全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 8 期 2015 年 4 月

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• 药材与资源 •
白桦 BpNOS 基因的生物信息及表达模式分析
周 姗，孙丰坤，姜 涛，詹亚光，曾凡锁*
东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040
摘 要：目的 克隆白桦 Betula platyphylla 一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），探讨其生物信息及表达模式，
并考察非生物胁迫对其 NOS 基因表达的影响。方法 通过 RACE 技术克隆了白桦 NOS 基因，命名为 BpNOS。初步对
该基因进行了生物信息学分析、分子进化分析、非生物胁迫处理以及信号诱导。结果 该基因全长 1 806 bp，含有完
整的开放读码框，编码 601 个氨基酸（Genebank 登录号：KJ197336）。BpNOS 基因为不稳定疏水性蛋白，可能存在信
号肽，具有跨膜能力，α-螺旋、延伸链、无规则卷曲分布于整个蛋白。分子进化分析结果表明，BpNOS 基因与葡萄等
物种的遗传距离较近，说明有着较近的亲缘关系；与大豆、苜蓿的遗传距离较远，说明其亲缘关系较远。BpNOS 基因
的表达具有节律性，在 15:00 时达到最大值，为 0:00 时的 12 倍。盐、低温、重金属镉胁迫均能抑制 BpNOS 基因的表
达，但响应模式不同；水杨酸（SA）和外源一氧化氮可以促进 BpNOS 基因的表达。结论 非生物胁迫能够在一定时
间范围内抑制 NOS 活性，SA 和外源一氧化氮可以通过 NOS 途径调控内源一氧化氮的合成，为进一步研究白桦一氧化
氮的代谢调控奠定了基础。
关键词：白桦；一氧化氮合成酶；BpNOS；节律调控；生物信息学分析；非生物胁迫
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)08 - 1203 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.08.020
Bioinformatics and expression pattern analysis of BpNOS gene in Betula platyphylla
ZHOU Shan, SUN Feng-kun, JIANG Tao, ZHAN Ya-guang, ZENG Fan-suo
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Objective Nitric oxide synthase (NOS) is a kind of important NOS in organisms. The gene cloning and expression pattern
analysis of NOS in plant laid the foundation for study on the biological functions of nitric oxide in plants. Methods NOS gene in B.
platyphylla was cloned by RACE technology, named BpNOS. Bioinformatics and molecular evolution analysis, abiotic stress, and signal
induced of the gene were preliminarily carried out. Results This full-length gene was 1 806 bp with the complete ORF, encoding 601
amino acids (Genebank ID: KJ197336). BpNOS was an unstable hydrophobic protein. This protein may exist signal peptide with
transmembrane ability. The alpha helix, extension chain, random coil distributed throughout the protein. Molecular evolution analysis
results showed that the genetic distance of BpNOS gene was closer to the gene genetic distance of grape species NOS, which indicates the
relatively close relationship between them; While the genetic distance of BpNOS gene was farther from soybean and alfalfa, which
explains that the relationship of them is far. The expression of BpNOS has rhythm, reached the maximum at 15:00, 12 times as at 0:00. The
expression of BpNOS gene could be inhibited by salt, low temperature, and heavy metal cadmium stress, but in a different response
pattern. The expression of BpNOS gene could be promoted by salicylic acid and exogenous NO. Conclusion Abiotic stress could inhibit
the activity of NOS. The salicylic acid and exogenous NO could be synthesized by NOS pathway to regulate endogenous NO. This paper
lays a solid foundation for the further research on the metabolic regulation of NO in B. platyphylla.
Key words: Betula platyphylla Suk.; nitric oxide synthase; BpNOS; rhythm control; bioinformatic analysis; abiotic stress


收稿日期：2014-11-15
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31200463，J1210053）；黑龙江省博士后启动基金资助（LBH-Q12166）
作者简介：周 姗（1990—），女，硕士在读，研究方向为植物基因工程。Tel: 15804634773 E-mail: zhoushanleo@163.com
*通信作者 曾凡锁（1980—），男，博士，副教授，硕士生导师，从事林木遗传育种和生物技术方面的研究。
Tel: 13694501997 E-mail: zengfansuo@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 8 期 2015 年 4 月

