全 文 ：·3284· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 22期 2014年 11月

• 药理与临床 •
灵薏方多组分微乳的制备及其抗肺癌活性研究
袁成甜 1, 2，贺俊杰 2，陈 彦 2*，瞿 鼎 2，孙文杰 2
1. 江苏大学药学院，江苏 镇江 212013
2. 江苏省中医药研究院 国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏 南京 210028
摘 要：目的 制备灵薏方多组分微乳并对其抗肺癌活性进行研究。方法 以灵芝多糖和薏苡仁多糖水溶液为水相，薏苡仁
油为油相，荷载灵芝三萜，采用水滴定法制备灵薏方多组分微乳，测定其粒径、Zeta电位，并考察其稳定性。以 Lewis荷瘤
小鼠抑瘤率、体质量变化、免疫器官（肝、脾和胸腺）指数以及血浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）
水平为考察指标，结合肿瘤组织病理切片和 TUNEL凋亡原位检测，评价灵薏方多组分微乳的抗肺癌活性。结果 制备所得
微乳形态圆整，平均粒径为（69.92±8.43）nm，多分散指数（PDI）为 0.060±0.008，Zeta电位为（−11.30±1.34）mV。微
乳组抑瘤率（57.25%）显著高于混悬液组（45.89%），免疫器官指数和血浆中 TNF-α 和 IL-6 水平显著升高，肿瘤组织病理
切片和 TUNEL凋亡原位检测显示微乳组抗肿瘤效果显著高于混悬液组。结论 灵薏方多组分微乳具有较好的抗肺癌活性。
关键词：灵薏方；灵芝多糖；薏苡仁多糖；灵芝三萜；薏苡仁油；多组分微乳；抗肺癌
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)22 - 3284 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.22.013
Preparation of Lingyi Formula multicomponent microemulsion and its anti-lung
cancer activity
YUAN Cheng-tian1, 2, HE Jun-jie2, CHEN Yan2, QU Ding2, SUN Wen-jie2
1. Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
2. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica, Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine,
Nanjing 210028, China
Abstract: Objective To prepare Lingyi Formula multicomponent microemulsion and evaluate its anti-lung cancer activity. Methods
Lingyi Formula multicomponent microemulsion was prepared by aqueous titration method using polysaccharides solution of
Ganoderma lucidum and Coix lachryma-jobi var. ma-yuen as aqueous phase and coix seed oil as oil phase, loading ganoderma
triterpenes. The average particle size, Zeta potential, and stability were detected. The results of antitumor efficacy including tumor
inhibitory rate, body weight change, immune organ index, and concentration of TNF-α and IL-6 were investigated. Besides,
pathological section of tumor tissue and TUNEL labeling were conducted subsequently. Results The prepared microemulsion
displayed spherical surface with mean droplet size of (69.92 ± 8.43) nm, polydispersity (PDI) of 0.060 ± 0.008, and Zeta potential of
(−11.30 ± 1.34) mV. Tumor inhibitory rate of microemulsion (57.25%) was significantly higher than that of suspension (45.89%),
immune tissue index as well as the concentration of TNF-α and IL-6 were increased significantly. TUNEL labeling and pathological
section of tumor tissue showed that the antitumor activity of microemulsion was significantly effective compared with that of
suspensions. Conclusion Lingyi Formula multicomponent microemulsion has a good anti-lung cancer activity.
Key words: Lingyi Formula; Ganoderma lucidum polysaccharides; Coix lachryma-jobi var. ma-yuen polysaccharides; ganoderma
triterpenes; coix seed oil; multicomponent microemulsion; anti-lung cancer


收稿日期：2014-04-02
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373979）；江苏省中医药领军人才项目（LJ200913）；江苏省自然科学基金资助项目（BK20141058）
作者简介：袁成甜（1989—），男，硕士在读，研究方向为中药新剂型。Tel/Fax: (025)85608672 E-mail: demon550537774@126.com
*通信作者 陈 彦 Tel/Fax: (025)85608672 E-mail: ychen202@hotmail.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 22期 2014年 11月 ·3285·

