全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 16 期 2015 年 8 月

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堇菜属 11 种药用植物 rDNA ITS 序列的克隆与分析
蒋 明 1, 4，吴 丹 2，李嵘嵘 3，管 铭 1, 4，章燕如 4
1. 台州学院 浙江省植物进化生态学与保护重点实验室，浙江 椒江 318000
2. 杭州市中医院 骨科，浙江 杭州 310007
3. 台州学院医药化工学院，浙江 椒江 318000
4. 台州学院生命科学学院，浙江 椒江 318000
摘 要：目的 通过测定和分析 11 种堇菜属药用植物的核糖体 DNA 内转录间隔区（rDNA ITS）序列，为该属药用植物的
分子鉴定提供依据。方法 利用 PCR 法克隆 ITS 序列，借助生物信息学工具进行序列分析、遗传距离估算和系统发育树构
建。结果 11 种堇菜属植物的 ITS 全长为 612～638 bp，ITS1 与 ITS2 的长度为 251～265 bp 和 198～211 bp，5.8 S 的长度十
分保守，均为 163 bp；ITS1、ITS2 与 5.8 S 的信息位点数分别为 50、23 和 3。11 种堇菜属植物的遗传距离为 0.025～0.137，
紫花堇菜与七星莲的遗传距离最大，亲缘关系最远；紫花堇菜和鸡腿堇菜的遗传距离最小，亲缘关系最近。结论 克隆到堇
菜属 11 种药用植物的 ITS 序列，它们的信息位点丰富，可用于分子鉴定。
关键词：堇菜属；rDNA；ITS；分子克隆；序列分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)16 - 2454 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.16.020
Cloning and analysis of rDNA ITS sequences from 11 medicinal plants in Viola L.
JIANG Ming1, 4, WU Dan2, LI Rong-rong3, GUAN Ming1, 4, ZHANG Yan-ru4
1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Evolutionary Ecology and Conservation in Taizhou University, Jiaojiang 318000,
China
2. Department of Orthopaedics, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, China
3. College of Pharmaceutical and Chemical Engineering, Taizhou University, Jiaojiang 318000, China
4. College of Life Science, Taizhou University, Jiaojiang 318000, China
Abstract: Objective To provide molecular evidences for identification of medicinal plants in Viola L. by determining and analyzing the
rDNA internal transcribed spacers (ITS) sequences of 11 species in Viola L. Methods ITS sequences were isolated using PCR amplification,
and sequence analysis, evaluation of genetic distance as well as construction of phylogenetic tree were conducted by bioinformatics software.
Results Full ITS sequences of 11 plants in Viola L. were varied from 612 to 638 bp in length. The lengths of ITS1 and ITS2 were 251—265
bp and 198—211 bp, respectively, while 5.8 S sequences were more conserved with identical length of 163 bp. Parsimony information sites of
ITS1, ITS2, and 5.8 S were 50, 23, and 3, respectively. Genetic distance among 11 species in Viola L. varied from 0.025 to 0.137, and the
greatest genetic distances were observed between V. grypoceras and V. diffusa var. brevibarbata, indicating their relative distinct relationship,
and the smallest existed between V. diffusa and V. acuminata, revealing their closest relationship. Conclusion ITS sequences of 11 medicinal
plants in Viola L. were obtained with a result of rich information sites, which provideds a foundation for molecular identification.
Key words: Viola L.; rDNA; ITS; molecular cloning; sequence analysis

堇菜属 Viola L. 植物为多年生或二年生草本，
稀半灌木，生于灌丛、路边、林缘和草地，广布于
温带、热带及亚热带，全世界有 500 余种，我国有
100 多种，其中的不少种类具有药用价值，在民间
被广泛使用[1]。堇菜属药用植物富含类黄酮、香豆
素类、萜类和挥发油等成分，具有清热解毒、生肌
接骨和消肿排脓等功效，用于治疗跌打损伤、风热
咳嗽、咽喉肿痛、无名肿毒、风湿和哮喘等[2]。堇
菜 Viola verecunda A. Grey、紫花地丁 V. philippica
Cav.、鸡腿堇菜V. acuminata Ledeb. 和七星莲V. diffusa