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一氧化氮是生物体内最广泛的信号分子之一[1]，
参与植物中许多重要的生理功能，例如种子萌发、气
孔运动、下胚轴的伸长、防御反应和细胞程序性死亡
（PCD）、激素的反应、根和木质部发育、次生代谢和
开花等[2-5]。有越来越多的证据表明植物在响应逆境胁
迫（包括盐度、干旱、寒冷、重金属、抗病等）的过
程中，一氧化氮起着至关重要的作用[2]。研究表明，
一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和硝酸还
原酶（NR）是 2 个催化精氨酸和亚硝酸盐生成一氧
化氮的关键酶。已有研究结果支持 NOS 途径在植物
中的存在[2,4]。研究表明，NOS 参与植物对非生物胁
迫的响应，如耐盐等。除了非生物胁迫，病原物诱
导[4]和机械损伤[6]均能诱导 NOS 产生一氧化氮。
镉是一种非必需的有毒的重金属，能够诱导
植物 PCD。暴露于镉胁迫下的植物生长不良，呼
吸受到抑制[7-8]。水杨酸（SA）是一种酚类激素，
可调节植物的生长发育，对植物的光合作用、蒸
腾作用与离子的吸收与运输也有调节作用。SA 同
时也可以诱导植物细胞的分化与叶绿体的生成。
SA 还作为内生信号参与植物对病原体的抵御，通
过诱导组织产生病程相关蛋白，当植物的一部分
受到病原体感染时，在其他部分产生抗性[9-10]。
白 桦 Betula platyphylla Suk. 属 于 桦 木 科
（Betulaceae）桦木属 Betula L. 落叶乔木，在我国分
布广泛。白桦树叶和树皮中含有次生代谢产物白桦
三萜，其中白桦树外皮中含有丰富的羽扇豆烷型的
三萜白桦脂醇和白桦脂酸，这 2 种天然产物具有抑
制人免疫缺陷病毒复制和选择性杀死癌细胞等药理
活性[11]。本实验分析了白桦一氧化氮合酶（BpNOS）
基因的分子结构特征及节律表达模式，研究了非生
物胁迫 [重金属镉、低温（4 ℃）、盐] 对该基因表
达模式的影响。然后通过一氧化氮供体硝普钠（SNP）
和 SA 进行信号诱导，揭示 BpNOS 基因在白桦信号
诱导和次生代谢调控中的表达特征，为该基因在白桦
一氧化氮代谢调控中的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
白桦 Betula platyphylla Suk. 取自东北林业大
学白桦强化种子园 5～7 年生嫁接优树（接穗 30 年
生），外植体取自其诱导的组培苗，由东北林业大学
生命科学学院詹亚光教授鉴定。
HY-6A 双层振荡器，Applied Biosystems 7500
荧光定量 PCR 仪。
1.2 方法
将白桦组培苗在 WPM 培养基中进行生根培
养，置于光照培养箱中，控制适宜的温度 24 ℃和
湿度 65%，每隔 3 h 为一个时间点，连续 24 h 取样。
对白桦组培苗进行 50 μmol/L 镉、低温（4 ℃）、200
mmol/L 盐的处理，每个处理均重复 3 次。分别于处
理后 6、12、24、48、96 h 取样。使用 NT＋0.01 mg/L
TDZ＋0.1 mg/L 6-BA 培养基对白桦茎段细胞进行
