全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 6 期 2015 年 3 月
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UPLC 结合化学计量学方法的肿节风指纹图谱研究
韦卓纯 1,姚志红 1, 2*,王其意 1,林 培 1,顾利红 3,戴 毅 1, 2,姚新生 1, 2
1. 暨南大学中药及天然药物研究所,广东 广州 510632
2. 中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室,广东 广州 5 10632
3. 广州市药品检验所 中药室,广东 广州 510160
摘 要:目的 建立不同产地肿节风药材超高效液相色谱指纹图谱,为建立快速而高效的肿节风药材整体质量控制方法提供
实验依据。方法 采用 UPLC 法,色谱柱为 Acquity HSS T3 柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm),采用乙腈(D)-水(C)(各含
0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,体积流量 0.5 mL/min,检测波长 330 nm,柱温 35 ℃,建立肿节风药材指纹图谱;通
过相似度评价,结合聚类分析和主成分分析(PCA),对不同批次的肿节风药材进行质量评价。结果 建立的肿节风药材 UPLC
指纹图谱方法确证 16 个共有峰,并对 9 个共有峰进行了明确化学成分指认;18 批肿节风药材的相似度为 0.869~0.979;通
过聚类分析可大致聚成 2 类;PCA 结果支持了聚类分析结果,并发现指纹图谱中迷迭香酸、新绿原酸、隐绿原酸等 5 个差
异性较大的化合物。结论 肿节风的 UPLC 指纹图谱的构建和化学模式的识别为药材质量控制提供更全面的参考。
关键词:肿节风;超高效液相色谱;指纹图谱;相似度分析;聚类分析;主成分分析
中图分类号:R286.6 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2015)06 - 0895 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.06.021
Fingerprint of Sarcandrae Herba by UPLC coupled with chemometrics methods
WEI Zhuo-chun1, YAO Zhi-hong1, 2, WANG Qi-yi1, LIN Pei1, GU Li-hong3, DAI Yi1, 2, YAO Xin-sheng1, 2
1. Institute of Chinese Materia Medica & Natural Products, Jinan University, Guangzhou 510632, China
2. Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of TCM and New Drug Research, Guangzhou 510632,
China
3. Department of Chinese Materia Medica, Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510160, China
Abstract: Objective To establish the UPLC fingerprint for effective quality control of Sarcandrae Herba. Methods The fingerprint
of Sarcandrae Herba was developed with ultra-performance liquid chromatography, and the Acquity UPLC HSS T3 column (50 mm ×
2.1 mm, 1.8 μm) was used in the gradient elution with a mobile phase of acetonitrile-water (both containing 0.1% formic acid): The
flow rate was 0.5 mL/min, the column temperature was 35 ℃, and the detection wavelength was at 330 nm. Similarity evaluation
combined with hierarchical clustering analysis (HCA) and principal components analysis (PCA) were used to evaluate the quality of
herbs from different areas. Results The fingerprint of Sarcandrae Herba was established with good precision, reproducibility, and
stability obtaining within 23 min, and nine peaks in the fingerprint were designed. Eighteen samples could be classified into two
clusters. The PCA result was consistent with the HCA. A brief list of five differential compounds is presented, including rosmarinic
acid, newchlorogenic acid, and so on. Conclusion The establishment of UPLC fingerprint of Sarcandrae Herba and the application of
chemical pattern recognition can provide a more comprehensive reference for the quality control of herbs.