收稿日期：2015-01-04
基金项目：浙江省植物进化生态学与保护重点实验室植物进化生态学人才培育项目（2014）
作者简介：蒋 明（1973—），男，浙江嵊州人，博士，副教授，研究方向为植物发育生物学及其分子调控。E-mail: jiangming1973@139.com
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var. brevibarbata Ging. 等都是民间常见的中草药，
如堇菜可全草入药，具清热解毒、散瘀和止咳功效，
用于治疗疖肿、结膜炎和上呼吸道感染等；紫花地
丁则有凉血消肿、清热解毒和散瘀作用，可治疗目
赤、咽喉肿痛和黄疸性肝炎等[3-4]。近年来，有关堇
菜属药用植物的研究涉及化学成分、药理作用、资
源调查、形态学分类、遗传多样性、组织培养和遗
传转化等方面[5-11]。不同堇菜属药用植物的成分和
功效有一定差异，而在药材市场中常出现混淆现象，
为临床正确应用带来了一定的麻烦。形态学鉴定是
中草药识别的常规方法，但易受基因型、环境和加
工程度等因素的干扰。核糖体 DNA 内转录间隔区
（internal transcribed spacer，ITS）序列因长度保守、
信息位点丰富，在中草药鉴定中有着广泛的应用[12-14]。
本研究以采自浙江的 11 种堇菜属植物为材料，通过
测定和比较它们的 ITS 序列，以期为该属药用植物
的分子鉴定提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料
堇菜 V. verecunda A. Grey 、紫花堇菜 V.
grypoceras A. Gray、戟叶堇菜 V. betonicifolia J. E.
Smith、白花堇菜 V. lactiflora Nakai、七星莲 V. diffusa
var. brevibarbata Ging.、南山堇菜 V. chaerophylloides
(Regel) W. Beck.、紫花地丁 V. philippica Cav.、鸡腿堇
菜 V. acuminata Ledeb.、柔毛堇菜 V. fargesii H.
Boissieu、长萼堇菜 V. inconspicua Blume 和辽宁堇菜
V. rossii Hemsl. ex Forbes et Hemsl. 均由笔者鉴定，采
集地点和海拔等信息见表 1；每个物种采集 4 个单株
的叶片，带回实验室后用自来水洗净，再用无菌水冲
洗 2～3 次，置于−80 ℃低温冰箱中备用。
表 1 堇菜属植物来源
Table 1 Sources of plants in Viola L.
编号 植物名称 采集地 海拔/m
1 堇菜 临海尤溪 128
2 紫花堇菜 嵊州甘霖 135
3 戟叶堇菜 临安天目山 245
4 白花堇菜 临安天目山 389
5 七星莲 天台赤城山 233
6 南山堇菜 天台华顶 566
7 紫花地丁 嵊州甘霖 67
8 鸡腿堇菜 临安清凉峰 1 085
9 长萼堇菜 临海括苍山 450
10 辽宁堇菜 天台华顶 760
11 柔毛堇菜 临安天目山 354
1.2 仪器
BIO-RAD C1000 型 PCR 仪；北京六一 DYY-12
型电泳仪和电泳槽；BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成
像系统；SANYO MDF-382E 型超低温冰箱；
Eppendorf 移液枪；超净工作台；BECKMAN Allegra
64R 高速冷冻离心机；37 ℃恒温摇床。
2 方法
2.1 基因组 DNA 的提取
基因组 DNA 的提取采用试剂盒法，试剂盒购
自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司（北京鼎
国），操作根据“新型植物基因组 DNA 快速提取
试剂盒”说明书进行。基因组 DNA 经电泳检测后，
置于−20 ℃冰箱中保存备用。
2.2 ITS 序列的克隆、转化和测序
ITS 序列的克隆采用通用引物，上、下游引物
分 别 为 5’-TATGCTTAAAYTCAGCGGGT-3’ 和
5’-AACAAGGTTTCCGTAGGTGA-3’，由生工生物
工程（上海）股份有限公司合成，纯化方式为 PAGE。
20 μL 反应体系中依次加入 2 μL 10×PCR 缓冲液
（含 20 mmol/L Mg2+）、0.50 μL dNTPs（Genview）、