悬浮培养，将白桦悬浮细胞进行硝普钠（SNP）处
理，加入 SNP 后计时，分别于 6、12、24、48、72
h 取样。对白桦悬浮细胞分别进行 SNP、KFeCN、
cPTIO＋SNP 12 h 的处理，分析白桦悬浮细胞中
NOS 基因表达水平的变化。
应用 CTAB 法提取白桦 RNA，将检测可用的
RNA 反转录成 cDNA 进行 RT-PCR，产物长度在
150～250 bp。模板为稀释 10 倍的 cDNA。荧光定
量使用 TOYOBO（SYBR Green）试剂盒，PCR 体
系（10 μL）：灭菌蒸馏水 3.2 μL，THUNDERBIRD
SYBR qPCR Mix 5 μL，上下游引物各 0.3 μL，
50×ROX reference dye 0.2 μL，cDNA 模板 1 μL。
利用 Applied Biosystems 7500 荧光定量 PCR 仪进行
扩增，反应程序：95 ℃、30 s→95 ℃、5 s→60 ℃、
34 s（共 40 个循环）→95 ℃、15 s→60 ℃、1 min→95
℃、15 s。每份样品重复 3 次。
2 结果与分析
本实验采用 RACE 技术克隆了 BpNOS 基因，
全长 1 806 bp，含有完整的开放读码框，编码 601
个氨基酸（Genebank 登录号：KJ197336）。
2.1 氨基酸理化性质分析
利用在线分析软件Protparam[12]对BpNOS的氨基
酸序列的理化性质进行分析。其蛋白等电点（pI）为
4.92；不稳定系数为 44.73（不稳定系数小于 40 时，
预测蛋白质稳定，反之则不稳定），为不稳定蛋白；
总平均疏水性为 0.799，说明该蛋白为疏水性蛋白。
2.2 BpNOS 蛋白质一级结构分析
2.2.1 亲水区域/疏水区域预测 蛋白质亲疏水
性氨基酸的组成是蛋白质折叠的主要驱动力，通
过亲水性预测可以反映蛋白质的折叠情况。利用
在线分析软件 ProtScale[12]的 Kyte and Doolittle 算
法对 BpNOS 蛋白进行亲水/疏水性分析（＞0.5
为疏水区，＜−0.5 为亲水区，介于 0.5～−0.5 主要
为两性区域）。结果表明，BpNOS 蛋白共有 1 482
个疏水区，无亲水区域（图 1）。
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图 1 BpNOS 基因的亲水/疏水性分析
Fig. 1 Analysis of hydrophilic/hydrophobic BpNOS gene in
B. platyphylla
2.2.2 信号肽的预测和分析 信号肽是N端的一段
氨基酸序列，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，
在蛋白质合成结束之前被切除，信号肽位于蛋白质
的 N 端，一般由 16～26 个氨基酸残基组成，其中
包括疏水核心区、信号肽的 C 端和 N 端。利用在线
分析工具 Signa lP[13]的神经网络算法对 BpNOS 蛋
白进行预测。结果表明，BpNOS 蛋白在 46 或 47
的位置可能存在信号肽，说明 BpNOS 可被分泌出
来，作用到受体上，属于分泌蛋白（图 2）。