灵薏方是江苏省中西医结合医院临床使用的
抗肺癌验方，具有较好的疗效，主要由传统的抗肿
瘤中药灵芝和薏苡仁配伍组成。但由于该复方中主
要抗肿瘤活性组分灵芝三萜和薏苡仁油水溶性较
差，口服生物利用度较低[1-2]，导致临床常用剂型（汤
剂）的疗效得不到充分发挥，因此有必要对该复方
剂型进行进一步研究，期待通过提高各活性成分的
水溶性来促进其肠道吸收，增强疗效。微乳是一种
由油相、表面活性剂及助表面活性剂组成的新型载
药系统[3]，可以显著增加难溶性药物的溶解度，提
高药物的生物利用度，增强疗效[4]。目前中药微乳
剂型的相关研究已有报道，如苦参碱微乳[5-6]、秋水
仙碱微乳[7]、芍药苷微乳[8]、芒果苷微乳[9]等。为克
服现有微乳载药量低，辅料使用较多、毒副作用较
大的缺陷，本课题组前期研究中以薏苡仁油为油
相，荷载灵芝三萜制备了多组分微乳，该微乳具有
粒径小、抑瘤率高、组织毒性小的特点，有效地改
善了原型药物体内溶出较差等缺陷[10]。本研究拟引
入灵芝多糖和薏苡仁多糖的水溶液作为水相，制备
灵薏方多组分微乳，并考察其抗肿瘤效果，以达到
充分利用药材中有效成分，进一步体现中医药多组
分、多靶点特色，保持和提高制剂疗效的目的。
1 材料
1.1 仪器
UV—2802 紫外可见分光光度仪（上海尤尼柯
仪器有限公司）；85—2恒温磁力搅拌器（上海司乐
仪器厂）；HERA Cell 150 CO2培养箱、酶标仪（美
国热电集团）；COIC XDS—1B相差倒置显微镜（重
庆光电仪器总公司）；Nano—ZS型马尔文粒径测定
仪（英国马尔文公司）；Tecnai12透射电镜（荷兰菲
利普制造公司）；Nikon ECLIPSE电子显微镜（日本
尼康公司）。
1.2 药品和试剂
灵芝三萜（质量分数 61.50%）、灵芝多糖（质
量分数 46.40%）、薏苡仁油（质量分数 74.35%）、
薏苡仁多糖（质量分数 64.42%），均为自制；聚氧
乙烯氢化蓖麻油（Cremophor® RH40）（德国 BASF
公司）；聚乙二醇 400（PEG 400）（国药集团化学试
剂有限公司）；环磷酰胺冻干粉（江苏恒瑞制药有
限公司，批号 12032725）；苏木素-伊红（HE）染液
（由核染液、分色液 I、分色液 II、浆染液及增色液
组成）、TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒、肿瘤坏
死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）（南京凯
基生物科技发展有限公司）；水为Milipore®超纯水，
其他所用试剂均为分析纯或色谱纯。
1.3 细胞株及动物
Lewis 小鼠肺癌细胞，购于南京凯基生物科技
发展有限公司；C57BL/6J小黑鼠，6～8周龄，购于
上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号
SCXK（沪）2007-0005。
2 方法与结果
2.1 灵薏方多组分微乳的制备[11]
取 130 mg灵芝多糖、500 mg薏苡仁多糖加入
到 2.6 mL水中溶解，作为水相。取灵芝三萜 75 mg，
薏苡仁油 400 mg，在磁力搅拌器下搅拌 0.5 h，再
加入 RH40 400 mg，PEG 400 200 mg，搅匀，并逐
滴加入水相，磁力搅拌器搅匀，得到澄明微乳溶液。
2.2 多组分微乳的表征
采用马尔文激光散射粒度测定仪，在室温下测
定多组分微乳的平均粒径、多分散指数（PDI）和
Zeta电位。同时将载有 Formvar支持膜的铜网放于
蜡板上，在膜上滴加微乳液 1滴，室温风干 30 min，
再滴加 2%的磷钨酸 1滴，室温风干 10 min，滤纸
吸走多余液体，置于 Tecnai 12型透射电镜下观察
微乳的外观形态，电镜观察结果见图 1。结果显示
所制备微乳外观圆整，分散均匀，平均粒径为
（69.92±8.43）nm，PDI为 0.060±0.008，Zeta电
位为（−11.30±1.34）mV。


图 1 灵薏方多组分微乳的透射电镜图
Fig. 1 TEM graphs of Lingyi Formula multicomponent
microemulsion
2.3 微乳稳定性考察
2.3.1 稀释对稳定性的影响 取微乳 1.0 mL，分别
用水及生理盐水将其稀释 10、100倍，观察微乳形
态的变化并测定粒径，结果见图 2，稀释使微乳平
均粒径小幅减小，可能是因为稀释降低了微乳粒子
200 nm
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图 2 稀释对灵薏方多组分微乳粒径的影响
Fig. 2 Effect of dilution on particle size of Lingyi Formula
multicomponent microemulsion
的聚集程度。
2.3.2 高速离心对稳定性的影响 取微乳 1.0 mL
于离心管中，以 13 000 r/min离心 30 min，结果显
示所制备微乳无明显絮凝和分层现象出现。
2.3.3 放置时间对稳定性的影响 微乳在 4 ℃和
25 ℃的条件下保存 1 个月，结果显示所制备微乳
无明显絮凝和分层现象出现。
2.3.4 pH 值对稳定性的影响 取微乳样品溶液 10
份，加磷酸盐缓冲液（PBS）调节 pH值分别为 2.0、
3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4 和 8.0，观
察其外观形态的变化并测定平均粒径，结果见图 3，
在考察范围内 pH值对微乳的粒径无明显影响。
2.4 灵薏方多组分微乳体内抗肺癌作用
2.4.1 模型复制、分组及给药 将 Lewis肺癌细胞
培养并传代，取生长良好的细胞经胰酶消化后，用
计数板计数，将浓度调整至 1×107/mL，于健康
C57BL/6J小鼠右腋部 sc，每只 0.2 mL，制备小鼠肺
癌的实体瘤模型[12-13]。



