全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月 ·2201·

氧化苦参碱对人结肠癌 SW620 细胞 p16/cyclinD1/CDK4 通路的影响
张绪慧 1，郑堰心 2，张 丽 2，邓虹珠 2，梁 磊 3*
1. 广东省第二人民医院 肿瘤二科，广东 广州 510317
2. 南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515
3. 广州军区广州总医院 药剂科，广东 广州 510010
摘 要：目的 观察氧化苦参碱诱导人结肠腺癌细胞株 SW620 凋亡的作用并探讨其可能机制。方法 采用 MTT 法检测氧化苦参
碱对 SW620 细胞的增殖抑制作用；Hoechst33258 荧光染色检测氧化苦参碱对 SW620 细胞凋亡的影响；流式细胞仪检测氧化苦参
碱对 SW620 细胞周期的影响；实时定量 PCR 法检测细胞内 p16、cyclinD1 及 CDK4 基因表达水平；免疫印迹法检测细胞内 p16、
CyclinD1 及 CDK4 蛋白表达水平。结果 氧化苦参碱抑制 SW620 细胞增殖作用呈剂量依赖性，其作用 24 h 的 IC50为 4.02 μmol/L；
与对照组相比，苦参碱处理后的 SW620 细胞 G1期比例明显增高，G2期细胞比例下降（P＜0.05）；氧化苦参碱作用后 SW620 细
胞 p16 基因和蛋白水平升高（P＜0.05），cyclinD1 及 CDK4 基因和蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。结论 氧化苦参碱在体外
能抑制 SW620 细胞的增殖，诱导细胞在 G1期阻滞，其诱导作用与其调控 p16、cyclinD1 及 CDK4 基因和蛋白表达有关。
关键词：氧化苦参碱；细胞周期；SW620 细胞；p16；cyclinD1；CDK4
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)15 - 2201 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.15.015
Effect of oxymatrine on p16/cyclinD1/CDK4 pathway in human colon
adenocarcinoma SW620 cells
ZHANG Xu-hui1, ZHENG Yan-xin2, ZHANG Li2, DENG Hong-zhu2, LIANG Lei3
1. Department of Oncology, Guangdong No.2 Provincial Peoples Hospital, Guangzhou 510317, China
2. School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
3. Department of Pharmacy, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China
Abstract: Objective To explore the antitumor effect of oxymatrine and detect the mechanism involved. Methods The Anti- proliferative
effects of oxymatrine in human colon adenocarcinoma SW620 cells were assessed using MTT assay. SW620 cells treated with oxymatrine
were assessed with Hoechst 33258 staining and cell cycle distribution assay was performed by flow cytometry. The quantitative real-time
PCR assay was used to evaluate the expression of p16, cell cycle-related cyclinD1 and CDK4 mRNA at the genetic level. To investigate the
molecular mechanisms underlying alterations in cell apoptosis, the proteins p16, cell cycle-related cyclinD1, and CDK4 were determined by
Western blotting analysis. Results Oxymatrine could significantly inhibit the growth of SW620 cells compared with the control group, the
IC50 was 4.02 μmol/L. Its anticancer activity was related to the alteration in expression of p16, cyclinD1, and CDK4 (P < 0.05, 0.01).
Conclusion These results suggest that oxymatrine produces the obvious antitumor effects on SW620 cells in vitro, induces the cell arrest in
G1 phase which is related to the regulation on the protein expression of p16, cyclinD1, and CDK4.
Key words: oxymatrine; cell cycle; SW620 cells; p16; cyclinD1; CDK4

肿瘤是危害人类的重大疾病之一，近年来，运
用中药治疗肿瘤是目前国内外研究的热点[1]。氧化
苦参碱（oxymatrine）是苦参的有效成分，属于四
环喹诺里西啶类（quinolizidine）生物碱[2]，药理
和临床研究发现，氧化苦参碱具有抗炎、抗病毒、
抗纤维化、免疫调节等多种药理作用[3]，并且其抗
肿瘤的作用越来越得到重视[4]。本研究针对氧化苦
参碱对人结肠癌细胞株 SW620 增殖、细胞周期及