图 2 BpNOS 基因蛋白信号肽的预测和分析
Fig. 2 Prediction and analysis of BpNOS gene protein signal
peptide in B. platyphylla
2.2.3 跨膜结构域的预测与分析 跨膜结构是蛋白
质与膜内在蛋白的静电相互作用和氢键键合相互作
用下与膜结合的一段氨基酸片段，一般由 20 个左
右的疏水性氨基酸残基组成，主要形成 α-螺旋。
利用在线工具 TMPred[14]对 BpNOS 蛋白进行跨膜
结构分析。结果表明，BpNOS 蛋白有 2 个跨膜结
构域，其中一个总分为−2 413，既有从外到内的
跨膜能力，又有从内到外的跨膜能力；另一个总
分为−3 768，既有从外到内的跨膜能力，又有从
内到外的跨膜能力（图 3）。

图 3 BpNOS 基因蛋白跨膜结构域预测和分析
Fig. 3 Prediction and analysis of BpNOS gene protein
transmembrane domain in B. platyphylla
2.3 蛋白质的二级结构域的预测与分析
应用 GOR4[15]对 BpNOS 蛋白的二级结构进行
分析。BpNOS 蛋白是由 α-螺旋、延伸链、无规则
卷曲所组成的，并且分布于整个蛋白。BpNOS 蛋
白由 28.79%的 α-螺旋、48.09%的无规则卷曲和
23.13%的延伸链组成。
2.4 氨基酸序列比对及系统进化树构建
利用 NCBI 数据库对 BpNOS 基因序列以及推
测的编码蛋白进行同源序列比对，Blast X 比对结果
见表 1。
系统进化树是物种的进化史，通过构建系统进
化树可以根据这些物种的祖先描述它们的进化关
系。利用 MEGA 5.0 软件，应用 Neighbor-Joining
算法构建系统进化树[16]。结果表明，11 条蛋白序列
大致分为 4 个大类，其中毛果杨、蓖麻、可可、甜
橙、葡萄聚成一类，黄瓜自成一类，碧桃和草莓聚
成一类，大豆和苜蓿聚成一类。BpNOS 蛋白与葡萄
等遗传距离较近说明有着较近的亲缘关系，与大豆、
苜蓿的遗传距离较远，说明其亲缘关系较远（图 4）。
2.5 BpNOS 基因在白桦中的表达模式
2.5.1 BpNOS 基因的节律表达 选取生长一致的
白桦组培苗，分析 BpNOS 基因的节律表达模式，
如图 5 所示。横坐标代表取材时间，纵坐标代表
BpNOS 在白桦中的相对表达量。在 0:00～12:00 时，
NOS 在白桦中的表达量 9:00 时最高，是 0:00 时的 4
倍；在 12:00～21:00 时，15:00 时达到最大值，是 0:00
时的 12 倍。BpNOS 在白桦中的表达量随着时间的推
移波动，在 15:00 时达到高峰，说明 BpNOS 基因的
0 500 1 000 1 500 2 000 2 500
1 800
1 400
1 000
600
200
−200
得
分

位置/bp
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
−0.5
得
分

0 500 1 000 1 500 2 000
位置/bp
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
得
分

0 10 20 30 40 50 60 70
位置/bp
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表 1 BpNOS 基因序列与其他物种同源比对
Table 1 Homological comparison on NOS gene sequence with other species
物种 登录号 比对得分 与 BpNOS 蛋白的一致性/%
碧桃 Prunus persica XM_007218 893.1 1 516 80
甜橙 Citrus sinensis XM_006490 065.1 1 497 82
毛果杨 Populus trichocarpa XM_006368 163.1 1 380 80
葡萄 Vitis vinifera FQ383 930.1 1 370 80
可可 Theobroma cacao XM_007038 310.1 1 362 80
草莓 Fragaria vesca XM_004307 754.1 1 403 80
蓖麻 Ricinus communis XM_002510 916.1 1 352 79
黄瓜 Cucumis sativus XM_004158 061.1 1 263 78
大豆 Glycine max XM_003534 323.2 1 166 77
蒺藜状苜蓿 Medicago truncatula XM_003595 703.1 1 086 76

图 4 BpNOS 基因系统发育进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of BpNOS gene in B. platyphylla

图 5 BpNOS 的节律表达
Fig. 5 Rhythm expression of BpNOS gene
表达具有节律性。
2.5.2 非生物胁迫下 BpNOS 基因在白桦中的表
达 对白桦分别进行重金属镉、低温（4 ℃）、盐
胁迫的处理并在处理后不同时间取样。以未处理
的作为对照，用处理后测得的表达量减掉对照的
表达量，表达水平上调结果为正，表达水平下调
结果为负。结果表明，所有处理都随处理时间的
不同而上下波动。镉处理与低温处理表达情况相
似，在处理 6、48 h 上调表达，其余时间下调表
达。盐处理只有在 12 h 下调表达，其他时间都为
上调表达，在 24 h 时，表达量最高。说明 BpNOS
基因对非生物胁迫有响应，而对不同胁迫方式的
响应模式不同（图 6）。


