全 文 ：·536· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月

葛根素促进人成骨样 MG-63 细胞分化的分子机制研究
赵艳威 1，李宗旻 2﹟，宋光明 1，王 越 2，谢文利 1*
1. 武警后勤学院 药理学教研室，天津 300309
2. 武警后勤学院 病原生物与免疫学教研室，天津 300309
摘 要：目的 探讨植物雌激素葛根素促进人成骨样 MG-63 细胞分化的分子机制。方法 选择兼有 2 种雌激素受体（estrogen
receptor，ER）亚型表达的人成骨样 MG-63 细胞为研究模型，采用磷酸苯二钠法、ELISA 法及小 RNA 干扰等技术，探讨葛
根素对人成骨细胞分化的作用及作用机制。结果 葛根素可通过提高 MG-63 细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性和 I 型胶原蛋
白分泌促进成骨细胞分化成熟，该作用可被纯 ER 阻断剂 ICI 182, 780 完全阻断，应用小 RNA 干扰技术进一步证实葛根素对
成骨细胞 ALP 活性、I 型胶原蛋白分泌的调节作用是由 ERα 和 ERβ 共同介导的。结论 葛根素对成骨细胞分化的调节是经
ER 途径，由 ERα 和 ERβ 共同介导。
关键词：葛根素；成骨细胞；碱性磷酸酶；I 型胶原；雌激素受体
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)04 - 0536 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.04.016
Molecular mechanism for promotion of puerarin on differentiation in human
osteoblast-like MG-63 cells
ZHAO Yan-wei1, LI Zong-min2, SONG Guang-ming1, WANG Yue2, XIE Wen-li1
1. Department of Pharmacology, College of Logistics, Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China
2. Department of Pathogenic Biology and Immunology, College of Logistics, Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin
300309, China
Abstract: Objective To investigate the molecular mechanism for promotion of puerarin on the differentiation in human
osteoblast-like MG-63 cells. Methods Human osteoblast-like MG-63 cells containing two estrogen receptor (ER) isoforms were
selected as the suitable model for this study. Disodium phenyl phosphate method, enzyme-linked immnosorbent assay (ELISA), and
small interfering double-stranded RNAs (siRNA) technologies were performed to investigate the effect of puerarin on the
differentiation in human osteoblast-like MG-63 cells and its molecular mechanism. Results The promotion of puerarin on
osteoblastic differentiation could be performed by increasing alkaline phosphatase (ALP) activity and type I collagen protein secretion
in human osteoblastic MG-63 cells. The above effect of puerarin on osteoblast-derived cells could be completely blocked by ER
antagonist ICI 182, 780. Using siRNA technology, it was further demonstrated that the effects of puerarin on ALP activity and type I
collagen protein secretion were mediated by both ERα and ERβ. Conclusion The promotion of puerarin on osteoblastic
differentiation is through the ER pathway and is mediated via both ER isotypes, ERα and ERβ.
Key words: puerarin; osteoblast; alkaline phosphatase; type I collagen; estrogen receptor

骨质疏松症是影响老年人健康及生活质量的严
重问题，随着人类社会的老龄化，60 岁以上群体中
至少有 1/4 的人患有不同程度的骨质疏松症，更为
严重的是骨质疏松症患者的骨骼由于矿物质大量丢
失而变得异常脆弱，稍有疏忽极易发生多发性骨折。
大量的临床和实验研究已证实雌激素替代治疗对绝
经后骨质疏松防治效果肯定，但同时也增加了心血
管疾病的相对风险，长期应用可引发乳腺癌和子宫

收稿日期：2013-11-21
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273520）；天津市自然科学基金资助项目（12JCZDJC26300）；武警后勤学院科学技术研究项目
（WHZ201202）；天津市自然科学基金资助项目（13JCYBJC24400）
作者简介：赵艳威（1975—），女，硕士，研究方向为中药药理。Tel: (022)84876735 E-mail: zhaoywei64@sina.com.cn
*通信作者 谢文利，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事新药研究与开发。Tel: (022)84876732 E-mail: xiewenli5@sohu.com
﹟为共同第一作者
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·537·

