全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月

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硅胶柱色谱-高速逆流色谱法分离纯化羌活中佛手柑内酯
胡利锋 1，廖晓兰 1，柏连阳 1, 2*，周小毛 1
1. 湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128
2. 湖南人文科技学院 农业科学研究所，湖南 娄底 417000
摘 要：目的 以羌活的根和根茎为原料，建立硅胶柱色谱-高速逆流色谱（HSCCC）法制备分离羌活中佛手柑内酯的方法。
方法 羌活粗提物先经过硅胶柱色谱初步分离，富集目标化合物；组分 Q5 再经过 HSCCC 分离，以正己烷-醋酸乙酯-甲醇-
水（5∶5∶4∶5）为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相；经气-质及核磁共振氢谱、碳谱鉴定化合物的结构。结果 经
过 HSCCC 分离后，从 300 mg Q5样品中一次性分离得到佛手柑内酯 37.6 mg，经 HPLC 检测其质量分数达到 99.1%。结论
该方法操作简便、高效，为制备高纯度的佛手柑内酯提供了一条新途径。
关键词：硅胶柱色谱；高速逆流色谱；羌活；香豆素；佛手柑内酯
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)06 - 0701 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.06.013
Separation and purification of bergapten from Notopterygii Rhizoma et Radix
by silica gel column and high-speed counter-current chromatography
HU Li-feng1, LIAO Xiao-lan1, BAI Lian-yang1, 2, ZHOU Xiao-mao1
1. College of Bio-safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
2. Agriculture Research Institute, Hunan Institute of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, China
Key words: silica gel column chromatography; high-speed counter-current chromatography; Notopterygii Rhizoma et Radix;
coumarins; bergapten

羌活为伞形科羌活属植物羌活 Notopterygium
incisum Ting ex H. T. Chang 或宽叶羌活 N. franchetii
Boiss. 的干燥根和根茎，具有散寒祛风、除湿止痛
等功效；用于治疗风寒感冒、头痛、风湿痹痛、肩
背酸痛等症[1]。羌活主要含有挥发油、香豆素类化
合物，除此之外还含有糖类、氨基酸、有机酸、甾
醇等成分[2]。香豆素类化合物是羌活主要的非挥发
性成分，其中作为多种中药材中主要的香豆素类成
分之一的佛手柑内酯具有抗癌作用[3-5]、并可能与一
些中药镇痛的效应有关[6]。此外，华燕青等[7]研究
发现，佛手柑内酯对粘虫和菜青虫具有较强的拒食
活性。近年来，关于羌活的指纹图谱[8-10]和化学成
分[11-13]已有较深入的研究，但是有关羌活中佛手柑
内酯分离鉴定的研究尚未见报道。因此，建立佛手
柑内酯单体化合物的高效制备技术对羌活的质量控
制和进一步开发应用具有重要意义。
传统的硅胶柱色谱分离量大，但存在耗时长、
溶剂消耗量大、分离效率低等缺点。高速逆流色谱
（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）
法是一种能够在数小时内即可实现毫克级样品分离
制备的方法，目前在天然和人工合成产物的分离和
纯化方面得到了广泛的应用[14-15]。本实验采用硅胶
柱色谱法对羌活无水乙醇粗提物进行初分并富集，
用 HSCCC 法对其进行进一步分离，结合利用两种
色谱法的优点，从中分离制备出一种高纯度的香豆
素类化合物，经 GC-MS、1H-NMR 和 13C-NMR 鉴

收稿日期：2012-06-12
基金项目：国家自然科学基金项目（31171891）；湖南省自然科学基金重点项目（10JJ2020）
作者简介：胡利锋（1980—），男，湖南邵阳人，在职博士，讲师，研究方向为天然产物的分离与应用。
Tel: (0731)84618169 E-mail: hf128lucky@126.com
*通信作者 柏连阳 Tel: (0731)84673707 E-mail: bailianyang2005@yahoo.com.cn
网络出版时间：2013-01-09 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130109.1525.004.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月