不同字母表示差异显著（P＜0.05），下同
Different letters mean significant difference (P＜0.05), same as below
图 6 非生物胁迫下 BpNOS 基因在白桦中的表达
Fig. 6 Expression of BpNOS gene under abiotic stress in B.
platyphylla
2.5.3 信号诱导下 BpNOS 基因在白桦中的表达
将白桦悬浮细胞进行 SNP 处理，分析 BpNOS 基因
表达量的变化。结果表明，SNP 处理 12 h，BpNOS
的表达量达到最大值，约为 6 h 的 2 倍，48 h 的
表达量次于 12 h 处理的悬浮细胞，72 h 材料中的
BpNOS 表达量最低，但是均高于未处理的对照。因
此，SNP 对白桦中 BpNOS 的表达具有一定的影响，
初步说明外源一氧化氮通过 NOS 的途径影响了内
源一氧化氮的合成（图 7）。
14

10

6

2
B
pN
O
S
相
对
表
达
量

镉
4℃
NaCl
5
4
3
2
1
0
−1
−2
−3
−4
−5
B
pN
O
S
相
对
表
达
量

a a
b
a
a
a
a a
b
a a
b
a
a
b
6 12 24 48 96
t/h

0.15 0.10 0.05 0
0:00 3:00 6:00 9:00 12:00 15:00 18:00 21:00
毛果杨
蓖麻
可可
甜橙
葡萄
BpNOS
黄瓜
碧桃
草莓
大豆
蒺藜状苜蓿
取材时间
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图 7 SNP 处理后 BpNOS 基因的表达
Fig. 7 Expression of BpNOS gene after SNP treatment
为确定是 SNP 中何种物质对白桦悬浮细胞产
生影响，本研究又对白桦悬浮细胞分别进行 SNP、
KFeCN、cPTIO＋SNP 处理 12 h 后，分析白桦悬浮
细胞中 BpNOS 表达水平的变化。其中 KFeCN 为
SNP 的类似物，分解后不产生一氧化氮，但其他分
解产物与 SNP 相同；cPTIO 为一氧化氮清除剂，将
SNP分解后产生的一氧化氮除去[5,7,12-14]。结果表明，
KFeCN 及 cPTIO＋SNP 处理组，BpNOS 的表达量
均显著低于 SNP 处理组。此结果进一步证实了外源
一氧化氮调节了 BpNOS 基因的转录表达，通过
NOS 途径调控内源一氧化氮的合成（图 8）。


图 8 SNP、KFeCN、cPTIO＋SNP 处理后BpNOS 基因的表达
Fig. 8 Expression of BpNOS gene after SNP, KFeCN, and
cPTIO + SNP
SA 作为一种内生信号，参与植物体内多种代谢
产物的调控。为了确定 BpNOS 能否被 SA 这种信号
物质诱导，对白桦进行 SA 处理，分别于不同时间取
样，观察 BpNOS 表达量的变化。以未处理的作为对
照，表达水平上调结果为正，表达结果下调结果为负。
由结果可以看出，处理 6 h 的材料，表达结果明显上
调，为对照的 3 倍，但在 12 h 和 48 h 结果较对照减
少较为明显，24 h 和 96 h 处理的材料与对照相比基本
不变。说明 SA 通过 NOS 途径参与了一氧化氮信号的
调控（图 9）。