各 0.40 μL 上、下游引物（20 μmol/L）、35 ng 基因
组 DNA 和 0.50 μL 的 Taq DNA 聚合酶（2 U/μL，
北京鼎国），最后加无菌 ddH2O 至终体积。反应在
BIO-RAD C1000 型 PCR 仪上进行，扩增程序为 94
℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s，54.8 ℃退火 45 s，
72 ℃延伸 90 s，循环次数为 33。
2.3 PCR 产物的回收、连接和测序
制备 1.2%琼脂糖凝胶用于 PCR 产物的电泳，
在紫外灯下用洁净刀片割取含目的条带的胶块。
DNA 回收采用快速凝胶回收纯化试剂盒（北京鼎
国），操作根据说明书进行。各取 2 μL 经纯化的目
的片段，用 p-GEM T-easy 试剂盒（Promega）连接，
室温放置 2 h，将连接产物转入 DH5α感受态细胞，
经蓝白斑筛选和 PCR 验证后，每个单株各取 3 份阳
性菌液测序。
2.4 序列分析
序列比对采用 ClustalX 1.81 软件[15]；系统发育
树的构建用 MEGA 3.1 软件[16]，建树方法为 NJ
（Neighbor Joining，邻接法），经 1 000 次自举检测。
3 结果与分析
3.1 ITS 序列的克隆
利用通用引物，用 PCR 方法从 11 种堇菜属植
物中克隆到各自的 rDNA ITS 序列。测序结果表明，
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每种植物４个单株的测序结果完全一致。11 种堇菜
属植物的 ITS 序列全长为 612～638 bp，紫花堇菜和
鸡腿堇菜的序列最短，均为 612 bp，柔毛堇菜次之，
为 628 bp，白花堇菜的 ITS 序列最长。ITS1 与 ITS2
的长度为 251～265 bp 和 198～211 bp，白花堇菜的
ITS1 序列最长，紫花地丁次之，为 264 bp，鸡腿堇
菜和紫花堇菜最短；长萼堇菜的 ITS2 序列最长，白
花堇菜和紫花地丁次之，为 210 bp，紫花堇菜和鸡
腿堇菜最短。11 种堇菜属植物的 5.8 S 长度均为 163
bp，与 ITS1 和 ITS2 相比，长度十分保守（表 2）。
5.8 S 的 GC 值为 53.4%～54.6%，堇菜、紫花
堇菜、鸡腿堇菜和柔毛堇菜的 GC 值最高，戟叶堇
菜、七星莲、南山堇菜、紫花地丁和辽宁堇菜的 GC
值次之，均为 54.0%，白花堇菜和长萼堇菜的最小。
ITS1 和 ITS2 的 GC 值均高于 5.8S，ITS1 的 GC 值
为 63.4%～68.0%，柔毛堇菜的 GC 值最大，堇菜和
辽宁堇菜次之，为 67.2%，七星莲的 GC 值最小。
ITS2 的 GC 值为 60.3%～67.7%，变异幅度较 ITS1
和 5.8S 大，鸡腿堇菜的 GC 值最大，其次为紫花堇
菜，GC 值为 67.2%，七星莲的 GC 值最小（表 2）。
表 2 堇菜属植物 ITS 序列的长度及 GC 量
Table 2 Sequence length and GC contents of ITS from plants in Viola L.
5.8 S ITS1 ITS2 编号 植物名称 ITS 名称 长度/bp GC/% 长度/bp GC/% 长度/bp GC/%
1 堇菜 VvITS 163 54.6 262 67.2 209 62.2
2 紫花堇菜 VgITS 163 54.6 251 66.1 198 67.2
3 戟叶堇菜 VbITS 163 54.0 261 64.8 209 62.2
4 白花堇菜 VlITS 163 53.4 265 66.0 210 62.9
5 七星莲 VdITS 163 54.0 262 63.4 209 60.3
6 南山堇菜 VcITS 163 54.0 261 65.9 209 61.7
7 紫花地丁 VyITS 163 54.0 264 65.9 210 62.9
8 鸡腿堇菜 VaITS 163 54.6 251 65.3 198 67.7
9 长萼堇菜 ViITS 163 53.4 260 65.8 211 62.6
10 辽宁堇菜 VrITS 163 54.0 262 67.2 208 62.0
11 柔毛堇菜 VpITS 163 54.6 259 68.0 206 66.0

