全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月

·1456·
• 药材与资源 •
金铁锁 β-香树素合酶 cDNA 的克隆、原核表达和功能鉴定
刘家佳 1，谢 晖 2，陈海丰 3，钱子刚 3*
1. 云南大学生命科学学院，云南 昆明 650031
2. 复旦大学药学院，上海 201203
3. 云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500
摘 要：目的 克隆金铁锁 Psammosilene tunicoides 三萜皂苷生物合成途径中的关建酶基因——β-香树素合酶全长 cDNA，
并对其进行表达和分析，为研究其在三萜皂苷合成途径的关键作用及次生代谢产物工程技术在金铁锁上的应用奠定基础。
方法 应用 RT-PCR 和 RACE 等方法，克隆金铁锁 β-香树素合成酶基因全长，将目的片段转化大肠杆菌表达菌株 BL21 中，
IPTG 诱导表达，以 2, 3-氧化鲨烯为底物进行体外酶促，采用 HPLC 法鉴定产物。结果 克隆得到金铁锁 β-香树素合成酶基
因，全长 2 882 bp，ORF 长 2 284 bp，编码 760 个氨基酸。表达产物具有催化 2, 3-氧化鲨烯生成 β-香树素合酶的活性。结论
克隆所得的全长 cDNA 通过大肠杆菌表达 β-香树素合酶，并能催化 2, 3-氧化鲨烯生成 β-香树素，为金铁锁次生代谢工程研
究提供了重要的基础。
关键词：金铁锁；三萜化合物；β-香树素合酶；基因克隆；原核表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)10 - 1456 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.10.019
Cloning, prokaryotic expression, and functional identification of β-amyrin
synthase cDNA of Psammosilene tunicoides
LIU Jia-jia1, XIE Hui2, CHEN Hai-feng3, QIAN Zi-gang3
1. School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650031, China
2. College of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China
3. College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China
Abstract: Objective To clone, express, and characterize the full-length cDNA of β-amyrin synthase provided an important basis for
the study on the key role in the biosynthetic pathway of triterpenoid saponins and secondary metabolism engineering applied to
Psammosilene tunicoides. Methods The full-length cDNA fragment of P. tunicoides was isolated by the method of RT-PCR and rapid
amplification of cDNA ends (RACE). The fragment was transformed into Escherichia coli expression strain BL21, which was induced
by IPTG, and the crude recombinant enzyme was purified from E. coli cell. In the presence of 2, 3-oxidosqualene and other substances,
2, 3-oxidosqualene was converted into β-amyrin efficiently. The catalytic product of P. tunicoides β-amyrin synthase was detected by
high-performance liquid chromatography (HPLC) and identified as β-amyrin. Results The full-length cDNA fragment of P.
tunicoides is 2 882 bp and contains an open reading frame of 2 284 bp nucleotides, which codes for 760 amino acids. Conclusion The
full-length cDNA can produce β-amyrin synthase by prokaryotic expression. The expression product has the catalytic activity of 2,
3-oxidosqualene into β-amyrin, which would provide an important basis for the secondary metabolism engineering to P. tunicoides.
Key words: Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu; triterpenoids; β-amyrin synthase; gene cloning; prokaryotic expression

金铁锁 Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C.
Y. Wu 是石竹科单种属金铁锁属植物，分布于云南、
贵州、四川和西藏等省，主产于云南西北部、中部
和东北部。金铁锁被列为国家二级保护植物，是“云
南白药”的主要组成药材之一，主要以根入药，具
有散瘀定痛、止血、消痈排脓的功效，用于跌打损

收稿日期：2013-08-15
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30960501）
作者简介：刘家佳（1986—）女，云南昆明人，博士，研究方向为药用植物生物技术。Tel: 13888355857 E-mail: 441603928@qq.com
*通信作者 钱子刚 Tel: (0871)5918215 E-mail: qianzig@aliyun.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月