图 9 SA 作用下 BpNOS 基因在白桦中的表达模式
Fig. 9 Expression pattern of BpNOS gene in B. platyphylla
after salicylic acid treatment
3 讨论
动物细胞合成一氧化氮主要通过 NOS 途径。
然而目前的研究中，在植物细胞中的一氧化氮机制
仍是一个有争议的问题。一些研究支持植物中的
NOS 活性的存在。NR 和 NOS 仍然应该是一氧化氮
在植物中的 2 个潜在的酶源[17]。探讨内源性一氧化
氮的产生机制的贡献和解开镉诱导过程中内源性一
氧化氮量的变化，通过药理学方法使用 NR 和 NOS
抑制剂来进行测定。Xiong 等[7]的研究结果表明，
内源性一氧化氮是根冠萌生的重要物质，并有 NOS
和内源性一氧化氮量之间的反馈抑制机制。在
Xiong 等[7]的实验中，外源性一氧化氮对镉诱导的
抑制根冠延伸无改善作用。因此，推测根冠伸长率
是独立的内源性一氧化氮的量所影响的。总之，镉
抑制 NOS 活性，减少内源性一氧化氮的量[7]。这与
本实验的结果类似，在镉处理 12～24 h 的材料中，
BpNOS 的表达量低于对照组，但在 48～96 h 的处理
中，BpNOS 的表达量要高于对照组，这个差异可能
是由于反馈抑制机制造成的。
研究表明一氧化氮通过改变 NOS 活性和内源性
一氧化氮水平参与植物耐盐性[4]。盐是一种主要的非
生物胁迫因子，通过破坏离子平衡和施加渗透压和应
力对植物产生毒性。离子平衡的维护，特别是 K+与
Na+比是植物抵御盐胁迫的重要因素。在细胞质中足
够 K+的存在是调节酶的活化，控制膜电位，和渗透调
节必不可少的。当植物暴露于高浓度的 Na+时，由于
Na+和 K+之间物理化学的相似性，过量 Na+趋于替代
K+，导致植物功能障碍[4,13-14]。Zhao 等[4]的研究发现，
拟南芥 NOS 突变体植物比野生型植物对盐不敏感，
6 12 24 48 72
d
a
c b
e
1.2

0.8

0.4

0
B
pN
O
S
相
对
表
达
量

1.2

0.8

0.4

0
B
pN
O
S
相
对
表
达
量

a
c
b
SNP KFeCN cPTIO＋SNP
b
a
b
a
b
4
2
0
−2
−4
−6
−8
B
pN
O
S
相
对
表
达
量

6 12 24 48 72
t/h
t/h
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内源性一氧化氮水平明显低于野生型植株。减少内源
性一氧化氮水平，可能是考虑到对盐胁迫的响应突变
体和野生型植物之间的差异。总之盐抑制 NOS 的活
性[4]，这与本实验的结果类似，在盐处理 12 h 后，
BpNOS 表达量低于对照组，但盐处理 24～96 h 的植
物材料，BpNOS 的表达量高于对照组。另外，一氧
化氮处理芦苇、玉米等被证明能提高植物对盐胁迫的
耐受性。因此可以推测，24～96 h 盐胁迫处理的植物
材料，NOS 的表达量上升是一种植物的自我修复机
制，通过增加内源性一氧化氮的量来提高植物对盐胁
迫的耐受性。
SA 和一氧化氮都是能够诱导植物对非生物逆境
反应的抗逆信号分子。它们均可通过诱导或增强抗氧
化酶系统活性来清除体内过多的活性氧（ROS），降
低细胞的脂质过氧化，从而增强植物对低温、高温、
干旱、重金属及盐胁迫等非生物逆境的适应能力。研
究证实，SA 的信号途径并不是孤立存在的，它与一
氧化氮之间相互交叉，在很多生理和抗逆反应中都表
现出协同作用[18-20]。SNP 作为外源一氧化氮供体，能
够为植物提供一氧化氮，抑制 BpNOS 的合成。结果
显示，随着处理时间的增加，植物 BpNOS 的表达量
缓慢下降，但是在 12 h 时，BpNOS 表达量高于所有
的处理时间，这种表达机制还不清楚，有待于进一步
研究。本研究表明 SA 能够抑制 BpNOS 活性，只有
在 SA 处理 6 h 的材料中 BpNOS 表达量上升，但在
12 h 和 48 h 的处理材料中，BpNOS 的表达量明显下
降，在 24 h 和 96 h 的处理材料中表达量基本不变。
综上所述，本研究揭示了 BpNOS 基因表达具有
节律性，重金属镉、低温、盐胁迫等非生物胁迫能
够在一定时间范围内抑制 BpNOS 活性，胁迫时间延
长后，由于植物的自我修复机制，BpNOS 的表达量
增加。外源性施加SA和一氧化氮均能够抑制BpNOS
的合成，说明 BpNOS 基因对信号诱导和次生代谢调
控响应明显。本研究为进一步研究 BpNOS 在木本植
物中的生物学功能和机制提供了有力的依据。
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