内膜癌[1]。因此，寻找防治绝经后骨质疏松症有效
而副作用小的理想药物，是目前研究的热点和难
点。葛根素是一种异黄酮类化合物，是葛根的主要
活性成分，具有降血压、减慢心率、扩张血管的作
用，临床上用于高血压、心绞痛、脑供血不足和脑
梗死的治疗[2-5]。前期实验表明，葛根素能剂量依赖
性促进大鼠原代成骨细胞分化[6]，但有关葛根素对
人成骨细胞分化作用及作用机制的研究尚未见报
道。本实验在原工作基础上，以人成骨样 MG-63
细胞为研究模型，该细胞具备特征性成骨细胞功
能，并兼表达 2 种雌激素受体（estrogen receptor，
ER）亚型[7]，观察葛根素对人成骨细胞分化的作用
及作用机制。本研究结果为探讨植物雌激素对成骨
细胞的作用机制以及临床应用植物雌激素治疗骨
质疏松症提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
葛根素（质量分数 95.5%）购自中国食品药品
检定研究院；雷洛昔芬、l7β-雌二醇（E2）及纯 ER
阻断剂 ICI 182, 780 为美国 Sigma 公司产品；胎牛
血清（FBS）为中美合资兰州民海生物工程有限公
司产品；DMEM 高糖培养基、活性碳处理的 FBS
（sFBS）为美国 Gibco 公司产品；碱性磷酸酶（ALP）
活性检测试剂盒购自南京建成生物工程公司；人 I
型胶原蛋白 ELISA 试剂盒购自北京艾然生物科技
有限公司。
1.2 细胞系和细胞培养
人成骨样细胞系 MG-63 为美国 ATCC 公司产
品，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。按文献
方法[8]，将 pGenesil-ERα-siRNA、pGenesil-ERβ-siRNA、
pGenesil-scrambled-siRNA 分别转染至 MG-63 细胞
中，经 G418 压力筛选后，应用免疫印迹技术分别
鉴定出 ERα 高抑制稳定表达细胞 MG-63/ERα
shRNA（抑制率为 87%），ERβ 高抑制稳定表达细
胞 MG-63/ERβ shRNA（抑制率为 83%）及对照细
胞 MG-63/scrambled shRNA。上述细胞均用含 10%
FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM
高糖培养液培养。
1.3 药物处理细胞
取对数生长期的 MG-63 细胞，调整细胞浓度
为 2×104 个/mL，接种于 12 孔培养板，培养 24 h
待细胞贴壁后更换含 1% sFBS 的无酚红 DMEM 高
糖培养基培养 24 h 使细胞同步化，分别应用不同终
浓度的葛根素（0.01、0.1、1 μmol/L）、雷洛昔芬（0.1
μmol/L）、E2（0.1 μmol/L）或 DMSO 处理 2 、4、
6 d，每个浓度设 3 个复孔。
1.4 磷酸苯二钠法检测 ALP 活性
培养结束后，收集细胞用 PBS 缓冲液漂洗细胞
3 次，最后 1 次吸干 PBS，加入 0.1% Triton X-100，
500 μL/孔，作用 3 min，用移液器充分吹打，收集
入 1.5 mL Ependorf 管中，细胞超声破碎仪破碎后，
离心（1 500 r/min，10 min）取上清液，按照 ALP
活性测定试剂盒说明书检测细胞内 ALP 活性。
1.5 I 型胶原蛋白 ELISA 检测
结束培养，收集培养上清，按照 ELISA 试剂盒
的说明书检测培养上清中 I 型胶原蛋白的量。
1.6 ER 阻断剂处理细胞
同“1.3”项的方法，不同之处在于取葛根素作
用最明显的剂量（0.1 μmol/L），在加入葛根素前先
加入终浓度为 100 μmol/L ER 阻断剂 ICI 182, 780，
37 ℃作用 30 min，同时设立 ICI 182, 780 对照组。
1.7 统计学方法
采用 SPSS 10.0 统计软件包进行统计学分析。
组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 （ One-way
ANOVA），用 Excel 软件对所获得数据进行分析、
处理图表。
2 结果
2.1 葛根素增强人成骨样MG-63细胞ALP的活性
用葛根素、雷洛昔芬或 E2 处理细胞 2、4、6 d，
分别测定细胞的 ALP 活性，结果见图 1。葛根素
（0.01、0.1、1 μmol/L）于 4、6 d 能够显著增强细
胞内的 ALP 活性（P＜0.05），而 2 d 时只有高浓度
葛根素（1 μmol/L）才有此作用（P＜0.05）。雷洛
昔芬和 E2（0.1 μmol/L）在相同的时间点也可显著
增强细胞内的 ALP 活性（P＜0.05）。上述结果提示
葛根素可通过增强成骨细胞 ALP 的活性而促进成
骨细胞分化。
2.2 葛根素促进人成骨样 MG-63 细胞分泌 I 型胶
原蛋白
用葛根素、雷洛昔芬或 E2 处理细胞 2、4、6 d，
分别测定细胞分泌的 I 型胶原，发现不同浓度的葛
根素以剂量依赖方式于 4、6 d 显著促进 I 型胶原蛋
白的分泌（P＜0.05），0.1 μmol/L 的雷洛昔芬和 E2
在相同的时间点亦具有此作用（图 2）。提示葛根素
也可通过增强成骨细胞 I 型胶原蛋白的分泌而促进
成骨细胞分化。
·538· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月