收稿日期：2013-11-13
基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（81001701）；广东省中医药局建设中医药强省科研项目（20131106）
作者简介：张绪慧，男，博士研究生，研究方向为肿瘤放化疗临床与基础研究。Tel: 13527896335 E-mail: alps0210@163.com
*通信作者 梁 磊（1978－），女，博士，主管药师，研究方向为中药药理与临床药学。
Tel: (020)36652218 E-mail: 414909084@qq.com, libraliang78@126.com
·2202· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月

p16/cyclinD1/CDK4 通路调节方面的影响，探讨其
对大肠癌可能的作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
人结肠腺癌细胞株SW620为南方医科大学中医
药学院药理实验室所存。氧化苦参碱（质量分数≥
98%）由宁夏盐池县医药公司提供，批号 080630；
5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液由上海旭东海普药业生
产，批号 100108。新生胎牛血清购自杭州四季青公
司；0.25% Trypsin、RPMI 1640 培养基购于吉诺公
司；噻唑蓝（MTT）购于 Sigma 公司；二甲基亚砜
（DMSO）购于 A1Tlresco 公司。细胞周期检测试剂
盒购于碧云天公司；兔抗 p16、cyclinD1、CDK4 及
β-actin 一抗与兔二抗均购自美国 Sigma 公司。
1.2 细胞培养
SW620 细胞用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640
培养基，于 37 ℃、5 %CO2 孵箱中培养，待细胞生
长到 80%～90%，弃除培养液，PBS 轻轻洗涤细胞
2、3 次，用 0.25%胰酶消化 3～5 min，终止消化后，
RPMI 1640 培养液重悬细胞，并按 1∶3 的比例进
行传代，分别接种至表面积为 25 cm2 的培养瓶中，
移入 37 ℃、5%CO2 孵箱中培养[5]。
1.3 MTT 法检测 SW620 细胞增殖
调整细胞悬液浓度至 2×105/mL，取 100 μL 的
细胞悬液接种于 96 孔培养板中，37 ℃、5%CO2
培养箱孵育，培养至细胞贴壁单层铺满孔底。对照
组加入同样量的培养液 200 μL，阳性对照组加入终
质量浓度为 4 mg/L 的 5-Fu，氧化苦参碱设 1、2、4、
8、16、32 μmol/L 6 个浓度，每组设 3 个重复孔，
药物分别作用 24、48、72 h 后，每孔加 20 μL（5
mg/mL）MTT，培养 4 h 后，弃去培养基，加 150 mL
的 DMSO 溶液，轻轻振荡约 10 min 后，酶标仪 490
nm 测吸光度（A）值，计算细胞增殖率。
细胞增殖率＝A 实验组 / A 对照组
1.4 Hoechst33258 光镜观察 SW620 细胞核形态
对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，以 5×
105/mL 浓度接种于装有消毒玻片的培养皿中，培养
24 h 后，更换培养基。实验组加入氧化苦参碱 2、4、
8 μmol/L，另设对照组。作用 24 h 后收集细胞爬片，
固定后 Hoechst33258 染色，荧光显微镜下观察细胞
核形态。
1.5 流式细胞仪分析 SW620 细胞周期
细胞处理、分组同“1.4”项。收集培养 24 h
的所有细胞，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，
PBS 洗 2 次，1 200 r/min 离心 5 min，吸尽上清液，
加入 70%乙醇（4 ℃预冷）固定，碘化丙啶（PI）
染色 30 min 。进行流式细胞仪分析，并用
MUTCYCLE 软件分析细胞周期分布情况。
1.6 荧光实时定量 PCR 检测基因水平
细胞处理分组同“1.4”项。RNA 提取与纯化：
在细胞沉淀中加入Trizol试剂1 mL，充分振荡混匀，
室温放置 5 min，加入氯仿 0.2 mL，盖紧盖子，用
振荡器振荡 15 s，室温孵育 2～3 min，4 ℃、12 000
r/min 离心 15 min，取上清液至新的 1.5 mL
Eppendorf 管中。加与上清液等体积的异丙醇，轻
轻混匀，−20 ℃孵育样品 20～30 min，4 ℃、12 000
r/min 离心 10 min，弃上清液，75%乙醇（含 DEPC
水）800 μL 洗涤沉淀 1 次，4 ℃、7 500 r/min 离心
5 min，弃乙醇。空气或真空干燥 5～10 min（不要
完全干燥），加 DEPC 处理水 20～50 μL 溶解 RNA，
−80 ℃保存备用。若长期保存，加入 2.5 倍体积乙醇，
置−80 ℃保存。逆转录反应：取 4 μL RNA 模板进行
逆转录反应，仪器为 BIO-RAD 定性 PCR 仪（美国），
反应体系按逆转录试剂盒说明书进行。荧光定量
PCR 反应条件：93 ℃、2 min， 93 ℃、15 s，55 ℃、
25 s，72 ℃、25 s，共 40 个循环。PCR 引物由上海
英俊公司设计合成，具体序列见表 1。
表 1 荧光定量 PCR 反应引物序列
Table 1 Primer sequence of quantitation RT-PCR by fluorescent
基因 序列
p16 正向 5’-ACCAGAGGCAGTAACCATGC-3’
反向 5’-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3’
CDK4 正向 5’-CCCGAAGTTCTTCTGCAGTC-3’
反向 5’-CTGGTCGGCTTCAGAGTTTC-3’
cyclinD1 正向 5’-ACCTGAGGAGCCCCAACAAC-3’
反向 5’-GCTTCGATCTGCTCCTGGC-3’
β-actin 正向 5’-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’
反向 5’-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3’