图 3 pH 值对灵薏方多组分微乳粒径和 PDI 的影响
( ± = 3x s , n )
Fig. 3 Effect of pH value on particle size and PDI of Lingyi Formula
multicomponent microemulsion ( ± = 3x s , n )
将 C57BL/6J小鼠称体质量后随机分为 4组，每
组 8 只，分别为模型组（生理盐水）、阳性组（环
磷酰胺 20 mg/kg）、多组分微乳组（总生药 30 g/kg）、
混悬液组（取灵芝三萜 0.75 g、薏苡仁油 4 g、灵芝
多糖 1.3 g、薏苡仁多糖 5.04 g，用 0.2%的 CMC-Na
溶液稀释至 50 mL，总生药 30 g/kg）。各组均 ig给
药，每日 0.4 mL/次，连续 14 d。
2.4.2 观察及检测指标 给药期间每日称小鼠体
质量，观察其进食、活动状态及死亡状况。给药 14
d后，眼球取血，3 000 r/min离心 5 min，−20 ℃冷
藏备用，采用酶标仪测定血浆中的肿瘤坏死因子-α
（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平。同时剥离
腋下肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺，计算抑瘤率、肝指
数、胸腺指数、脾指数。
抑瘤率＝1－治疗组平均瘤质量 / 模型组平均瘤质量
肝指数＝肝质量 / 体质量
胸腺指数＝胸腺质量 / 体质量
脾指数＝脾脏质量 / 体质量
2.4.3 统计学方法 应用软件 SPSS 13.0 处理数
据，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因
素方差分析。
2.4.4 抑瘤率等指标结果 阳性组、微乳组和混悬
液组的抑瘤率分别为 74.59%、57.25%、45.89%，微
乳组和混悬液组相比较，抑瘤率有显著提高（P＜
0.05）。图 4中，微乳组小鼠瘤质量低于混悬液组，
与模型组比较明显降低，表明多组分微乳具有优良的
抗肿瘤能力。图 5中，环磷酰胺组与模型组相比，小
鼠肝指数、脾指数和胸腺指数均有一定的降低（P＜
0.05），可能是由于环磷酰胺对小鼠免疫系统有抑制
作用；微乳组和混悬液组小鼠肝指数、脾指数和胸腺
指数与模型组和环磷酰胺组比较显著提高（P＜
0.05），表明灵薏方多组分微乳和混悬液均可增强小
鼠机体免疫活性；与混悬液组相比，微乳组的免疫
指标均有所提高，表明微乳可以更好地提高机体免
疫力。图 6中，环磷酰胺组与模型组相比，小鼠血
浆中 TNF-α 和 IL-6 水平有所降低，可能是由于环
磷酰胺抑制了机体免疫系统，但微乳组和混悬液组
与模型组比较，小鼠血浆中 TNF-α 和 IL-6 的量显
著提高，且微乳组高于混悬液组，表明微乳具有较
好的免疫调节能力。
2.4.5 肿瘤组织病理切片观察 将切取的肿瘤组
织用 10%福尔马林固定，由低到高梯度乙醇脱水，
二甲苯洗脱 3次，每次 5 min，经石蜡包埋后组织
平
均
粒
径
/
n
m

80
60
40
20
0
0.4
0.3
0.2
0.1
0
PD
I
0 2 4 6 8 10
pH值
粒径 PDI
平
均
粒
径
/
n
m

100
80
60
40
20
0
微乳 10倍 100倍 10倍 100倍
水稀释 生理盐水稀释
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 22期 2014年 11月 ·3287·



与模型组比较：*P＜0.05，下同
*P < 0.05 vs model group, same as below
图 4 各组荷瘤小鼠的体质量与瘤质量比较 ( ± = 6x s , n )
Fig. 4 Comparison on body weight and tumor weight of
tumor-bearing mice in each group ( ± = 6x s , n )



与环磷酰胺组比较：#P＜0.05，下同
#P < 0.05 vs cyclophosphamide group, same as below
图 5 各组荷瘤小鼠肝指数、胸腺指数和脾指数比较
( ± = 6x s , n )
Fig. 5 Comparison on liver, thymus, and spleen indexes of
tumor-bearing mice in each group ( ± = 6x s , n )