Key words: Sarcandrae Herba; UPLC; fingerprint; similarity evaluation; hierarchical clustering analysis; principal components
analysis
肿 节 风 Sarcandrae Herba 是 金 粟 兰 科
(Chloranthaceae)植物草珊瑚 Sarcandra glabra
(Thunb.) Nakai 的干燥全草[1],具有抗菌[2]、抗炎[2-3]
及抗肿瘤作用[4]。肿节风中所含化学成分主要有香
豆素、挥发油、黄酮、有机酸等[5]。中药色谱指纹
图谱是中药整体性的化学表征,能够反映中药材尽
收稿日期:2014-08-20
基金项目:美国药典项目资助
作者简介:韦卓纯(1989—),女,在读硕士生,研究方向为药物代谢及动力学研究。Tel: (020)85227107 E-mail: zhuo25712495@163.com
*通信作者 姚志红(1967—),女,副教授,主要从事中药质量控制、药动学研究。Tel: (020)85221767 E-mail: tyaozh@ jnu.edu.cn
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量多的组分,对药材的质量控制具有整体性,现已成
为中药质量控制和评价的热点之一[6]。目前,有关肿
节风药材的指纹图谱研究多采用 HPLC 法[7-9],虽能较
全面反映该药材的整体质量,但分析时间长达 60 min
以上,显然未能对其进行有效快速分离。超高效液相
色谱(UPLC)采用 1.7 μm 的小粒径作为色谱柱填料,
极大地提高了分离效率、分析灵敏度,缩短了分析时
间,能够弥补 HPLC 法的不足。本实验建立了不同产
地的肿节风 UPLC 指纹图谱,在数据处理的基础上,
结合相似度评价、系统聚类分析和主成分分析(PCA)
的方法,进行药材的质量分析和评价,为全面控制肿
节风药材的质量提供实验依据。
1 仪器与材料
Waters Acquity UPLC(ultra-performance liquid
chromatography)H-Class 超高效液相色谱系统,配
有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、
柱温箱、PDA 测器和 Empower 2 色谱工作站(美国
Waters 公司);Sartorius BP211D 十万分之一电子天
平;昆山 KQ3200E 超声波清洗器。
乙腈(色谱纯);超纯水(色谱纯,广州市信洪
贸易有限公司);甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限
公司;甲酸(分析纯,山东禹王有限公司);屈臣氏
蒸馏水(北京屈臣氏蒸馏水有限公司);0.22 μm 微
孔滤膜(广州泛宏贸易有限公司)。新绿原酸(批号
131229,质量分数为 99.58%)、绿原酸(批号 140107,
质量分数为 99.91%)、隐绿原酸(批号 140216,质
量分数为 98.69%)、咖啡酸(批号 140224,质量分
数为 99.97%)均购自上海融禾医药科技发展有限公
司;异嗪皮啶 [萨恩化学技术(上海)有限公司,批
号 BI180108,质量分数为 97.86%],迷迭香酸(Sigma
公司,批号 MKBQ 2631V,质量分数为 99.22%);
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸-4-O-β-D-
葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品均为
本实验室从肿节风水提物中分离获得并经过波谱学
实验鉴定结构,且质量分数均在 95%以上。
18 批不同产地的肿节风药材(表 1)均由广州
市药品检验所中药室顾利红主任鉴定为草珊瑚
Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai 的干燥全草,其中
批次 S4、S7、S12~S18 为当地采收,其余批次均
购自药店或药房。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 Waters Acquity UPLC HSS T3 柱(50
表 1 18 批不同产地肿节风药材
Table 1 Eighteen batches of Sarcandrae Herba samples
from different habitats
编号 产地 采集时间
S1 河北石家庄 2013-01
S2 浙江龙泉 2013-08
S3 浙江龙泉 2013-08
S4 重庆市缙云山青龙寨 2013-08
S5 四川乐山 2013-05
S6 江西新干县 2013-02
S7 江西赣州 2013-07
S8 江西樟树 2013-08
S9 江西宜丰县 2013-08
S10 福建三明市三元区 2013-09
S11 福建三明市三元区 2013-09
S12 广东广州敬修堂药业基地 2013-09
S13 广东广州敬修堂药业基地 2013-09
S14 广西无线大明山 2013-10
S15 广西武鸣马头镇 2013-10
S16 广西南宁市郊志虎岭 2013-10
S17 广西南宁高峰林坊 2013-10
S18 广西融安县雅瑶乡 2013-10
mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%
甲酸水溶液(B),梯度洗脱,线性梯度洗脱程序为
0~0.2 min,8% A;0.2~2.0 min,8%~10% A;2.0~
4.0 min,10%~15% A;4.0~6.5 min,15%~18% A;
6.5~9.0 min,18%~20% A;9.0~12.0 min,20%~
25% A;12.0~18.0 min,25%~45% A;18.0~19.5
min,45%~60% A;19.5~21.0 min,60%~100% A;
21.0~22.0 min,100% A;22.0~22.1 min,100%~