1.7 免疫印迹法检测 p16、CyclinD1 及 CDK4 蛋
白的表达
细胞处理分组同“1.4”项。细胞以 5×109/L 接
种至 6 孔板，按照实验分组进行相应处理后，提取
细胞总蛋白，以双辛丁酸（BCA）法进行蛋白定量
检测。按每个样品 25 μL 上样后进行电泳分离蛋白
质。电泳结束后，采用半干转法将蛋白质转移至聚偏
氟乙烯（PVDF）膜上，脱脂奶粉室温封闭 l h 后，
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月 ·2203·

将一抗与膜 4 ℃孵育过夜（抗 p16、CyclinD1 及
CDK4，体积分数为 1∶1 000），二抗以 1∶10 000 室
温孵育 2～3 h，化学发光法显色成像，分析条带灰度
值，检测 p16、CyclinD1、CDK4 蛋白表达水平。
1.8 统计学方法
应用 SPSS l3.0 软件包进行，多组比较采用
One-way ANOVA 分析，两组间比较采用 t 检验，数
据均以 ±x s 表示。
2 结果
2.1 对 SW620 细胞增殖的影响
不同浓度的氧化苦参碱作用于 SW620 细胞不同
时间后对细胞增殖的影响结果见表 2。结果表明氧化
苦参碱能显著抑制 SW620 细胞的增殖，与对照组比
较，给药组细胞增殖率显著降低（P＜0.05），并有明
显的剂量效应关系，其作用 24 h 的 IC50 值为 4.02
μmol/L。与 5-Fu 组比较，氧化苦参碱在浓度为 8～32
μmol/L时，对SW620增殖抑制率显著提高（P＜0.05）。
2.2 氧化苦参碱作用后 SW620 细胞形态的改变
氧化苦参碱作用 SW620 细胞 24 h 后，细胞经
Hoechst33258 染色，荧光显微镜下观察可见 SW620
细胞核形态出现了明显的改变，见图 1，与对照组
比较，药物处理后，细胞皱缩，染色质浓缩边集，
形成新月形细胞核。对照组无明显凋亡细胞。随着
氧化苦参碱作用浓度增加，细胞核皱缩更明显。
表 2 氧化苦参碱对 SW620 细胞增殖的影响 ( ± = 3x s n, )
Table 2 Effect of oxymatrine on proliferation of SW620 cells ( ± = 3x s n, )
增殖率 / % 组别 剂量 / (μmol·L−1)
24 h 48 h 72 h
对照 — 100.0 100.0 100.0
5-Fu 4 mg·L−1 47.3±0.9* 41.2±1.5* 33.3±1.9*
1 92.7±0.7 82.1±0.8* 70.4±0.8*
2 84.4±0.7* 69.4±1.7* 62.4±0.8*
4 64.6±0.9* 52.2±0.8* 47.4±0.7*
8 40.3±1.0*# 32.2±1.0*# 22.1±2.0*#
16 31.3±0.9*# 19.6±0.5*# 15.7±2.4*#
氧化苦参碱
32 25.5±1.9*# 14.6±0.8*# 7.5±0.8*#
与对照组比较：*P＜0.05；与 5-Fu 组比较：#P＜0.05
*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs 5-Fu group