与对照组比较：*P＜0.05，图 2 同
*P < 0.05 vs control group, same as Fig.2
图 1 葛根素对人成骨样 MG-63 细胞 ALP 活性的影响
( 3=± n , sx )
Fig. 1 Effect of puerarin on ALP activity in human
osteoblast-like MG-63 cells ( 3=± n , sx )



图 2 葛根素对人成骨样 MG-63 细胞 I 型胶原蛋白分泌的
影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 2 Effect of puerarin on type I collagen protein
secretion in human osteoblast-like
MG-63 cells ( 3=± n , sx )
2.3 ER 阻断剂对葛根素调节成骨细胞 ALP 活性
和 I 型胶原蛋白分泌作用的阻断作用
为了观察葛根素对成骨细胞ALP活性和 I型胶
原蛋白分泌的调节作用是否由 ER 途径介导，在加
入葛根素（0.1 μmol/L）前 30 min 先用 ER 阻断剂
ICI 182, 780（100 μmol/L）处理 MG-63 细胞，而后
应用磷酸苯二钠法和 ELISA 法分别检测 ALP 活性
和 I 型胶原蛋白分泌水平。由图 3 可见，ICI 182, 780
可阻断葛根素诱导的ALP活性增强和 I型胶原蛋白
分泌增加（P＜0.05），而 ICI 182, 780 本身对二者
的影响不大（P＞0.05），提示葛根素对成骨细胞的
促分化作用是 ER 途径介导的。
2.4 由 ERα和 ERβ共同介导的葛根素对成骨细胞
ALP 活性和 I 型胶原蛋白分泌的促进作用
为了观察葛根素是通过 ER 哪种亚型发挥上述
作用的，应用葛根素处理 MG-63 及其稳定转染的
细胞克隆，随后应用磷酸苯二钠法和 ELISA 法分别
检测 ALP 活性和 I 型胶原蛋白分泌水平。由图 4 可
见，雷洛昔芬和 E2 对 MG-63/scrambled shRNA 细
胞与未转染的 MG-63 细胞 ALP 活性和 I 型胶原蛋
白分泌的促进作用差异不大；二者对 MG-63/ERα
shRNA 细胞 ALP 活性和 I 型胶原蛋白分泌的的促
进作用则较 MG-63/scrambled shRNA 及未转染的
MG-63 细胞明显减弱（P＜0.05），而对 MG-63/ERβ
shRNA 细胞的作用影响不大（P＞0.05）；葛根素对
上述细胞ALP活性和 I型胶原分泌的促进作用无显
著差异（P＞0.05）。上述结果提示葛根素对成骨细
胞的促分化作用是由 ERα 和 ERβ 共同介导，而雷
洛昔芬和 E2 对成骨细胞的促分化作用则主要是由
ERα 介导的。