8% A;22.1~23.0 min,8% A;检测波长 330 nm;
体积流量 0.5 mL/min;柱温 35 ℃;进样量 2 μL。
2.2 供试品溶液制备
药材粉碎后过 40 目筛,取肿节风药材粉末 0.5
g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,加入体积分数为
60%甲醇 20 mL,称定质量,超声处理(功率 250 W,
频率 40 kHz)30 min,取出,放冷,再称定质量。
用体积分数为 60%甲醇补足减失的质量,摇匀,
9 960 r/min 离心 3 min,取上清液,过 0.22 μm 滤膜,
取续滤液,即得。
2.3 混合对照品溶液制备
取对照品新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、,咖啡
酸、异嗪皮啶、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、迷
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迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖
醛酸和迷迭香酸适量,分别置于棕色量瓶中,以色
谱甲醇溶解并稀释至刻度,制得对照品储备液。分
别取对照品储备液各一定量置 10 mL 棕色量瓶中,
作为对照品稀释液;再分别取对照品稀释液一定量,
置于同一 5 mL 量瓶中,加甲醇定容至刻度,制成
含新绿原酸 8.28 μg/mL、绿原酸 8.56 μg/mL、隐绿
原酸 9.96 μg/mL、咖啡酸 11.12 μg/mL、异嗪皮啶
16.56 μg/mL、槲皮素 -3-O-β-D-葡萄糖醛酸 20
μg/mL、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷 31.2 μg/mL、
山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸 22.5 μg/mL、迷迭香酸
20.24 μg/mL 的混合对照品溶液,即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度考察 取同一份肿节风药材的供试品
溶液,按“2.1”项色谱条件,连续进样 6 针,记录色
谱图,计算得到新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖
啡酸、异嗪皮啶、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、
迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄
糖醛酸、迷迭香酸 9 个主要色谱峰的相对保留时间
的 RSD 值不大于 1.0%,相对峰面积的 RSD 值不大于
3.0%,以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》
(2004 版 A)评价,6 次进样的相似度均不小于 0.999,
表明仪器精密度良好,符合指纹图谱测定的要求。
2.4.2 重复性考察 取同一批肿节风药材,分别按
“2.2”项下方法平行制备 6 份肿节风药材的供试品
溶液,按“2.1”项色谱条件,依次进样 6 次,记录
色谱图。计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡
酸、异嗪皮啶、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、迷
迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖
醛酸、迷迭香酸 9 个主要色谱峰的相对保留时间的
RSD 值不大于 1.0%,相对峰面积的 RSD 值不大于
4.0%,以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》
(2004版A)评价,6次进样的相似度均不小于0.993,
表明样品处理方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性考察 取同一份肿节风药材的供试品
溶液,按“2.1”项色谱条件,分别在 0、2、4、8、
12、24 h 进样,记录色谱图。计算得到新绿原酸、
绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异嗪皮啶、槲皮素-
3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖
苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、迷迭香酸 9 个主
要色谱峰的相对保留时间的 RSD 值不大于 1.0%,
相对峰面积的 RSD 值均不大于 4.0%,以《中药色
谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2004 版 A)评
价,6 次进样的相似度均不小于 0.997,表明供试品
溶液在室温下 24 h 内稳定。
2.5 样品测定及色谱峰的化学成分指认
取 18 批肿节风药材样品,按“2.2”项下方法制备
供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件依次进样测定,
记录色谱图,共获得 16 个共有峰,对其中 9 个共有峰
进行了指认,混合对照品溶液UPLC 色谱图见图 1-A。
2.6 指纹图谱建立
2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品指纹图谱中,
异嗪皮啶是肿节风药材的指标成分,为所有样品共
有,且分离度良好,峰位相对居中,峰面积较大,
所以确定异嗪皮啶为参比峰。
2.6.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将所得的