对照 氧化苦参碱 2 μmol·L−1 氧化苦参碱 4 μmol·L−1 氧化苦参碱 8 μmol·L−1
图 1 氧化苦参碱对 SW620 细胞形态的影响 (Hoechst33258 染色)
Fig. 1 Effect of oxymatrine on morphology of SW620 cells (Hoechst33258 staining)
2.3 对 SW620 细胞周期的影响
氧化苦参碱 2、4、8 μmol/L 作用 SW620 细胞
24 h 后，与对照组比较，细胞在 G1 期的比例明显
增加（P＜0.05、0.01），S 期的比例显著降低（P＜
0.05、0.01），见表 3。
2.4 对 SW620 中 p16、cyclinD1、CDK4 mRNA
表达的影响
RT-PCR 结果显示，p16（INK4A）基因在氧化
苦参碱组中表达明显升高，与对照组比较差异显著
（P＜0.01），氧化苦参碱 8 μmol/L 组 p16 mRNA 表达
水平最高；氧化苦参碱组 cyclinD1 和 CDK4 mRNA
的表达均下降，与对照组比较差异显著（P＜0.05、
0.01），氧化苦参碱 8 μmol/L 组 cyclinD1 和 CDK4
mRNA水平与对照组比较下降最为显著（P＜0.01），
见图 2。
2.5 对 SW620 细胞 p16、CyclinD1、CDK4 蛋白
表达的影响
免疫印迹法结果（图 3 和表 4）显示，与对照
·2204· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月

表 3 苦参碱对 SW620 细胞周期的影响 ( ± = 3x s n, )
Table 3 Effect of oxymatrine on cell cycle of SW620 cells ( ± = 3x s n, )
组别 剂量 / (μmol·L−1) G1期 / % S 期 / % G2期 / %
对照 — 44.52±2.90 46.73±1.68 8.74±1.91
2 64.81±1.21* 33.16±0.98* 2.03±0.23
4 73.43±1.33** 25.71±1.43** 0.86±0.59
氧化苦参碱
8 83.98±3.20** 15.39±2.94** 0.63±0.30
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group, same as below



图 2 氧化苦参碱对 SW620 细胞 p16、cyclinD1、CDK4
mRNA 表达的影响 ( ± = 3x s n, )
Fig. 2 Effect of oxymatrine on mRNA expression of p16,
cyclinD1, and CDK4 in SW620 cells ( ± = 3x s n, )


图 3 氧化苦参碱对 SW620 细胞 p16、CyclinD1、CDK4
蛋白表达的影响
Fig. 3 Effect of oxymatrine on protein expression of p16,
cyclinD1, and CDK4 in SW620 cells
表 4 各组细胞内 p16、CyclinD1 及 CDK4 蛋白表达相对量 ( ± = 3x s n, )
Table 4 Relative quantity of protein expression of p16, cyclinD1, and CDK4 in SW620 cells ( ± = 3x s n, )
组别 剂量 / (μmol·L−1) p16/β-actin CyclinD1/β-actin CDK4/β-actin
对照 — 0.063±0.000 1.652±0.159 1.650±0.120
氧化苦参碱 2 1.014±0.007* 0.558±0.005* 1.260±0.053*
4 0.616±0.013* 0.096±0.002** 0.131±0.051**
8 0.314±0.014** 0.120±0.017* 0.191±0.025*