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定其为佛手柑内酯。本方法实现了经济、快速、有
效分离佛手柑内酯的目的，为羌活的进一步开发应
用提供了参考依据。
1 仪器与材料
KQ3200 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有
限公司）；TBE—300A 高速逆流色谱仪（上海同田
生化技术有限公司）；N2000 色谱工作站（浙江大学
智达信息工程有限公司）；LC 10 AT—VP 高效液相
色谱仪（日本岛津公司），Ultimate C18 反相色谱柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）。5973/6980 气质联用仪
（美国安捷伦公司）；Varian Inova—300 核磁共振仪
器（美国瓦里安公司）。
200～300 目柱层析硅胶（青岛裕民源硅胶试剂
厂），GF 254 硅胶板（青岛海洋化工厂）。正己烷、
石油醚、甲醇、醋酸乙酯等为分析纯（国药集团化
学试剂有限公司）。色谱甲醇（美国 Tedia 天地试剂
公司）。羌活药材购于湖南省药材公司，经湖南农业
大学中药资源与开发系肖深根教授鉴定为羌活
Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang 的干燥根
和根茎。
2 方法与结果
2.1 HPLC 分析条件
色谱柱为 Ultimate XB-C18 柱（250 mm×4.6
mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗
脱程序：0～15 min，45%～50% A；5～20 min，
50%～55% A；20～25 min，55%～55% A；25～30
min，55%～65% A；柱温 30 ℃，体积流量 1 mL/min，
检测波长 330 nm。
2.2 羌活粗提物的制备
将干燥的羌活根和根茎粉碎。称取羌活粉（过
40 目筛）500 g，以无水乙醇为提取溶剂，分多次用
索氏提取器在 90 ℃的水浴中回流提取 6～8 h，直
至提取液无色为止，浓缩得到 120 g 胶状物置于冰
箱中备用。
2.3 硅胶柱色谱初步分离
实验发现，直接以羌活粗提物为 HSCCC 进样
原料时，由于组分过于复杂，达不到理想的分离效
果。采用硅胶柱色谱法进行初分，可以去掉大部分
杂质，使目的组分得到较大程度的富集。分别考察
了石油醚-丙酮、石油醚-醋酸乙酯洗脱系统，经过
TLC 分析，结果显示选用石油醚-丙酮作为洗脱系统
时的分离效果不如石油醚-醋酸乙酯，因此最终选择
石油醚-醋酸乙酯系统进行硅胶柱色谱洗脱。取经无
水乙醇提取的羌活粗提物50 g用硅胶柱色谱进行初
步分离，以石油醚-醋酸乙酯（8∶2、7∶3、6∶4、
5∶5）进行梯度洗脱收集。经薄层色谱（TLC）检
验合并相同馏分，得到 Q1～Q10 组分，经 HPLC 检
测发现组分 Q5（3.9 g）中的化合物在 330 nm 处有
较强的吸收，异羟肟酸铁显色反应呈红色，初步确
定 Q5 中有香豆素类化合物存在，且为几种物质的混
合物（图 1）。将其冷冻干燥，用于 HSCCC 进一步
分离纯化。




图 1 组分 Q5 的 HPLC 图谱
Fig. 1 HPLC chromatogram of fraction Q5

2.4 HSCCC 溶剂体系的选择
选择合适的两相溶剂系统对于 HSCCC 的成功
分离非常关键[14]。对于 HSCCC 来说，分配系数 K
值满足 0.5≤K≤2 时为较理想的范围，而 K 值的最
佳范围为 0.5≤K≤1[16]。本实验中通过测定 K 值来
选择 HSCCC 的溶剂体系。将不同溶剂按比例配制，
混匀，静置平衡后取适量粗提物用下相溶解，取样
10 μL 经 HPLC 检测，峰面积记为 A1；再取该下相
2 mL 与等体积的上相充分混合，静置分层后取 10
μL 下相进行 HPLC 检测，峰面积记为 A2；则 K＝
(A1－A2) / A2。
不同溶剂体系的 K 值见表 1。可以看出，1 和
5 两种溶剂体系各化合物的 K 值都偏大。而 4 组分
1 和 2 的 K 值相差太小，难以对其进行分离。2、3
的 K 值处在理想范围之内，选用体系 2、3 进行
HSCCC 分离，结果表明体系 3 的分离效果更好，因
此确定正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水为 5∶5∶4∶5 作
为 HSCCC 分离的溶剂体系。
2.5 HSCCC 分离制备
将选好的溶剂体系按比例配制，充分混匀后在
室温下静置过夜。使用前，将达到分配平衡的两相
溶剂体系分开后分别放入棕色试剂瓶中，超声脱气
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表 1 不同溶剂体系的 K 值
Table 1 K values of components in different solvent systems
K
编号 溶剂体系
组分 1 组分 2 组分 3
1 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶4.8∶5) 2.10 2.51 4.99
2 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶5∶4) 0.64 0.74 1.12
3 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶4∶5) 0.56 0.63 0.74
4 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶4∶6) 0.76 0.81 0.97
5 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (3∶5∶4∶6) 3.75 4.73 6.02

30 min。将上相（固定相）以 20 mL/min 的体积流
量泵入 HSCCC 的分离管中，待上相充满整个分离
管后，调节主机的转速为 850 r/min，待转速稳定
后，以 1.8 mL/min 的体积流量泵入下相（流动相）。
当两相平衡后，称取经过硅胶柱色谱分离获得的组
分 Q5 样品 300 mg，用 10 mL 下相超声溶解，从进
样口加入。紫外检测波长为 254 nm，按照色谱峰收
集目标成分。
用溶剂体系 3 对组分 Q5进行分离，固定保留率
为 75%（图 2）。总的分离时间为 8 h，手动收集 360～
430 min 流出液，减压干燥得到 37.6 mg 的组分 F，
为淡黄色针状结晶，经 HPLC 检测，面积归一化测
定其质量分数达到 99.1%（图 3）。
2.6 单体化合物的鉴定
采用 GC-MS、1H-NMR 和 13C-NMR 鉴定分离
所得到的组分 F。GC-MS: m/z 216 [M], 201, 187,
173, 145, 89；1H-NMR (CDCl3, 300 MHz,) δ: 8.17
(1H, d, J = 9.9 Hz, H-4), 7.60 (1H, d, J = 2.4 Hz,
H-12), 7.14 (1H, s, H-8), 7.03 (1H, d, J = 2.4 Hz,
H-11), 6.28 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-3), 4.28 (3H, s,
-OCH3)；13C-NMR (D2O, 300 MHz,) δ: 161.31 (C-2),
158.37 (C-7), 152.68 (C-9), 149.55 (C-5), 144.79 (C-