18 批肿节风药材 UPLC 图谱以 AIA 格式依次导入
国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱相似度评
1-新绿原酸 2-绿原酸 3-隐绿原酸 4-咖啡酸 9-异嗪皮啶
10-槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 11-迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷
12-山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸 13-迷迭香酸
1-neochlorogenic acid 2-chlorogenic acid 3-4-Dicaffeoylquinic
acid 4-caffeic acid 9-isofraxidin 10-quercetin-3-O-β-D- glucuronide
11-rosmarinic acid-4-O-glucoside 12-kaempferol-3-O-β-D-glucuronide
13-rosmarinic acid
图1 混合对照品溶液 (A) 和肿节风药材 (B) UPLC指纹图谱
Fig. 1 UPLC fingerprints of mixed reference solution (A)
and batches of Sarcandrae Herba
1
23
4 9
10
12 13
0 5 10 15 20
A
1
2
3~8
9
10
11
12
13
141516
对照
S18
S1
0 3.83 7.67 11.50 15.34 19.17
t/min
B
t/min
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价系统(2004 版 A 科研类)软件,以 S1 批药材图
谱作为参照谱进行指纹匹配,确定了 16 个共有峰,
建立了肿节风药材 UPLC 指纹图谱,18 批肿节风药
材 UPLC 指纹图谱叠加图见图 1-B,并进行了相似度
计算,18 批药材的相似度在 0.869~0.979,见表 2。
表 2 18 批肿节风药材相似度
Table 2 Similarities of 18 batches of Sarcandrae Herba
编号 相似度 编号 相似度
S1 0.939 S10 0.947
S2 0.952 S11 0.910
S3 0.960 S12 0.896
S4 0.949 S13 0.949
S5 0.957 S14 0.869
S6 0.967 S15 0.873
S7 0.968 S16 0.870
S8 0.909 S17 0.876
S9 0.979 S18 0.934
2.6.3 聚类分析 聚类分析是根据相似程度大小把
样品归类,目前在中药的真伪鉴别、质量评价、品
种分类等方面有较多的应用[10-11]。本实验对 18 个产
地的肿节风药材进行指纹图谱分析,获得包括异嗪
皮啶(9 号峰)的 16 个共有色谱峰,将各个共有峰
相对于参比峰的峰面积量化,得到 18×16 阶数据矩
阵(表 3),导入 SPSS 19.0 版软件,采用组间连接
法,选用欧氏距离对 18 批药材进行聚类分析,结果
见图 2。根据聚类分析结果,18 个产地的肿节风药
材分为两类,其中来自江西、广东、浙江、四川等
6 个产地的药材即样品 S1~S13 聚为第一类,说明
这 6 个产地的肿节风药材指纹图谱较为相似;来自
广西产地的 5 批药材即样品 S14~S18 明显单独聚
为第 2 类,说明广西产地的药材与其他产地的药材
存在一定的差异,直观分析这两类药材的指纹图谱
色谱峰的相对峰面积(表 3)可以发现,第 2 类药
材(S14~S18)的指纹图谱中迷迭香酸(13 号峰)
表 3 16 个共有色谱峰的相对峰面积值
Table 3 Relative peak areas of 16 common chromatographic peaks
峰号 保留时间/min S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18
1 0.929 0.268 0.173 0.264 0.280 0.352 0.250 0.213 0.231 0.254 0.591 0.529 0.218 0.192 0.936 0.769 0.853 0.697 0.917
2 1.769 0.974 0.767 1.111 2.796 1.609 1.016 0.765 1.248 0.936 2.764 2.577 1.012 0.800 3.544 3.442 3.434 2.620 4.230
3 2.063 0.293 0.213 0.322 0.524 0.493 0.298 0.276 0.358 0.256 0.869 0.784 0.205 0.257 1.078 0.882 0.981 0.762 0.914
4 2.242 0.351 0.162 0.180 0.240 0.317 0.148 0.390 0.309 0.189 0.299 0.301 0.213 0.225 0.559 0.522 0.564 0.390 0.490
5 2.462 0.127 0.111 0.397 0.232 0.128 0.401 0.146 0.252 0.267 0.362 0.481 0.326 0.255 0.608 0.483 0.543 0.504 0.715
6 3.053 0.084 0.089 0.096 0.262 0.155 0.087 0.064 0.198 0.083 0.257 0.266 0.134 0.138 0.395 0.407 0.405 0.367 0.275
7 3.264 0.196 0.065 0.068 0.056 0.047 0.059 0.044 0.142 0.052 0.150 0.212 0.082 0.019 0.086 0.076 0.080 0.058 0.089
