全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44卷 第 11期 2013年 6月 ·1465·
蝎毒多肽增强 5-氟尿嘧啶对 H22肝癌抑制作用的机制研究
郑安红，张维东*，王兆朋，王朝霞，贾 青，张月英，武利存
山东省医学科学院基础医学研究所 山东省罕见病重点实验室，济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东
济南 250062
摘 要：目的 探讨蝎毒多肽增强 5-氟尿嘧啶（5-Fu）对肝癌 H22抑制作用的机制。方法 以接种 H22肝癌小鼠腹水方法建
立小鼠荷瘤模型，在接种后第 7天将荷瘤小鼠随机分为模型组、蝎毒多肽（20 mg/kg）组、5-Fu（15 mg/kg）组、低剂量蝎
毒多肽（5 mg/kg）＋5-Fu组、高剂量蝎毒多肽（20 mg/kg）＋5-Fu组，每组 10只，连续给药 21 d。绘制肿瘤体积增长曲线
并计算抑瘤率；CD34 标记肿瘤微血管；免疫组织化学法检测核因子-κB（NF-κB）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内
皮生长因子（VEGF）蛋白表达。结果 与模型组相比，联合给药组 H22肝癌移植瘤的生长受到明显抑制（P＜0.01），微血
管密度（MVD）及 NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白表达均明显降低（P＜0.01）；与 5-Fu组相比，高剂量蝎毒多肽＋5-Fu组的
MVD及 NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白表达也显著降低（P＜0.01），而低剂量蝎毒多肽＋5-Fu组则无显著改变。结论 蝎毒
多肽可增加 5-Fu对肿瘤组织的抑制作用，其机制可能与抑制 H22肝癌组织 NF-κB通路及MMP-9、VEGF的表达，从而抑制
新生血管形成有关。
关键词：蝎毒多肽；肝癌 H22；核因子-κB；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶
中图分类号：R282.710.5；R979.19 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)11 - 1465 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.11.020
Mechanism of polypeptide from scorpion venom increasing inhibition
of 5-fluorouacil on H22 hepatoma
ZHENG An-hong, ZHANG Wei-dong, WANG Zhao-peng, WANG Zhao-xia, JIA Qing, ZHANG Yue-ying,
WU Li-cun
Key Laboratory for Rare & Uncommon Diseases of Shandong Province, Institute of Basic Medicine, School of Medical and Life
Science, Jinan University, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China
Abstract: Objective To explore the mechanism of polypeptide from scorpion venom (PSV) on increasing the inhibition of
5-fluorouacil (5-Fu) on H22 hepatoma. Methods H22 hepatoma model was established through sc inoculating H22 cells suspension
into 40 mice in right armpits. Then tumor-bearing mice were divided into five groups randomly on the day 7 after inoculating: model,
PSV (20 mg/kg), 5-Fu (15 mg/kg), low-dose PSV (5 mg/kg) + 5-Fu, and high-dose PSV (20 mg/kg) + 5-Fu groups, 10 mice in each
group, continuously admininstered for 21 d. Tumor volumes were measured once every other day, then the curves of tumor growth
were drawn and the tumor inhibitory rate was calculated; CD34 was used to mark capillary; Immunohistochemical assay was used to
detect the protein expression changes of nuclear factor-kappa B (NF-κB), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), and vascular
endothelial growth factor (VEGF). Results Compared with the model group, the growth of H22 hepatoma transplantation tumor in the
combinational groups was obviously inhibited (P < 0.01); The microvessel density (MVD) and the protein expression of NF-κB,
MMP-9, and VEGF in the two PSV groups were all decreased significantly (P < 0.01); Compared with 5-Fu group, the MVD and the
protein expression of NF-κB, MMP-9, and VEGF in the high-dose PSV + 5-Fu group were also decreased (P < 0.01), while there was
no significant difference between the low-dose PSV + 5-Fu group. Conclusion PSV may increase the inhibition of 5-Fu on H22


收稿日期：2012-09-03
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81073102，30873408）；山东省自然科学基金资助项目（ZR2010HQ003）；济南市科学技术发展计划
（201004012）
作者简介：郑安红（1987—），女，硕士研究生，研究方向为实验肿瘤病理学。Tel: 18264170193 (0531)82919939 E-mail: ahzheng2008123@126.com
*通信作者 张维东 Tel: (0531)82919939 E-mail: zhangweidongkui@163.com

