全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 5 期 2013 年 3 月 ·557·
高速逆流色谱法分离制备蛹虫草发酵液中虫草素
胡 瑕 1, 2，谢红旗 1, 3，罗 巍 1, 2，夏志兰 1, 2，刘东波 1, 2*
1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128
2. 国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南 长沙 410128
3. 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128
摘 要：目的 以蛹虫草发酵液虫草素粗提物为原料，对高速逆流色谱（HSCCC）分离制备虫草素条件进行研究。方法 利
用 HPLC 测定分配系数法结合分析型 HSCCC 对分离虫草素的溶剂体系进行筛选，确定虫草素分离的最佳溶剂体系为醋酸乙
酯-正丁醇-0.5%氨水（2∶3∶5），并运用此溶剂体系，上相作为固定相，下相作为流动相，利用制备型 HSCCC 分离制备蛹
虫草发酵液中虫草素。结果 400 mg 虫草素粗产品通过制备型 HSCCC 一次分离制备获得质量分数为 98.7%的虫草素产品
43.8 mg。结论 该法效率高，操作简单，为虫草素的大量制备提供了重要参考。
关键词：虫草素；高速逆流色谱；蛹虫草；分配系数；物质基础
中图分类号：R284.2；R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)05 - 0557 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.05.011
Isolation and preparation of cordycepin from Cordyceps militaris fermentation
broth by high speed counter-current chromatography
HU Xia1, 2, XIE Hong-qi1, 3, LUO Wei1, 2, XIA Zhi-lan1, 2, LIU Dong-bo1, 2
1. College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
2. Sub-health Intervention Technology Laboratory, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410128, China
3. Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and Utilization of Hunan Province, Changsha 410128, China
Abstract: Objective To develop a new method for the isolation and preparation of cordycepin by high speed counter-current
chromatography (HSCCC) with Cordyceps militaris fermentation broth as raw material. Methods The solvent systems for
cordycepin separation were assessed and selected by HPLC partition coefficient method and analytical HSCCC. A solvent system that
consisted of ethyl acetate-n-butanol-0.5% ammonia water (2∶3∶5) was applied to the separation. The upper phase was used as the
stationary phase, while the lower phase was used as the mobile phase for the cordycepin separation by HSCCC. Results A high
efficiency of HSCCC separation was achieved. Finally, cordycepin (43.8 mg) was obtained from 400 mg crude extract of C. militaris
fermentation broth in one-step separation with a purity of 98.7%. Conclusion HSCCC is an efficient and simple method for the large-
scale preparation of cordycepin from C. militaris fermentation broth.
Key words: cordycepin; high speed counter-current chromatography; Cordyceps militaris (Fr.) Link; partition coefficient; material basis

蛹虫草 Cordyceps militaris (Fr.) Link，又名北冬
虫夏草、北虫草，属子囊菌亚门，麦角菌目，麦角
菌科，虫草属[1]，与冬虫夏草同属，是我国传统的名
贵中药之一。虫草素（3′-脱氧腺苷）是蛹虫草的主
要活性成分之一，蛹虫草野生和人工培育子实体，
发酵培养的菌丝体及发酵液中均含有虫草素[2-4]。虫
草素具有抗菌、抗 HIV-I 型病毒、抑制肿瘤，提高
机体免疫力等药理活性[5-6]。目前，虫草素的生产量
已经不能满足市场需求，尤其是高纯度虫草素的大
量制备技术的缺乏一定程度上限制了其药理药效的
进一步研究和临床应用。
高速逆流色谱（high speed counter-current chro-