3.2 5.8 S 序列的比较分析
利用 ClustalX 1.81 对 11 种堇菜属药用植物的
ITS 序列进行比对，并借助 MEGA 3.1 计算 5.8S 的
变异位点及信息位点。结果表明（图 1），11 种堇
菜属植物的 5.8 S 序列有 5 个可变位点（Variable
sites），其中信息位点（parsimony informative sites）
3 个。戟叶堇菜、七星莲、南山堇菜和辽宁堇菜的
5.8 S 序列完全一致；堇菜和柔毛堇菜及紫花堇菜和
鸡腿堇菜的 5.8 S 序列相同，与前述 4 种仅一个碱
基的差异，分别位于 132 bp 和 131 bp 处；白花堇菜
和长萼堇菜与前述 4 种也只有一个碱基的差异，分
别在 59 bp 和 122 bp 处。


图 1 堇菜属 11 种药用植物的 5.8 S 序列
Fig. 1 5.8 S sequences of 11 medicinal plants in Viola L.

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82
82
82
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163
163
163
163
163
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163
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3.3 ITS1 和 ITS2 序列的比较分析
11 种堇菜属植物的 ITS1 序列差异较大，存在
转换、颠换、插入或缺失现象。比对结果表明，ITS1
有可变位点 87 个，信息位点 50 个。紫花堇菜和鸡
腿堇菜的序列较其他 9 种短，在 60～68 bp、75～80
bp 和 263～264 bp 均有缺失现象，但在 122 bp 有一
个碱基的插入；与白花堇菜相比较，其他植物在 60
和 66 bp 均有 1 个碱基的缺失；除紫花地丁和白花
堇菜外，其余物种在 263 和 264 bp 均有 2 个碱基的
缺失（图 2）。ITS1 中，转换和颠换现象十分普遍，
与其他 10 条序列相比，七星莲的 7 bp 和紫花地丁
的 8 bp 均发生颠换，碱基由 C 变为 A；南山堇菜、
紫花地丁、戟叶堇菜和长萼堇菜在 35 bp 处发生转
换，碱基由 C 变为 T（图 2）。