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hepatoma through blocking NF-κB pathway and reducing the expression of MMP-9 and VGF, which is beneficial to the inhibition of
angiogenesis.
Key words: polypeptide from scorpion venom; H22 hepatoma; nuclear factor-kappa B; vascular endothelial growth factor; matrix
metalloproteinases
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来其
发生率呈逐年上升趋势。由于大部分肝癌患者确诊
时病情已经相当严重，且往往伴随不同程度的肝功
能异常，造成手术治疗困难，因此药物治疗对肝癌
患者是重要的治疗手段之一。5-氟尿嘧啶（5-Fu）
是一种重要的抗代谢抗肿瘤药物，对消化道肿瘤有
良好疗效，但在临床应用中存在耐药性问题。蝎毒
多肽是从东亚钳蝎 Buthu martensii Karsch蝎毒中提
取的多肽混合物，具有抑制多种肿瘤生长和快速增
殖的作用，其与环磷酰胺等化疗药物联合应用能明
显提高化疗疗效[1-3]。本实验通过探讨蝎毒多肽与
5-Fu联合给药对 H22肝癌荷瘤小鼠血管生成及肿瘤
组织中 NF-κB信号通路的影响，为明确其抗肝癌作
用机制及其临床应用提供实验依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
蝎毒（取自东亚钳蝎的蝎尾）冻干粉，购自邹
平县蝎蚁生物科技有限公司，外观呈白色、雪花粉
末状，易溶于水和缓冲液。蝎毒多肽由本实验室提
取[1]，蛋白质量分数≥80%，水分 2.0%～2.5%，聚
丙烯酰胺电泳呈现 17条蛋白条带，HPLC法检测可
见 30多个分离峰。昆明种小鼠腹腔给药的 LD50为
（4.7±0.5）mg/kg。核因子-κB（NF-κB）p65、基质
金属蛋白酶 -9（MMP-9）、血管内皮生长因子
（VEGF）多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限
公司；β-actin多克隆抗体、山羊抗兔 IgG/辣根酶标
记二抗、DAB二氨基联苯胺显色试剂盒购自北京中
杉金桥生物技术有限公司。
1.2 动物和细胞
昆明种小鼠，雄性，4～5周龄，体质量 18～20
g，购自山东大学实验动物中心，合格证号 SCXK
（鲁）20090001。H22肝癌腹水瘤种，由山东省医学
科学院药物所赠予。
1.3 仪器
LeicaDM4000B光学显微镜、Qwin V3 图像分
析软件，德国徕卡仪器有限公司。
2 方法
2.1 模型建立、分组与给药
无菌抽取 H22肝癌荷瘤小鼠腹腔积液，以生理
盐水稀释，调整肿瘤细胞密度至 1×107/mL，接种
于小鼠右腋部皮下，0.2 mL/只。接种后第 7天，取
50荷瘤小鼠随机分为模型组、蝎毒多肽（20 mg/kg）
组、5-Fu（15 mg/kg）组、蝎毒多肽（5 mg/kg）＋
5-Fu（15 mg/kg）组和蝎毒多肽（20 mg/kg）＋5-Fu
（15 mg/kg）组，每组 10只。5-Fu组、低剂量蝎毒
多肽＋5-Fu、高剂量蝎毒多肽＋5-Fu 组于接种 H22
细胞第 8、11、14、17、20、23、26天 ip 5-Fu 15 mg/kg
1 次，在实验的 28 d 内的其余时间低剂量蝎毒多
肽＋5-Fu、高剂量蝎毒多肽＋5-Fu组每天分别 ig蝎
毒多肽 5、20 mg/kg 1次，模型组和 5-Fu组 ig等体
积蒸馏水，蝎毒多肽组每天 ig蝎毒多肽 20 mg/kg 1
次，每天观察小鼠肿瘤生长情况。
2.2 检测指标
2.2.1 肿瘤增长 从用药当天开始，用游标卡尺隔
日测量肿瘤长径（A）及垂直短径（B），计算肿瘤
体积（V）（V＝A×B2/2）。末次给药 24 h后，取完
整肿瘤组织，称质量，计算抑瘤率［抑瘤率＝（对
照组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）/对照组平均
瘤质量］。
2.2.2 免疫组化 SP法检测肿瘤组织中微血管密度、
NF-κB p65、MMP-9、VEGF 蛋白表达 末次给药
24 h后，取完整肿瘤组织，于中性甲醛中固定 24 h，
石蜡包埋切片，脱蜡至水，采用免疫组化 SP 法检
测。3% H2O2氧化灭活内源性过氧化物酶的活性，
柠檬酸热修复 15 min 后分别加入一抗 CD34（1∶
200）和 NF-κB p65、MMP-9、VEGF（均为 1∶100），
4 ℃过夜，二抗孵育 1 h，DAB显色，苏木素染核，
盐酸酒精分化，反蓝，脱水，透明，中性树胶封片，
于显微镜下观察。
CD34主要表达于肿瘤血管内皮细胞细胞质，
以 CD34 表达阳性的血管进行肿瘤微血管密度
（MVD）统计。先于低倍镜下（×100）找到 CD34
表达阳性的血管密集区，然后于高倍镜下（×200）
随机选取 5个视野计数 CD34表达阳性的血管，取
其平均值即为该例MVD。
NF-κB p65表达于细胞核和细胞质中，MMP-9
和 VEGF均表达于细胞质中，均以呈现棕黄色或褐
色为阳性结果。用显微镜图像采集系统采集图像，

