因，已应用于茶树[12]、黄瓜[13]、猕猴桃[14]、普
通菜豆[15]等多种高等植物功能基因的表达分析研究
中。尽管本课题组已经克隆了芍药 Actin cDNA，但芍
药 Actin 基因结构仍然未知，无法设计出跨越内含子
的半定量 RT-PCR 扩增引物，从而避免由 DNA 污染
而造成的 RT-PCR 扩增假阳性[16-17]。鉴于此，本研究
克隆了芍药 Actin 基因组 DNA 序列并分析了基因结
构，设计了一对 RT-PCR 扩增引物，其中上游引物跨
越了芍药肌动蛋白第 1 个内含子序列，对 Actin 基因
在芍药不同组织中的表达进行了半定量分析，评价了
其作为内标基因的可行性，从而为下一步研究芍药重
要功能基因的表达奠定了基础。
1 材料与试剂
1.1 材料
芍药栽培品种“桃花飞雪”根、茎、叶、花等
新鲜样品采自洛阳市土桥花木种苗有限公司，由卫
志鹏业务经理进行品种鉴定，清洗后液氮保存带回
实验室，立即置于−80℃冰箱备用；大肠杆菌 DH5α
菌株由本实验室提供。
1.2 试剂
高保真 KOD-Plus DNA 聚合酶购自日本
TOYOBO 公司；DNA 凝胶回收试剂盒、克隆载体
pMD18-T、质粒提取试剂盒、限制性内切酶 BamH I
和 Hind III 购自宝生物工程（大连）有限公司，其
余试剂均为进口或国产分析纯。
2 方法
2.1 芍药总 DNA 提取
采用改良 CTAB 法提取芍药根基因组总
DNA[18]，将总 DNA 质量浓度调至 50 ng/μL。
2.2 引物合成
基于本实验室克隆的芍药肌动蛋白 cDNA 序列
（JX310002），利用 Primer Premier 5.0 软件设计一对特
异性 PCR 扩增引物 5’-CGCGGATCCATGGCCGATG-
CTGAGGATATCC-3’和 5’-CCCAAGCTTTTAAAA-
GCACTTCCTGTGGACA-3’，上下游引物分别插入
了 BamH I 和 Hind III 酶切位点，用于对克隆的阳性
重组子进行双酶切鉴定，引物序列由北京华大基因
研究中心合成。
2.3 芍药 Actin 基因的 PCR 扩增
50 μL PCR 扩增体系中含 5 μL 10×缓冲液、5
μL 2.0 mmol/L each dNTP、4 μL 25 mmol/L MgCl2、
1.5 μL 10 pmol/μL 上下游引物、2.5 μL DNA、1 μL
KOD-Plus DNA 聚合酶、29.5 μL ddH2O。PCR 扩增
程序为 94 ℃预变性 2 min，98 ℃ 变性 10 s，55 ℃
退火 30 s，68 ℃ 延伸 1 min，共 35 个循环。
2.4 芍药 Actin 基因 PCR 产物的回收、克隆
用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收芍药Actin基
因 PCR 产物，在对其 3’末端加 A[19]后与克隆载体
pMD 18-T 连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞，过夜培养后进行菌落 PCR 初筛，质粒
PCR 筛选和 BamH I 和 Hind III 双酶切进一步鉴定，
将阳性重组子送至北京华大基因研究中心测序。
2.5 芍药Actin 基因结构分析
应用在线的Augustus 软件[20]（http://bioinf.uni-gre-
ifswald. de/augustus/）对芍药 Actin 基因的外显子和内
含子进行初步预测；应用在线的 Blastn 双序列比对软
件对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对芍药Actin
cDNA 序列（ JX310002 ）和基因组 DNA 序列
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（KF363830）进行双序列比对，人工分析剪接位点供位、
受位与识别序列等信息，分析芍药Actin 的基因结构。
2.6 序列同源性分析及分子进化树构建
利用 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）Blastn
程序在核苷酸水平上对芍药肌动蛋白进行序列同源
性分析；使用 MEGA 5.0 软件构建分子系统进化树。
2.7 半定量 RT-PCR 表达分析
基于克隆的芍药肌动动蛋白基因组 DNA 序列
（KF363830），设计一对特异性 PCR 扩增引物
5’-GGAATGGTCAAGGCTGGTTT-3’及 5’-TTCTC-
TGTTGGCTTTGGGGT-3’用于半定量 RT-PCR 分
析，其中上游引物跨越了芍药 Actin 基因的第 1 个
内含子，引物序列由北京华大基因研究中心合成。
分别提取芍药“桃花飞雪”根、茎、叶、花等不
同组织总 RNA[21]，以等量的 RNA 反转录为 cDNA，
取等量 cDNA 进行半定量 RT-PCR 扩增。PCR 反应体
系及 PCR 扩增程序参照本实验室的方法进行[11]。
3 结果与分析
3.1 芍药 Actin 基因的 PCR 扩增
以芍药“桃花飞雪”芍药基因组总DNA 为模板，
成功扩增出了大小约 1 400 bp 的 PCR 产物（图 1）。