组比较，氧化苦参碱可明显提高 SW620 细胞内 p16
蛋白表达水平（P＜0.05、0.01），氧化苦参碱 8
μmol/L 组 p16 蛋白表达水平最高（P＜0.01）；与对
照组比较，氧化苦参碱组 CyclinD1 和 CDK4 蛋白
表达水平均下降（P＜0.05、0.01），氧化苦参碱 4
μmol/L 组 CyclinD1 和 CDK4 蛋白水平下降最为显
著（P＜0.01）。
3 讨论
大肠癌是全球发病率居第 3 位的常见肿瘤，近
年来其发病率呈逐年上升趋势[2]。针对大肠癌的化
疗方案主要是以 5-Fu 为主的综合化疗，但存在毒副
反应大等缺陷。中药以其独特的抗肿瘤疗效、不良
反应少等特点，已成为抗肿瘤研究的热点之一[6]。
氧化苦参碱对 SW620 结肠癌细胞具有明显的诱导
凋亡作用，是很有潜力的抗癌药物。体外实验表明
氧化苦参碱对多种肿瘤细胞有抑制或杀伤作用，并
能诱导细胞分化和凋亡[2,4]。本研究发现不同浓度氧
化苦参碱（1～32 μmol/L）对结肠癌细胞 SW620 有
不同程度的增殖抑制作用，并有一定的剂量效应关
系。通过细胞形态学的观察，氧化苦参碱作用
SW620 细胞 24 h 后，可见细胞核固缩、核碎裂、
细胞膜起泡等形态。
近年来的研究认为，肿瘤是一类细胞周期性疾
病。细胞周期的调节因子中就包括多种癌基因和抑
癌基因。在细胞增殖周期中，最主要的调控点是
G1 期与 S 期之间的调控点[5]。G1 期与 S 期调控点受
控于细胞周期蛋白（cyclins）和细胞周期蛋白依赖
性激酶抑制因子（CKIs）对细胞周期蛋白依赖性激
目
的
基
因
/β
-a
ct
in

4.0
3.0
2.0
1.0
0
0 2 4 8 0 2 4 8 0 2 4 8
氧化苦参碱 / (μmol·L−1)
*
p16
cyclinD1
CDK4
**
* *
***
**
**
**
p16
CyclinD1
CDK4
β-actin
1.6×104
3.4×104
3.6×104
4.3×104
对照 2 4 8
氧化苦参碱 / (μmol·L−1)
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月 ·2205·

酶（CDKs）的正负调节作用，即正常细胞从 G1 期
向 S 期的调控需要 cyclinDl 的正调控和 p16 的负调
控来完成[7-8]。p16 蛋白主要通过与 CDK 竞争性结
合 cyclinD，而阻碍其与 Cyclin D 形成复合物，cyclin
D/CDK 激酶失活，从而阻止细胞从 G1 期进入 S 期，
细胞增殖受抑制[9-10]。本实验研究表明：流式细胞
仪检测发现氧化苦参碱作用 SW620 细胞 24 h 后，
在 2～8 mmol/L 内，细胞的 G1 期比例逐渐升高，S
期比例明显下降，存在 G1/S 阻滞[11]。通过以上研
究结果推测氧化苦参碱主要是通过阻滞 SW620 细
胞 G1 期向 S 期的进程，形成 G1 期阻滞，造成 G1
期细胞堆积阻滞并阻断细胞的 DNA 合成和复制，
从而影响细胞周期进程，起到抑制肿瘤细胞增殖的
作用。RT-PCR 及免疫印迹法研究表明，与对照组
比较，cyclinDl、CDK4 蛋白及 mRNA 表达均下降。
p16 蛋白和 mRNA 表达明显增强。说明氧化苦参碱
通过调控了 G1 期这些细胞周期正负调节因子表达
发挥作用，最终抑制细胞周期进展，而导致肿瘤细
胞凋亡。综上所述，氧化苦参碱诱导的 SW620 细
胞凋亡，可能是通过使细胞阻滞 G1 期无法完成修
复而发挥抗肿瘤作用，其分子机制可能与抑制
p16/cyclinD1/CDK4 通路有关。
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