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每张切片选 5个视野（×400），用 LeicaQwinV3图像
分析软件进行灰度值半定量分析，检测 NF-κB p65、
MMP-9、VEGF染色程度，数值范围为 0～255，取
平均值即为其灰度值，灰度值越大蛋白表达量越低。
2.3 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件处理，数据均以 ±x s
表示，多组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 对肿瘤生长的影响
与模型组比较，联合给药组小鼠瘤体积增长速
度明显减慢，瘤质量显著减轻（P＜0.01）；蝎毒多
肽组和 5-Fu组小鼠瘤质量亦明显减轻，瘤体积缩小
（P＜0.05）。高剂量蝎毒多肽＋5-Fu组小鼠瘤质量和
瘤体积与 5-Fu组比较差异明显（P＜0.05），而低剂
量蝎毒多肽＋5-Fu 组与 5-Fu 组比较无显著差异。
结果见表 1、图 1。
3.2 对肿瘤组织 MVD 的影响
免疫组化染色显示，CD34 主要位于肿瘤血管
内皮细胞的胞浆中，阳性表达的表现为棕黄色或褐
色。经半定量图像分析可见，模型组小鼠肿瘤组织
MVD为每个视野（11.8±3.553）个。与模型组比
表1 蝎毒多肽与5-Fu联合给药对H22肝癌荷瘤小鼠瘤质量
及抑瘤率的影响 ( ± = 10x s , n )
Table 1 Effect of PSV + 5-Fu on tumor weight and
inhibitory rate of H22-bearing mice ( ± = 10x s , n )
组 别
剂量 /
(mg·kg−1)
瘤质量 / g
抑瘤率
/ %
模型 － 0.590±0.136 －
蝎毒多肽 20 0.478±0.091* 18.98
5-Fu 15 0.439±0.113* 25.50
5-Fu＋蝎毒多肽 15＋5 0.404±0.086** 31.53
15＋20 0.319±0.086**Δ 44.24
与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与 5-Fu组比较：ΔP＜0.05
*P < 0.05 **P < 0.01 vs model group; ΔP < 0.05 vs 5-Fu group

与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与 5-Fu组比较：△P＜0.05
*P < 0.05 **P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 vs 5-Fu group
图 1 各组 H22 肝癌荷瘤小鼠肿瘤体积增长曲线
( ± = 10x s , n )
Fig. 1 Tumor growth curves of H22-bearing mice
in each group
较，高、低蝎毒多肽与 5-Fu联合用药组MVD均明
显降低，分别为每个视野（6.7±2.312）、（8.9±
2.283）个，差异显著（P＜0.01）。5-Fu 组 MVD
为每个视野（9.8±2.440）个，蝎毒多肽组为每个视
野（9.3±2.214）个，均明显高于高剂量蝎毒多肽＋
5-Fu组（P＜0.05），而与低剂量蝎毒多肽＋5-Fu组
无显著差异。结果见图 2。
3.3 对肿瘤组织 NF-κB p65、MMP-9 和 VEGF 蛋
白表达的影响
用 LeicaQwinV3 图像分析软件进行灰度值半
定量分析显示，与模型组比较，联合给药组大鼠脑
组织 NF-κB p65、MMP-9、VEGF蛋白表达量均明
显减少（P＜0.01）；与 5-Fu 组比较，高剂量蝎毒
多肽＋5-Fu组的 NF-κB p65、MMP-9、VEGF蛋白
表达量也均明显减少（P＜0.05），而低剂量蝎毒多
肽＋5-Fu组则无显著改变；高、低剂量蝎毒多肽＋
5-Fu组间亦存在显著差异（P＜0.05）。结果见图 3
和 4。

图 2 各组小鼠 H22 肝癌组织中 MVD 的显微镜观察
Fig. 2 Microscopic observation on MVD in tissue of H22-bearing mice in each group

模型
蝎毒多肽
5-Fu
5-Fu＋蝎毒多肽 5 mg·kg−1
5-Fu＋蝎毒多肽 20 mg·kg−1

1 600
1 400
1 200
1 000
800
600
400
200
0
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
时间 / d
肿
瘤
体
积
/
m
m
3
** **
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*
△
△