8 3.476 0.100 0.069 0.071 0.272 0.100 0.070 0.062 0.149 0.072 0.219 0.181 0.090 0.091 0.317 0.338 0.358 0.306 0.290
9 4.891 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
10 5.673 0.392 0.279 0.223 0.559 0.361 0.195 0.283 0.609 0.085 0.367 0.569 0.394 0.151 0.261 0.270 0.258 0.225 0.458
11 6.373 0.231 0.241 0.777 0.622 0.919 0.720 0.603 0.745 0.306 0.693 1.184 0.232 0.243 1.202 1.039 1.184 1.020 0.884
12 6.956 0.475 0.319 0.338 0.638 0.509 0.324 0.386 0.641 0.217 0.918 0.873 0.694 0.257 0.658 0.624 0.666 0.495 0.770
13 7.830 1.278 1.261 1.402 6.305 4.767 1.294 1.685 1.091 1.715 2.375 1.983 0.955 2.712 17.568 16.077 16.987 13.039 10.491
14 10.075 0.119 0.110 0.082 0.455 0.226 0.088 0.115 0.084 0.096 0.152 0.095 0.090 0.166 0.507 0.588 0.554 0.438 0.479
15 11.165 0.159 0.049 0.086 0.131 0.160 0.084 0.096 0.043 0.070 0.045 0.090 0.192 0.099 0.213 0.179 0.184 0.144 0.224
16 11.577 0.197 0.088 0.114 0.089 0.165 0.106 0.128 0.063 0.088 0.113 0.086 0.299 0.129 0.264 0.213 0.237 0.162 0.242
的相对峰面积明显大于第 1 类药材(S1~S13)中
有该峰峰面积,初步猜测这是造成广西产地药材与
其他产地药材分开的主要原因之一。
2.6.4 主成分分析(PCA) 选取了 16 个主要色谱
峰的相对峰面积值作为变量(将异嗪皮啶的色谱峰
设为参比峰),见表 3。采用 EZinfo 软件对表 1 中
18 批药材样品进行 PCA。通过不同产地药材的得分
图可以看出 18 批肿节风药材大致可以分成两大类,
其中 S1~S13 为一类,分布在 A 区域,S14~S18
为一类,分布在 B 区域,见图 3,与聚类分析结果
一致。为了寻找样品组间差异,本实验在此基础上
对 A、B 两组样品进行了 OPLS-DA 分析,找出了
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图 2 18 批肿节风药材聚类树状图
Fig. 2 Dendrogram of 18 batches of of Sarcandrae Herba
图 3 18 批肿节风药材 PCA 得分图
Fig. 3 PCA score diagram of 18 batches of Sarcandrae Herba
差异性较大的 5 个成分,影响大小依次为峰 13、1、
14、8、4,根据保留时间信息知这 5 个峰中有 3 个
为指纹图谱中的主要色谱峰,其中峰 14、8 尚未知
结构,待需进一步研究。
3 讨论
本实验比较了不同提取溶剂如水、60%甲醇、
甲醇、70%乙醇和乙醇,结果发现,60%甲醇所提
取的样品色谱峰信息较为丰富且分离度较好。同时
考察了超声和加热回流两种提取方法,结果发现回
流和超声提取所得色谱峰及峰面积相当,故采用相
对简便的超声提取。对超声时间、溶剂用量进行考
察,结果表明超声时间为 30 min 和溶剂用量为 20
mL 时效果较好。
本实验尝试了甲醇-水系统、甲醇-水(各含
0.1%甲酸)系统、乙腈-水系统和乙腈-水(各含
0.1%甲酸)等不同流动相系统,结果以乙腈-水(各
含 0.1%甲酸)系统得到的色谱峰峰形好且稳定。
通过 PDA 检测器在 190~400 nm 扫描,结果 330
nm 波长下色谱图的色谱峰最多、基线噪音较低,
各成分分离情况相对较好,因此选择 330 nm 作为
检测波长。
本实验在主成分投影空间上,不仅给出了得分
图,还通过 OPLS-DA 分析找出了影响样品分组的 5
个差异性较大的成分。这样能更全面地反映出样品
与样品、样品与变量之间关系。有文献报道该类化
合物具有一定的抗炎活性作用[12-14],提示其可能为
肿节风发挥抗炎作用的主要活性物质群,因此,本
实验进一步说明了咖啡酰类衍生物对肿节风药材质
量有显著影响。
本实验首次建立肿节风药材 UPLC 指纹图谱,
明显缩短了分析时间,样品的出峰数目、强度及分
离度均较理想,可以较全面反映出样品的化学成分
信息,符合指纹图谱研究的技术要求,进一步结合
相似度计算、聚类分析和 PCA 对指纹图谱进行的综
合评价,使得结果更科学、更全面、更准确,对药
材的质量控制具有重要意义。
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S3
S6
S7
S9
S1
S2
S12
S8
S13
S10
S11
S4
S5
S14
S16
S15
S17
S18
0 5 10 15 20 25
欧氏距离
2
1
0
−1
−2
t[1
]
−8 −7 −6 −5 −4 −3 −2 −1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
t[2]
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 6 期 2015 年 3 月
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