收稿日期：2012-05-05
基金项目：国家科技支撑计划（2012BAD33B11）；湖南省教育厅重点项目（11A048）；湖南省研究生科研创新项目（CX2011B305）
作者简介：胡 瑕（1987—），女，硕士研究生，研究方向为功能成分的分离纯化工程。Tel: 13874962461 E-mail: cherryxiaxia@163.com
*通信作者 刘东波 Tel: (0731)84635293 E-mail: chinasaga@163.com
网络出版时间：2013-01-09 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130109.1526.005.html
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matography，HSCCC）是一种新型的液-液分配色谱
技术，它在天然产物分离中具有独特的优势，不但
分离效率高而且制备量大，同时较传统的色谱技术，
消除了固态载体导致的样品不可逆吸附、对样品的
污染、变性、失活等影响[7-9]。目前，虫草素的分离
主要采用离子交换树脂柱、活性炭色谱柱、硅胶色
谱柱等方法[10-11]，但均存在回收率低、操作步骤繁
琐、难以获得高纯度产品的缺陷。本研究将 HSCCC
技术应用于虫草素的分离制备，旨在获得纯度高的
虫草素。
1 仪器与材料
TBE—20A 高速逆流色谱仪，配有 UV500 紫外
检测器（上海同田生物技术有限公司）；TBE—1000
A 高速逆流色谱仪，配有 TBD—2000 紫外检测器
（上海同田生物技术有限公司）；Laborota 4001—
effient 旋转蒸发仪（德国 Heidolph Instruments 公
司）；SK3300LH 超声波清洗器（上海科导超声仪器
有限公司）；Lab Tech 可见-紫外分光光度计（北京
莱伯泰科仪器有限公司）；FTIR—8400s 傅里叶红外
光谱扫描仪（日本岛津公司）。
实验用原材料蛹虫草发酵液由湖南农业大学亚
健康干预技术实验室提供。
正己烷、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇均为
分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；HPLC 分析
用色谱纯甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；氨水
（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；虫草
素对照品（质量分数≥99%，Sigma 公司）。
2 方法
2.1 虫草素粗提物及样品溶液的制备
取虫草素质量浓度约 0.2 mg/mL 的蛹虫草发酵
液高速离心（4 000 r/min，15 min），将上清液真空
浓缩至虫草素质量浓度为 0.6 mg/mL，然后取 1 800
mL 此样品溶液通过 300 mL 大孔吸附树脂（HPD-
100）初步除杂，上样体积流量为 2 BV/h，用体积
分数为 25%乙醇溶液以 3 BV/h 的体积流量洗脱，洗
脱液浓缩，冷冻干燥，获得虫草素粗提物样品，粗
提物样品中虫草素质量分数为 12.1%。
称取粗提物样品 400 mg，加入选定的溶剂体系
上下相各 30 mL，超声波振荡使之完全溶解，以备
HSCCC 进样。
2.2 虫草素的测定[12]
2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Shim-pack vp-ODS C18
柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水
（15∶85）；体积流量 1 mL/min；进样量 10 μL；检
测波长 260 nm；柱温 35 ℃。
2.2.2 虫草素对照品溶液的配制及线性关系考察
精确称取虫草素对照品 2.0 mg，用甲醇溶解并定容
至 10 mL，配制成 0.2 mg/mL 对照品储备液。分别
准确量取上述储备液用甲醇稀释定容至质量浓度分
别为 10、20、40、80、100 μg/mL 的系列对照品溶
液，以质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵
坐标（Y）进行线性回归，得回归方程 Y＝0.030 9
X＋0.01，r＝0.999 5，表明虫草素在 10～100 μg/mL
线性关系良好。
2.3 HSCCC 溶剂体系的选择
采用 HPLC 法测定虫草素在各溶剂体系中的分
配系数（K）值，取适量粗提物样品于 10 mL 试管
中，用预先达到分配平衡的两相溶剂体系的下相将
其溶解，用 HPLC 进行检测，测得目标组分峰面积
为 A1，然后取等体积的上相加入此溶液，剧烈振荡
让其充分混合，待达到分离平衡后，取下相用 HPLC
检测，峰面积为 A2，则 K＝(A1－A2) / A2。
溶剂体系经测定 K 值初步确定后，利用分析型
HSCCC 进一步快速筛选，具体工作参数如下：进
样体积 500 μL，工作转速 1 800 r/min，温度 28 ℃，
固定相泵入体积流量5 mL/min，流动相体积流量0.5
mL/min，检测波长 260 nm。
2.4 HSCCC 分离
配制溶剂体系醋酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水（2∶
3∶5），按比例配制好溶剂体系，将其反复多次振荡
摇匀后静置过夜，分相平衡后分出上、下相，使用
前用超声波脱气 30 min。开机时首先开启恒温水浴
循环器，设置主机温度为 28 ℃，然后以 40 mL/min
的体积流量将固定相（上相）泵入柱内，当出口有
固定相流出时，表明固定相充满管道。停泵，打开
主机调整转速为 450 r/min，以 8 mL/min 的体积流
量泵入流动相（下相），此时用一个 1 000 mL 的刻
度量筒接收流出液，测定被推出的固定相体积，计
算固定相保留率。当有流动相从出口流出时，体系
达动力学平衡，开启检测器，基线稳定后开始进样，
同时进行图谱采集。检测器波长为 254 nm，根据色
谱图手动收集各色谱峰组分。
2.5 样品结构鉴定及纯度测定
HSCCC 分离得到的目标峰物质通过紫外、红
外扫描与对照品对照以及质谱（EI-MS）分析鉴定
结构。用 HPLC 测定，峰面积归一法计算质量分数。
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3 结果与分析
3.1 溶剂体系的筛选
溶剂体系的选择是 HSCCC 分离中的关键环节，
通常通过测定目标物质在溶剂体系中的K值来判断
溶剂体系是否适合目标组分的分离。对于 HSCCC
分离，目标物质在两相溶剂体系中的 K 值最适范围
为 0.5～2.0[13]。根据虫草素的化学性质及常用的参
考溶剂体系，实验中考察了蛹虫草发酵液中多个组
分在多组溶剂体系中的 K 值，结果见表 1。
在表 1 中，保留时间（tR）为 12.7 min 的组分