与对照组比较：*P＜0.05；与葛根素组比较：#P＜0.05
*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs puerarin group
图 3 ICI 182, 780 对葛根素促进的人成骨样 MG-63 细胞 ALP 活性和 I 型胶原蛋白分泌的阻断作用 ( 3=± n , sx )
Fig. 3 Blocking effect of ICI 182, 780 on ALP activity and type I collagen protein secretion in human osteoblast-like
MG-63 cells promoted by puerarin ( 3=± n , sx )
对照
葛根素 0.01 μmol·L−1
葛根素 0.1 μmol·L−1
葛根素 1.0 μmol·L−1
雷洛昔芬
E2
A
LP
相
对
活
性

6
5
4
3
2
1
0
2 4 6
t / d
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
2 4 6
t / d
800
700
600
500
400
300
200
100
0
I型
胶
原
蛋
白
相
对
量
/
%

对照
葛根素 0.01 μmol·L−1
葛根素 0.1 μmol·L−1
葛根素 1.0 μmol·L−1
雷洛昔芬
E2
*
*
*
*
*
*
I型
胶
原
蛋
白
/
%

160
140
120
100
80
60
40
20
0 对照 ICI 182, 780 葛根素 葛根素＋ICI 182, 780
#
*
#
*
2.0
1.5
1.0
0.5
0
A
LP
相
对
活
性

对照 ICI 182, 780 葛根素 葛根素＋ICI 182, 780
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·539·


与 MG-63 细胞比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs MG-63 cells
图 4 葛根素对 MG-63/ERα shRNA 和 MG-63/ERβ shRNA 细胞 ALP 活性和 I 型胶原蛋白分泌的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 4 Effect of puerarin on ALP activity and type I collagen protein secretion in MG-63/ERα shRNA
and MG-63/ERβ shRNA cells ( 3=± n , sx )
3 讨论
流行病学、实验研究和临床资料表明，大豆异
黄酮化合物大豆苷元可抑制去卵巢大鼠骨丢失，但
其对子宫基本无雌激素的刺激作用[9]。葛根素和大
豆异黄酮同属植物雌激素，二者结构极其相似，仅
在 C-8 位相差一糖基，因此推测，葛根素可能具有
和大豆苷元相似的对骨的药理活性。
ALP 是一种同源二聚体糖蛋白，是成骨细胞分
化成熟的标志，也是最常见的评价成骨细胞分化功
能的早期生化指标。ALP 可分解有机磷酸释放无机
磷，增加局部无机磷酸的浓度，促进矿化，它是骨
形成所必需的酶，其表达随着细胞分化的发展而增
强[10]，它的活性反映了成骨细胞的分化功能。前期
研究发现[6]，葛根素可增强体外培养的原代大鼠成
骨细胞分泌 ALP 的活性。本研究发现，随着培养时
间的延长，成骨细胞合成和分泌 ALP 的能力也逐渐
增强，与文献报道一致[10]。在 0.01～1 μmol/L 剂量
内，葛根素以剂量依赖方式显著增加细胞内 ALP
活性，但在等物质的量条件下对 ALP 活性的促进作
用要明显弱于雷洛昔芬和 E2。
I 型胶原蛋白是成骨细胞分化成熟的另一重要
标志。本实验结果表明，随着培养时间的延长，成
骨细胞合成和分泌 I 型胶原蛋白的能力也逐渐增
强，但是增强幅度却很小。在 0.01～1 μmol/L 剂量
内，葛根素以剂量依赖方式显著增加细胞 I 型胶原
蛋白的量，但在等物质的量条件下葛根素对 I 型胶
原分泌的促进作用也要明显弱于雷洛昔芬和 E2。
葛根素对成骨细胞ALP活性和 I型胶原蛋白分
泌的促进作用可被 ER 阻断剂 ICI 182, 780 阻断，提
示葛根素可能通过 ER 途径对成骨细胞发挥促分化
作用。应用 siRNA 技术进一步证明葛根素对成骨细
胞的促分化作用是由 ERα 和 ERβ 共同介导的。葛
根素对成骨细胞的上述作用与另一种大豆异黄酮
化合物染料木黄酮的作用相似，Rickard 等[11]证实
染料木黄酮可通过ERα和ERβ对人成骨细胞发挥弱
雌激素样作用；而与 Song 等[12]研究结果相异，异黄
酮类化合物的作用主要是通过 ERβ 来介导的，其原
因可能是由于异黄酮类化合物之间个体差异[13]、成
骨细胞来源的种属差异和取骨部位不同、成骨细胞
分化阶段不同、培养条件不同或 ER 及其亚型的表
达不同造成的。
参考文献
[1] 单春艳, 郑少雄, 陈莉明, 等. 绝经后激素替代治疗的
妇女发生骨质疏松时某些细胞因子水平的改变 [J].
中国骨质疏松杂志, 2002, 8(4): 293-295.
[2] 朱庆磊, 吕欣然. 葛根索的药理学和临床应用研究进
展 [J]. 中草药, 1997, 28(11): 693-696.
[3] 梅志刚, 王明智, 刘晓洁, 等. 葛根素对大鼠脑缺血再
灌注损伤 α7nAChR、NF-кBp65 及 STAT3 mRNA 表达
的影响 [J]. 中华中医药杂志, 2013, 28(1): 113-117.
[4] 王维维. 葛根素对大鼠缺血性脑损伤的保护作用 [J].
江苏大学学报: 医学版, 2013, 23(5): 373-376.
[5] 张环宇, 李大伟, 史彩虹. 葛根素的临床应用研究进展
[J]. 现代药物与临床, 2012, 27(1): 75-78.
[6] 王久亮, 郑忠志, 李灵芝, 等. 葛根素对大鼠成骨细胞
增殖和分化的影响 [J]. 中国组织工程研究与临床康
复, 2007, 36 (11): 7138-7141.
[7] Luo X H, Liao E Y. Effects of estriol on the proliferation
and differentiation of human osteoblastic MG-63 cells [J].