1, 2-Actin 基因 PCR 产物
1, 2-PCR products of Actin gene
图 1 芍药 Actin 基因的 PCR 扩增产物
Fig. 1 PCR amplification products of Actin gene
of P. lactiflora
3.2 芍药 Actin 基因克隆
PCR 产物经纯化回收、加 A 后与克隆载体
pMD18-T 连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，菌
落 PCR 初筛；挑取阳性重组子进行过夜培养，用Takara
公司的小提质粒试剂盒提取质粒，质粒 PCR 鉴定结果
表明扩增产物与预测大小相同（图 2），BamH I 和Hind
III 双酶切鉴定结果表明酶切片段大小与预期结果一致
（图 3），表明克隆成功，将鉴定的阳性重组子质粒送至
北京华大基因研究中心进行测序。

1～3-质粒 PCR 产物
1—3-plasmid PCR products
图 2 质粒 PCR 鉴定重组子
Fig. 2 Characterization of recombinants by plasmid PCR

1-BamH I 和 Hind III 双酶切产物
1-Double digestion products by BamH I and Hind III
图 3 双酶切鉴定重组子
Fig. 3 Characterization of recombinant by double
enzyme digestion
3.3 芍药 Actin 基因结构分析
结果表明芍药 Actin 基因组 DNA 全长 1 405 bp，
Augustus 在线分析及 Blastn 双序列分析结果表明芍
药 Actin 基因共含 4 个外显子和 3 个内含子；4 个外
显子的核苷酸序列与本实验分离的芍药 Actin
cDNA 序列（JX310002）完全一致；3 个内含子中
每个供位与受位共 6 个剪接位点均遵循高等真核生
物 5’端供位 GU 与 3’端受位 AG 模式[22]；4 个外显
子区域为 1～60、172～565、650～1 263 和 1 340～
1 405，3 个内含子区域为 61～171、566～649 和
1 264～1 339；共编码 377 个氨基酸（图 4），GenBank
登录号为 KF363830。
3.4 同源性分析
Blastn 分析结果表明芍药 Actin 基因组 DNA 序
列（KF363830）与多种高等植物的 Actin 基因具有
很高的同源性，其中与“红艳争辉”芍药的 Actin 基
Marker 1 2
2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
200 bp
Marker 1 2 3
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
200 bp