图6 各组荷瘤小鼠血浆中TNF-α和 IL-6水平 ( ± = 6x s , n )
Fig. 6 Levels of TNF-α and IL-6 in plasma of tumor-bearing
mice in each group ( ± = 6x s , n )
切片（5 μm），95%乙醇固定 3 min，水洗，核染液
染缸内染色 3～5 min，水洗，浸入分色液 I中 20 s，
水洗，浸入分色液 II中 40 s，水洗，浆染液中染色
2 min，试剂五增色液洗去多余染液，乙醇脱水后用
二甲苯处理，树胶封固[14-15]，显微镜下观察。结果
见图 7，可见给药组的肿瘤组织都有不同程度的坏
死。微乳组的坏死面积要比对应混悬液组的坏死面
积大，说明灵薏方多组分微乳具有促进肿瘤组织坏
死的作用。
2.4.6 肿瘤组织 TUNEL 凋亡原位检测 石蜡切片
5 μm，二甲苯脱蜡后乙醇水合，PBS冲洗，1% Triton
X-100通透液促渗，PBS冲洗，3% H2O2封闭液处
理，PBS冲洗，每个样本按滴加 100 μL新鲜配置的
Proteinase K工作液，37 ℃反应 15 min，PBS冲洗，


模型 环磷酰胺 微乳 混悬液
图 7 各组荷瘤小鼠肿瘤组织病理观察
Fig. 7 Pathological observation of tumor tissue of tumor-bearing mice in each group
TdT酶孵育 60 min，PBS冲洗，每个样本上滴加 50
μL POD-conjugated Anti-FITC工作液处理，PBS冲
洗，每个样本上滴加 50 μL DAB工作液，室温下孵
育 3～5 min，PBS冲洗，苏木素复染，1%盐酸甲醇
溶液中分化 5 s，二甲苯浸 3次后加中性树胶和盖玻
片，光镜下观察拍照[16]。
结果如图 8所示，各给药组的肿瘤细胞都有不同
程度的凋亡，显微镜下观察和计数TUNEL凋亡细胞，
结果显示模型组肿瘤细胞几乎没有凋亡，多组分微乳
几乎表现出与阳性组同样明显的细胞凋亡，且程度明
显大于混悬液组，表明灵薏方多组分微乳可以促进肿
瘤细胞凋亡，且促凋亡效果显著优于混悬液。
质
量
/
g

30
25
20
15
6
4
2
0
模型
环磷酰胺
微乳
混悬液
体质量 肿瘤质量
脏
器
指
数
/
(m
g·
g
−
1 )
60
40
20
8
4
1.5
1.0
0.5
0
肝 胸腺 脾
模型
环磷酰胺
微乳
混悬液
模型
环磷酰胺
微乳
混悬液
TNF-α IL-6
ρ
/ (
pg
· m
L
−1
)
80
60
40
20
0



* *
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模型 环磷酰胺 微乳 混悬液
图 8 各组荷瘤小鼠肿瘤组织的 TUNEL 凋亡检测结果
Fig. 8 TUNEL apoptosis detection of tumor tissues of tumor-bearing mice in each group
3 讨论
一些中药组分常常表现为水溶性较差和体内
生物利用度低，微乳作为一种载药系统，可以提高
药物的生物利用度，因此在中药应用上具有广阔的
发展空间。本研究引入灵芝多糖和薏苡仁多糖的水
溶液作为水相，薏苡仁油为油相，荷载灵芝三萜，
其中多糖组分的加入使微乳中所含活性成分更加
接近于验方灵薏方汤剂，更能体现中医药多组分、
多靶点治疗的优势。
体内抗肺癌实验发现，多组分微乳具有较好的
抗肺癌活性。微乳组与混悬液组相比，抑瘤率显著
升高，肿瘤病理组织切片和 TUNEL 凋亡检测也表
明灵薏方多组分微乳更能促进肿瘤组织坏死与肿
瘤细胞凋亡，可能是因为微乳可以增加难溶性成分
薏苡仁油和灵芝三萜的溶解和吸收，且微乳具有良
好的生物相容性与跨膜能力，可以作为载体协助药
物跨过细胞膜，到达靶点，从而提高药效。
此外增强机体免疫功能是一项重要的抗肿瘤
机制，本研究中发现微乳组和混悬液组可以显著提
高肝指数、脾指数和胸腺指数以及血浆中 TNF-α和
IL-6浓度，且微乳组优于混悬液组，表明灵薏方多
组分微乳和其混悬液均具有较好的免疫调节能力，
微乳组功效显著高于混悬液组，提示微乳与混悬液
相比更能提高机体免疫能力，调控免疫器官分泌细
胞因子，从而发挥抗肿瘤作用。
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