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
A
LP
相
对
活
性

对照 葛根素 雷洛昔芬 E2
I型
胶
原
蛋
白
相
对
量
/
%
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
对照 葛根素 雷洛昔芬 E2
* * *
*
MG-63
MG-63/scrambled shRNA
MG-63/ERα shRNA
MG-63/ERβ shRNA
MG-63
MG-63/scrambled shRNA
MG-63/ERα shRNA
MG-63/ERβ shRNA
·540· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月

Endocr Res, 2003, 29(3): 343-351.
[8] 祁 琳, 张 鹏, 屈 野, 等. LC调节人成骨样MG-63
细胞表达 OPG、RANKL 分子机制的研究 [J]. 中国骨
质疏松杂志, 2013, 1(2): 125-130.
[9] 徐 霞, 贡沁燕, 鲁映青, 等. 大豆异黄酮对去卵巢
大鼠骨密度和雌激素活性的影响 [J]. 中国新药与临
床杂志, 2002, 21(6): 321-325.
[10] Sun J S, Li Y Y, Liu M H, et al. Effects of coumestrol on
neonatal and adult mice osteoblasts activities [J]. J
Biomed Mater Res A, 2007, 81(1): 214-223.
[11] Rickard D J, Monroe D G, Ruesink T J, et al.
Phytoestrogen genistein acts as an estrogen agonist on
human osteoblastic cells through estrogen receptors alpha
and beta [J]. J Cell Biochem, 2003, 89(3): 633-646.
[12] Song W O, Chun O K, Hwang I, et al. Soy isoflavones as safe
functional ingredients [J]. J Med Food, 2007, 10(4): 571-580.
[13] Veronica G P, Lisa J R, Christopher W B, et al. Negative
Regulation of RANKL-induced osteoclastic differentiation
in RAW264. 7 cells by estrogen and phytoestrogens [J]. J
Biol Chem, 2005, 280(14): 13720-13727.