Marker 1
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp

1 000 bp
750 bp
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ATGGCCGATGCTGAGGATATCCAGCCCCTTGTCTGTGACAATGGAACTGGAATGGTCAAGgttagtccaatattcttttaaaatttgtct 90
M A D A E D I Q P L V C D N G T G M V K 20
gtcttgattttttgtttttttttgggtgcaagtacttcagttattatcaatggaactaaaagcaatggtctgtatttgtagGCTGGTTTT 180
A G F 23
GCTGGTGATGATGCTCCCAGAGCAGTGTTCCCCAGTATTGTTGGTCGACCCAGACACACTGGAGTCATGGTTGGAATGGGCCAAAAGGAT 270
A G D D A P R A V F P S I V G R P R H T G V M V G M G Q K D 53
GCCTATGTAGGTGATGAAGCACAATCAAAAAGAGGTATTCTTACCTTGAAATATCCTATTGAGCATGGTATAGTCAGCAACTGGGATGAC 360
A Y V G D E A Q S K R G I L T L K Y P I E H G I V S N W D D 83
ATGGAAAAGATCTGGCATCATACGTTCTACAATGAGCTTCGTGTTGCTCCTGAAGAGCACCCAGTGCTCCTCACAGAGGCACCCCTTAAC 450
M E K I W H H T F Y N E L R V A P E E H P V L L T E A P L N 113
CCCAAAGCCAACAGAGAAAAGATGACTCAGATCATGTTTGAGACCTTCAATGTGCCTGCAATGTACGTTGCCATCCAGGCCGTGCTGTCT 540
P K A N R E K M T Q I M F E T F N V P A M Y V A I Q A V L S 143
CTATATGCCAGTGGTCGTACAACTGgttcgtatatttcccatatattatctaaaatttgataccccatttttattattctgtttgagact 630
L Y A S G R T T 151
gattgaattattttgacagGTATTGTGCTGGATTCTGGTGATGGTGTGAGTCACACTGTACCTATCTATGAAGGTTATGCCCTTCCTCAC 720
G I V L D S G D G V S H T V P I Y E G Y A L P H 175
GCTATCCTCCGTCTTGACCTTGCTGGTCGTGATCTCACAGATTCCTTGATGAAGATCTTGACTGAAAGAGGTTACATGTTTACCACCACT 810
A I L R L D L A G R D L T D S L M K I L T E R G Y M F T T T 205
GCTGAACGGGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAGCTAGCATACGTTGCCCTTGATTACGAGCAGGAACTGGAGACTTCCAAAAGCAGC 900
A E R E I V R D M K E K L A Y V A L D Y E Q E L E T S K S S 235
TCATCGGTTGAGAAGAACTACGAATTGCCTGATGGACAAGTCATTACCATCGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTGTTCCAG 990
S S V E K N Y E L P D G Q V I T I G A E R F R C P E V L F Q 265
CCATCACTAATCGGAATGGAAGCTGCTGGAATTCACGAGACTACTTACAATTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATATCAGAAAGGATTTA 1080
P S L I G M E A A G I H E T T Y N S I M K C D V D I R K D L 295
TATGGAAACATTGTTCTCAGTGGTGGATCGACTATGTTCCCTGGTATTGCAGACAGAATGAGCAAGGAAATCACTGCTCTTGCTCCCAGC 1170
Y G N I V L S G G S T M F P G I A D R M S K E I T A L A P S 325
AGCATGAAGATTAAGGTTGTGGCACCGCCTGAGAGAAAATACAGTGTCTGGATTGGAGGGTCTATTCTTGCTTCCCTCAGTACCTTCCAG 1260
S M K I K V V A P P E R K Y S V W I G G S I L A S L S T F Q 355
CAGgtgaacattactttcattttttctctttgttggtttttttttactcatttctgacatggttttttgttaccttcagATGTGGATTTC 1350
Q M W I S 360
CAAGGGTGAATACGATGAATCTGGTCCATCCATTGTCCACAGGAAGTGCTTTTAA 1405
K G E Y D E S G P S I V H R K C F * 377
图 4 芍药 Actin 基因结构及编码的氨基酸序列
Fig. 4 Nucleotide sequences of Actin gene and its encoded amino acids in P. lactiflora
因（JN225878）同源性高达 99%，二者外显子核苷
酸序列仅有 3 个碱基的差异，但后者仅含有 2 个内
含子，而缺失了长度为 111 bp 的第 1 个内含子；与
来自拟南芥、桑、毛果杨、大豆、葡萄及棉属多种
植物的 Actin 相似性达 83%以上，表明高等植物的
Actin 在 DNA 水平上具有较高的保守性。应用
MEGA5.0 软件对同源性较高的近缘植物的肌动蛋
白跨越起始密码子 ATG 和终止密码子 TAA 的编码
区进行多序列比对并构建分子系统进化树（图 5），
结果表明“桃花飞雪”芍药 Actin 基因与“红艳争
辉”芍药 Actin 基因（JN225878）亲缘关系最近，
与桑（Morus alba L.，HM623866）、葡萄（Vitis vinifera
L.，AM465189）、大豆 [Glycine max (L.) Merrill，
V00450] Actin 基因具有相对较近的亲缘关系，与毛
果杨（Populus trichocarpa Torr. & Gray，EF418792）、
小果白刺（Nitraria sibirica Pall.，AB636284）、拟
南芥 [Arabidopsis thaliana (L.) Heynh，ATU41998、
ATU42007] Actin 基因组成的小进化群体亲缘关系
较远，但是由棉属多个物种包括黄褐棉（Gossypium
mustelinum Miers ex Watt，JF722026、JF722027）、