图 2 堇菜属 11 种药用植物的 ITS1 序列
Fig. 2 ITS1 sequences of 11 medicinal plants in Viola L.
与 ITS1 类似，11 种植物 ITS2 序列之间的变
异较大，共有 54 个可变位点，其中信息位点 23
个。与其他 9 种堇菜属植物相比，紫花堇菜和鸡
腿堇菜有较多的缺失现象，分别发生在 14～17、
34～35、44～48、88～89 和 196 bp 处；除长萼堇
菜外，其他 10 条序列在 45 和 46 bp 位置有 2 个
碱基的缺失；白花堇菜和紫花地丁在 196 bp 处有
1 个碱基的插入。ITS2 序列的转换与颠换现象也
十分普遍，如柔毛堇菜在 6 bp 处发生颠换，碱基
由 C 变为 A；戟叶堇菜和南山堇菜在 19 bp 处发
生转换，碱基由 C 变为 T；七星莲 ITS2 序列在
79、84、180 和 201 bp 位置的 C 转换成 T，121 bp
处碱基 C 颠换成 A，而 132 和 181 bp 位置的 G 均
转换成 T（图 3）。
3.4 系统发育分析
以蜜花堇属 Melicytus 药用植物蜜花堇 M.
ramiflorus 为外类群，利用 Mega 软件计算遗传距
离，结果表明（图 4），11 种堇菜属植物的总遗传
距离为 0.078，其中紫花堇菜和鸡腿堇菜的遗传距离
最小，仅 0.015，戟叶堇菜和长萼堇菜次之，遗传距
离为 0.025；紫花堇菜与七星莲的遗传距离最大，为
0.137，鸡腿堇菜和七星莲次之，遗传距离为 0.129。
从系统发育树上看，戟叶堇菜、长萼堇菜、白花堇
菜和紫花地丁聚为一组，在植物分类学上，它们同
属合生托叶组；紫花堇菜和鸡腿堇菜聚为一组，它
们同属鸟嘴柱状组；裂叶堇菜组的南山堇菜和蔓茎
堇菜组的七星莲分别处于不同分支；堇菜、辽宁堇
菜和柔毛堇菜聚为一组；外类群蜜花堇单独聚为一
VrITS
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87
88
87
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177
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177
176
176
178
164
164
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262
262
261
264
260
261
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图 3 堇菜属 11 种药用植物的 ITS2 序列
Fig. 3 ITS2 sequences of 11 medicinal plants in Viola L.

图 4 基于 ITS 序列构建的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree constructed based on ITS
sequences
组，它与 11 种堇菜属植物的遗传距离为 0.284～
0.327。
4 讨论
正确鉴别中草药原植物、药材和成药是中药现
代化生产的基础，也是保证疗效和维系人们健康的
保障。部分药用植物在形态上十分相似，不同产地
或环境条件也会造成外观上的差异，加工炮制后的
药材用常规方法鉴定更难[17]。而植物基因组 DNA
性质稳定，没有器官、组织和细胞的特异性，其组
成和结构也不受发育阶段及外界环境的影响，新鲜
样品、干燥材料甚至加工后的药材也可用于 DNA
的提取，因此 DNA 分子标记已成为中草药鉴定的
常用技术，其中以 rDNA ITS 标记最为普遍，近年
来有广泛应用[18]。魏艺聪等[13]以不同居群草珊瑚和
5 种金粟兰属近缘种为材料，扩增到各自的 ITS 序
列，经比对，发现序列中存在多个特异性信息位点，
可用于这些样品的区分。彭梓等[15]以杜仲及其混淆
品扶芳藤、冬青卫矛和紫花络石等为材料，通过比
较 ITS2 二级结构，发现杜仲及其混伪品在螺旋区的
茎环数目、大小和位置等均存在差异。朱爽等[19]利
用 ITS 结合 RFLP 技术研究毛钩藤和无柄果钩藤之
间的关系，为钩藤属植物的鉴定提供了分子依据。
本研究以 11 种常见的堇菜属药用植物为材料，
在克隆 ITS 全长的基础上进行了序列比对和分析。
堇菜属植物的 5.8 S 十分保守，全长均为 163 bp，
这是因为 5.8 S 在进化过程中所受的选择压力较大
所致，植物 5.8 S 的长度通常为 163 或 164 bp[20]，
也有长度为 154、155 和 162 bp 的报道[21-24]。11 种
堇菜属植物的 ITS1 和 ITS2 序列长度变异较大
（612～638 bp），序列中的信息位点丰富，在漫长
的进化过程中，由于 ITS1 和 ITS2 受到的选择压力

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71
71
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72
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209
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210
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198
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160 180 200

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VlITS
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VaITS
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非常小，能容许更多变异的存在，最终导致序列长
度和碱基组成产生差异，ITS1 和 ITS2 已广泛应用
于近缘种的分子鉴定[25]。堇菜属 11 种药用植物共
有 141 个变异位点和 73 个信息位点，这些信息位点
可将它们完全区分开，可作为这些物种鉴定的分子
标记。堇菜属药用植物 ITS 序列的克隆，为遗传多
样性研究、地理学和鉴定提供了分子依据。
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