图 2 组分 Q5 的 HSCCC 图
Fig. 2 HSCCC chromatogram of component Q5



图 3 组分 F 的 HPLC 色谱图
Fig. 3 HPLC chromatogram of component F

12), 139.33 (C-4), 112.61 (C-3), 112.53 (C-6), 106.36
(C-10), 105.07 (C-11), 93.83 (C-8), 60.07 (-OCH3)。上
述波谱数据与文献报道基本一致[4,17]，可推测该化
合物为佛手柑内酯。
3 讨论
由于佛手柑内酯具有较强的药理活性，对该化
合物的研究具有较大的实用价值。佛手柑内酯等香
豆素类化合物为羌活中的主要活性成分，该类化合
物在结构和活性方面非常相似，采用传统的硅胶柱
色谱分离纯化羌活中的香豆素不仅溶剂消耗量大、
费时，而且化合物纯度难以达到理想的效果。本实
验采用硅胶柱色谱和 HSCCC 相结合的方法分离制
备羌活中的佛手柑内酯，羌活粗提物首先经过硅胶
柱色谱分离，富集目标化合物，然后采用 HSCCC
将佛手柑内酯与其他组分分离。实验结果表明，通
过这两种方法的联用可以分离制备高纯度的佛手柑
内酯。该方法简便、高效、快速，为从羌活中分离
纯化佛手柑内酯提供了技术参考，为佛手柑内酯的
进一步开发应用奠定了良好的基础。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] 李云霞, 高春华, 沙 明. 中药羌活化学成分及药理作
0 100 200 300 400
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用研究进展 [J]. 辽宁中医学院学报, 2004, 6(1): 22-23.
[3] 王志国, 何 德, 金 洪, 等. 无花果抗癌作用的研究
进展 [J]. 现代生物医学进展, 2010, 10(11): 2183-2186.
[4] 董 芳, 刘汉柱, 孙 阳, 等. 北沙参中佛手柑内酯的
分离鉴定及体外抗肿瘤活性的初步测定 [J]. 植物资源
与环境学报, 2010, 19(1): 95-96.
[5] 王俏先, 张香莲, 高 凌, 等. 无花果抗癌作用的研究
[J]. 癌症, 1999, 9(3): 223-225.
[6] 崔秋兵, 张 艺, 兰 莎. 白芷镇痛作用物质基础研究
[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(12): 102-104.
[7] 华燕青, 李广泽, 陈安良, 等. 藁本中杀虫活性成分的
分离与鉴定 [J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版,
2004, 32(增刊): 54-56.
[8] 刘志刚, 李发美. 羌活的 HPLC 指纹图谱 [J]. 华西药
学杂志, 2008, 23(1): 89-91.
[9] 王海波, 邸 学, 包永睿, 等. 中药羌活 HPLC-荧光指
纹谱研究 [J]. 光谱实验室, 2010, 27(2): 568-572.
[10] Qian G S, Wang Q, Leung K S Y, et al. Quality
assessment of Rhizoma et Radix Notopterygii by HPTLC
and HPLC fingerprinting and HPLC quantitative analysis
[J]. J Pharm Biomed Anal, 2007, 44(3): 812-817.
[11] 李丽梅, 梁宝德, 愈绍文, 等. 羌活的化学成分 [J]. 中
国天然药物, 2007, 5(5): 351-354.
[12] 张文学. 中药羌活的化学成分研究 [J]. 山西中医学院
学报, 2008, 9(4): 45-46.
[13] Yang X W, Zhang P, Tao H Y, et al. GS-MS analysis of
essential oil constituents from rhizome and root of
Notopterygium incisum [J]. J Chin Pharm Sci, 2006,
15(3): 172-177.
[14] Ito Y. Golden rules and pitfalls in selecting optimum
conditions for high-speed counter-current chromato-
graphy [J]. J Chromatogr A, 2005, 1065(2): 145-168.
[15] 冯雪娇, 任 虹, 曹学丽, 等. 鸡血藤中黄酮成分的高
速逆流色谱分离及其抗肿瘤活性研究 [J]. 中草药 ,
2011, 42(11): 2244-2247.
[16] Han S. Separation of salidroside from Rhodiola crenulata
by high-speed counter-current chromatography [J]. J
Chromatogr A, 2002, 971(1/2): 237-241.
[17] 徐希科, 胡 疆, 柳润辉, 等. 无花果根化学成分研究
[J]. 药学服务与研究, 2005, 5(2): 138-140.