模型 蝎毒多肽 5-Fu 5-Fu＋蝎毒多肽 5 mg·kg−1 5-Fu＋蝎毒多肽 20 mg·kg−1



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图 3 蝎毒多肽与 5-Fu 联合给药对 H22 肝癌荷瘤小鼠组织 NF-κB p65、MMP-9 和 VEGF 蛋白表达的影响
Fig. 3 Effect of PSV + 5-Fu on expression of NF-κB p65, MMP-9, and VEGF protein in tissue of H22-bearing mice

与模型组比较：**P＜0.01；与 5-Fu组比较：▲P＜0.05
**P＜0.01 vs model group; ▲P＜0.05 vs 5-Fu group 5 mg/kg
图 4 各组小鼠 H22 肝癌组织中 NF-κB p65、MMP-9 和 VEGF 表达的灰度值分析
Fig. 4 Grey value analysis on NF-κB p65, MMP-9, and VEGF in tissue of H22-bearing mice
4 讨论
NF-κB 蛋白家族是重要的核转录因子，NF-κB
p65是 NF-κB家族的重要成员，是普遍存在于细胞
质中的快反应转录因子，在细胞核内与 DNA 特定
序列结合，激活多种与炎症、免疫反应、细胞生长
或凋亡相关的细胞因子转录[4-7]。NF-κB在多种肿瘤
细胞或组织中高表达或持续性激活，其活化在恶性
肿瘤的发生和发展中起重要作用。NF-κB信息传递
与肝癌细胞的异常活化和肿瘤的恶性程度密切相
关，其机制之一为 NF-κB诱导 VEGF、MMP-2、
MMP-9、环氧合酶-2的表达，从而促进肿瘤血管生
成、浸润及转移。
肿瘤新生血管形成不仅为肿瘤组织提供养分，
而且是恶性肿瘤快速生长、侵袭和转移的重要途
径[8]。VEGF是最重要的肿瘤血管生长因子之一，
主要通过促进血管内皮细胞增殖而促进肿瘤血管生



NF-κB p65

MMP-9
VEGF
模型 蝎毒多肽 5-Fu 5-Fu＋蝎毒多肽5 mg·kg−1 5-Fu＋蝎毒多肽20 mg·kg−1



200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
模型 蝎毒多肽 5-Fu 5-Fu＋蝎毒多肽 5 mg·kg−1 5-Fu＋蝎毒多肽 20 mg·kg−1



灰
度
值

NF-κB p65
MMP-9
VEGF
**
** **
**▲
**▲
**▲

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成，同时增加血管通透性，其表达水平与肿瘤恶性
程度及肿瘤患者的预后密切相关，阻断 VEGF与其
受体的结合成为抗肿瘤血管生成的重要靶点[9-10]。
MMP-9是基质金属蛋白酶家族的重要成员，其通过
降解微血管基底膜和细胞外基质，在肿瘤新生血管
形成早期及促进肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作
用[11]。在肿瘤血管生成过程中 NF-κB 可通过促进
VEGF 和 MMP-9 等血管生长因子的表达而发挥促
血管生成作用。Chiang等[12]的研究发现，索拉非尼
可通过抑制肝细胞癌细胞NF-κB通路而减少VEGF
和MMP-9的表达。
化疗是治疗肝癌的重要手段之一，而 NF-κB的
激活可造成肿瘤组织对化疗的抵抗而导致治疗失
败。NF-κB 抑制剂能够增强肿瘤细胞对传统放化疗
的敏感性，提示临床上化疗联合阻断 NF-κB信号通
路的方法将为治疗肝癌带来新希望。蝎毒多肽是从
东亚钳蝎蝎毒中提取的含有 50～60个氨基酸的多肽
混合物，在抑制多种肿瘤生长和肿瘤血管生成中发
挥重要作用，但作用机制尚不清楚。本实验结果表
明，蝎毒多肽联合 5-Fu 干预小鼠 H22移植瘤，可明
显抑制肿瘤生长及新生血管形成，高剂量蝎毒多肽
联合 5-Fu组小鼠肿瘤组织 NF-κB、VEGF、MMP-9
表达水平较模型组、蝎毒多肽组、5-Fu 组均明显降
低，与低剂量蝎毒多肽联合 5-Fu组比较亦有显著差
异，提示一定剂量的蝎毒多肽可有效增强 5-Fu对H22
肝癌抑制作用，其机制可能与阻断 NF-κB通路、抑
制VEGF和MMP-9的表达，从而减少肿瘤新生血管
形成有关。蝎毒多肽抑制 NF-κB通路的具体作用靶
点将在今后的研究中进一步探索。
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