图 5 Actin 基因的分子系统进化树
Fig. 5 Molecular phylogenetic tree of Actin gene

JF722038 辣根棉
JF722025 特伦纳氏棉
JF722039 哈克尼西棉
JF722043 拟似棉
HQ142996雷蒙德氏棉
JF722027 黄褐棉
JF722031 毛棉
JF722029 达尔文氏棉
HQ142998 海岛棉
JF722034 海岛棉
HQ142999 陆地棉
JF722030 毛棉
HQ142997 海岛棉
JF722036 陆地棉
JF722026 黄褐棉
V00450 大豆
AM465189 葡萄
HM623866 桑
KF363830 芍药
JN225878 芍药
EF418792 毛果杨
AB636284 小果白刺
ATU41998 拟南芥
ATU42007 拟南芥
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陆地棉（ Gossypium hirsutum L. ， JF722036 、
HQ142999）、海岛棉（Gossypium darwinii Watt，
JF722029）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii
Ulbrich，HQ142996）、拟似棉（Gossypium barbadense
L.， JF722034 、HQ142997、HQ142998）、毛棉
（ Gossypium tomentosum Nuttall ex Seemann ，
JF722030、 JF722031）、达尔文氏棉 [Gossypium
gossypioides (Ulbrich) Standley，JF722043]、哈克尼
西棉 [Gossypium harknessii Brandegee，JF722039]、
辣根棉 [Gossypium armourianum Kearn，JF722038]
的 Actin 基因都相对集中地分布在小进化群中，说
明棉属植物 Actin 基因之间的进化可能只是在少数
核苷酸产生了突变。由于生理功能的重要性，Actin
在自然选择过程中承受着巨大选择压力，因而核苷
酸序列表现出高度保守[8]。
3.5 半定量 RT-PCR 分析
基于克隆的芍药肌动蛋白基因组 DNA 序列
（KF363830）设计了一对半定量 RT-PCR 扩增引物，
PCR 扩增产物大小约为 309 个碱基；其中上游引物
跨越了第 1 个内含子，可以有效防止由 DNA 污染
而造成的 RT-PCR 扩增结果的假阳性。半定量
RT-PCR 分析表明，Actin 基因在芍药根、茎、叶、
花中的表达量一致（图 6）；因此 Actin 基因能够作
为芍药功能基因半定量 RT-PCR 或荧光定量 PCR 分
析的内参基因。


图 6 Actin 基因在芍药不同组织中的表达
Fig. 6 Expression levels of Actin in different organs
4 讨论
芍药苷属于单萜糖苷，其生物合成通过位于细
胞质中的甲羟戊酸（mevalonate pathway，MVA）途
径 [23]和位于质体中的脱氧木酮糖 -5-磷酸途径
（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP）[24]
或甲基赤藓醇-4-磷酸途径（methylerythritol-4-phos-
phate pathway，MEP）两个代谢途径独立合成。其
代 谢 过 程 可 分 为 中 间 体 异 戊 烯 基 焦 磷 酸
（isopentenylpyrophosphate，IPP，C5）及其双键异
构 体 二 甲 基 烯 丙 基 焦 磷 酸 （ dimethylallyl
pyrophosphate，DMAPP，C5）的生成、直接前体
物质的生成和萜类生成及修饰共 3 个阶段[25]。高等
植物体内 IPP 形成后，即与其异构体 DMAPP 各 1
分子在牻牛儿基二磷酸合酶（geranyl diphosphate
synthase，GPPS）的作用下经头尾缩合生成具 C10
骨架的牻牛儿基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP）；
GPP 在单萜烯合酶（monoterpene synthase）作用下
生成单萜烯（monoterpene，C10）[26-27]，进一步在
修饰酶的作用下生成芍药苷。在本研究中，本实验
克隆了芍药 Actin 基因的基因组序列，分析了其基
因结构，设计了跨越内含子的半定量 RT-PCR 引物，
可以有效防止由 DNA 污染而造成的 RT-PCR 假阳
性；半定量 RT-PCR 分析结果表明 Actin 基因可以作
为芍药功能基因表达分析的内标基因。下一步本课
题组将基于课题组已完成的芍药转录组测序数据，
对参与芍药苷代谢的候选基因进行半定量和定量表
达分析，以期为阐明芍药苷的代谢及分子调控奠定
基础。
参考文献
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Marker 根 茎 叶 花
2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

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