表 1 虫草素发酵液各组分在不同溶剂体系中的 K 值
Table 1 K values of different ingredients from C. militaris fermentation broth in various solvent systems
K 值 编号 溶剂体系
组分 1 (tR＝11.8 min) 组分 2 (tR＝12.7 min) 组分 3 (tR＝15.9 min)
1 正己烷-正丁醇-甲醇-水 (4∶3.2∶1.8∶2) 0.39 0.31 0.14
2 正己烷-正丁醇-甲醇-水 (2∶3.8∶1.2∶4) 0.52 0.60 0.32
3 醋酸乙酯-正丁醇-水 (4∶1∶5) 0.41 0.38 0.09
4 醋酸乙酯-正丁醇-水 (3∶2∶5) 0.52 0.75 0.36
5 醋酸乙酯-正丁醇-水 (2∶3∶5) 0.44 0.94 0.40
6 醋酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水 (2∶3∶5) 0.66 1.44 0.58

物质为虫草素，其他两个组分在发酵液中相对量较
高，为与虫草素 tR较接近的组分物质。可知，目标
物质虫草素在溶剂体系 1 和 3 中的 K 值均偏小，在
分离过程中理论 tR长，不易被流动相萃取出来，不
适宜于虫草素的分离。虫草素在溶剂体系 2 中的 K
值在合适的范围内，但是各个组分的K值差别不大，
各个组分不能很好地分离，利用分析型 HSCCC 试
探其分离效果见图 1-A，出峰时间快，分离得到的
两个峰未能达到基线分离，不适宜发酵液中虫草素
的分离。
以醋酸乙酯代替正己烷，选择相对极性较大的
溶剂体系醋酸乙酯-正丁醇-水（表 1），虫草素在溶
剂体系 4、5、6 的 K 值均在适宜范围之内，利用溶
剂体系 4 在分析型 HSCCC 上分离样品，分离色谱
图见图 1-B，各组分在溶剂体系 4 中已经开始有良
好的分离趋势。对溶剂比例进一步进行调整，加大
正丁醇比例，减小醋酸乙酯的比例（溶剂体系 5），
在一定程度改善了 K 值，将此溶剂体系应用于分析
型 HSCCC 分离样品，结果见图 1-C，样品中各个
组分基本达到基线分离，按谱图接收各个峰对应的






图 1 样品在不同溶剂体系中分离 HSCCC 色谱图
Fig. 1 HSCCC chromatograms of samples in various solvent systems
A
B
0 8 16 24 32 40 48 56 0 8 16 24 32 40
C D
0 8 16 24 32 40 48 56 0 10 20 30 40 50 60
t / min
1
2
3
1
2
3
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洗脱液，用 HPLC 检测，确定峰 3 为虫草素峰，但
是在 260 nm 波长下检测峰质量分数只有 90%，在
此溶剂体系条件下不能获得高纯度的虫草素产品。
由于虫草素为生物碱类物质，根据碱性化合物
的特性，向溶剂体系中加入氨水调节分离环境中的
pH 值，以醋酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水（2∶3∶5）
为溶剂体系（表 1 中溶剂体系 6），虫草素对应的 K
值增大，且各个组分 K 值的大小差异也增大，经分
析型 HSCCC 分离（图 1-D），样品各组分在溶剂体
系 6 的条件下得到了基线分离，较溶剂体系 5，各
峰的分离度得到了较大的改善。因此，最终选择醋
酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水（2∶3∶5）为发酵液中虫
草素的最佳分离溶剂体系。
3.2 HSCCC 分离纯化结果
以醋酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水（2∶3∶5）为溶
剂体系，利用制备型 HSCCC 分离粗提物中虫草素，
分离色谱图见图 2。手动收集各色谱峰后，经 HPLC
检测，峰 IV 为单一峰，与虫草素对照品 tR一致，均
为 12.7 min（图 3），初步确定图 2 中峰 IV 即为虫
草素对应的峰。




图 2 制备型 HSCCC 分离蛹虫草发酵液粗提物中
虫草素的色谱图
Fig. 2 Preparative HSCCC chromatogram of cordycepin
in crude extracts from C. militaris
fermentation broth




图 3 虫草素制备产品 HPLC 检测色谱图及紫外扫描图
Fig. 3 HPLC chromatogram and UV scanning spectrum
of prepared cordycepin
3.3 样品结构鉴定及纯度分析
对制备获得峰 IV 物质进行紫外光谱扫描（图
3），最大吸收波长为 259 nm，与文献报道虫草素对
照品最大吸收波长一致，与虫草素对照品扫描图谱
对照，图谱谱线与对照完全一致。
对样品红外光谱进行扫描，与虫草素对照品扫
描图谱对比（图 4），上部分线条为虫草素制备样品
的谱线，下部分谱线为虫草素对照品对应的谱线，
两者在 4 000～450 cm−1 的谱线特征一致，其特征吸
收峰值分别为虫草素对照品：3 139.63、2 922.91、
1 670.05、1 605.81、1 576.12、1 479.23、1 341.73、
1 208.33、1 108.56、834.46、725.18 cm−1，制备虫
草素样品：3 139.90、2 923.52、1 672.17、1 606.59、
1 575.71、1 478.80、1 340.15、1 207.99、1 107.06、
835.22、723.63 cm−1，两者对照，光谱特征一致。



图 4 制备虫草素样品与虫草素对照品的红外扫描图谱
Fig. 4 IR scanning spectra of prepared cordycepin
and cordycepin reference substance

质谱（EI-MS）对峰 IV 物质进行结构分析得
m/z: 250.09 (M－H)−, 296.10 (M＋HCOO−)−, 310.12
(M＋CH3COO−)−。以上质谱数据与虫草素对照品的
一致，计算得目标物质的相对分子质量为 251.1，确
定峰 IV 物质为虫草素。
经 HPLC 检测，峰面积归一法计算，图 3 中目
标峰物质质量分数为 98.7%。
4 讨论
溶剂体系筛选为 HSCCC 分离的关键步骤。根
据虫草素，虫草素作为糖苷类化合物，具有一定的
极性，常规生物碱类化合物的通用溶剂体系如氯仿-
甲醇-水[14]，正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水[15]等体系不
适合虫草素的分离。根据虫草素在甲醇和正丁醇中
0 5.0 10.0 15.0
t / min
200 300 400
波长 / nm
259 nm
3 900 3 000 2 100 1 500 900
波数 / cm−1 0 30 60 90 120 150
t / min
I
II III
IV
制备样品
对照品
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具有很好的溶解度的特性，参考 HBAW 方法[13]，考
察了不同比例的正己烷-正丁醇-甲醇-水体系对虫草
素的分离情况，如上述结果所述，此溶剂体系对样
品的分离效果不理想，极性仍然偏弱。醋酸乙酯-
正丁醇-水体系常用于糖苷混合物的分离[13]，实验中
筛选出醋酸乙酯-正丁醇-水（2∶3∶5）体系对样品
的分离色谱图显示分离效果较好，但是得到样品的
峰质量分数仅 90%左右，再次结合虫草素作为生物
碱类化合物的性质，在溶剂体系中添加氨水调节分
离 pH 值，最终获得了很好的分离效果。
本研究以分离制备虫草素为主要目标，由图 2
可知，样品在溶剂体系醋酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水
（2∶3∶5）下可分离获得 4 个组分，经 HPLC 检测，
可知组分 I 为杂质峰，包括了大量的色素和极性较
强的化合物混合物；组分 II 在 260 nm 下检测在
tR＝8.3 min 处有一较明显的峰，但峰面积小，峰质
量分数为 75%左右；组分 III 在 260 nm 下检测在
tR＝10.9 min 和 tR＝11.8 min 处有 2 个较高的峰，2
个峰的总峰面积百分比为 90%以上，在后续研究中，
可以将图 2 所示的组分 II 和组分 III 分别接收，进
行浓缩和二次分离，获得更多高纯度的发酵液中的
组分物质，实现资源的综合利用。
本研究对分离蛹虫草发酵液中虫草素的
HSCCC 溶剂体系进行了筛选，最后确定以醋酸乙
酯-正丁醇-0.5%氨水（2∶3∶5）作为溶剂体系分离
制备虫草素，从 400 mg 蛹虫草发酵液粗提物中一
次分离获得 43.8 mg 质量分数为 98.7%的虫草素产
品，实现了虫草素的高纯度制备。本工艺对高纯度
虫草素制备的扩大生产具有重要的参考价值，同时
为虫草素的药理研究提供了重要的物质基础。
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