·1457·
伤、风湿痛、胃痛、创伤出血等的治疗[1]。长期以
来，金铁锁完全靠野外采挖，加之自然生长缓慢，
因而野生资源迅速减少，自然产量大幅降低。金铁
锁资源已经不能满足“云南白药”等中成药的需求。
但金铁锁皂苷结构复杂，人工合成困难，天然资源
来源限制，欲从分子生物方面着手对此类化合物的
主要合成途径进行研究。金铁锁的主要有效成分为
金铁锁皂苷（主要为三萜皂苷元），具有抗炎和镇痛
等重要药理活性[2]。三萜皂苷（triterpenoid saponins）
是一类重要的植物次生代谢产物，广泛分布于植物界
中，有抗菌和抗虫害的作用，可用作药物，具有重要
的商业价值。β-香树素合酶是三萜皂苷合成中关键酶，
2, 3-氧化鲨烯经过 2, 3-氧化鲨烯环化酶（OSC）的环
化作用得到三萜类骨架，然后在 β-香树素合酶作用下
得到 β-香树素，再经过一系列酶的催化，包括细胞色
素 P450、酰基转移酶以及糖苷转移酶等生物转化最
后得到极具药用价值的五环三萜皂苷[3]。本课题组将
对 β-香树素合酶的 cDNA 进行相关研究，阐明其在三
萜皂苷合成途径中的关键步骤中的作用。为次生代谢
产物工程技术在金铁锁上的应用奠定基础，对三萜皂
苷的生物合成机制探究有重要意义。
1 材料与试剂
1.1 材料
样品采自西藏林芝，批号为 20060822，由云南中
医学院钱子刚教授鉴定为石竹科金铁锁属植物金铁
锁Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu的根。
1.2 试剂
试剂 SMARTTM RACE cDNA ampification kit
（Clontech 公司），LA Taq（TaKaRa 公司），Plasmid
mini kit II（Biomiga 公司），bacterial protein extraction
kit（Bio Basic 公司），NucleoTrap Gel Extraction Kit
（Clontech 公司），pMD18-T Vector（TaKaRa 公司），
pMD20-T Vector（TaKaRa），pEASYTM-E1 Expression
Kit（TransGen Biotech 公司），Trans1-T1 Phage
Resistant Chemically Competent Cell （ TransGen
Biotech 公司），BL21（DE3）plysS Chemically
Competent Cell（TransGen Biotech 公司），IPTG
（TransGen Biotech 公司），2, 3-氧化鲨烯（95%，Sigma
公司）及常用分子生物学试剂，硅胶 G 板（青岛海
洋化工有限公司）及其他生化试剂和分析纯试剂。
2 金铁锁 β-香树素合酶基因的获得
2.1 总 RNA 的提取
采用 Trizol 法提取金铁锁根的总 RNA。
2.2 RACE-ready first-strand cDNA 的合成
提取的总 RNA 样品 1 μg，按照 SMARTTM
RACE cDNA ampification kit 说明书进行合成，产物加
100 μL Tricine-EDTA 缓冲液稀释，−20 ℃保存备用。
2.3 5’-和 3’-RACE
以已得到的 β-AS 核心基因片段为模板，Primer5.0
设计5’-和3’-RACE 反应引物，PBSS5：5’-CTTCAACC-
CAACAAGCCAACATACAC-3’和PBSS3：5’-GGAAG-
AGGTTCGTTGGTCCGATTAC-3’，按照 SMARTTM
RACE cDNA ampification kit 说明书，PCR 条件为
94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5 个循环；94 ℃、30 s，
70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5 个循环；94 ℃、30 s，
68 s，72 ℃、3 min，305 个循环；4 ℃终止。PCR 产
物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后插入
pMD18-T Vector，转入 Trans1-T1 感受态中，菌株在
含 80 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上筛选，PCR 验
证为阳性克隆的菌落测序。最后菌株−80 ℃保种。
2.4 全长 β-AS cDNA 的获得
用 BioEdit 软件拼接出全长序列，用 Primer 5.0
设计扩增全长 β-AS cDNA 的 PCR 引物，B1-1：
5’-ATTAGTATTAGTTGTAGCAC-3’和 B1-2：5’-AC-
TTTCATTATTTTGGACGT-3 ， 用 5’-RACE-ready
first-strand cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。PCR 条
件为 94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；38 ℃，30 s；72 ℃，
3 min，30 个循环；72 ℃，10 min；4 ℃终止。PCR
产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后
插入 pMD20-T Vector ，转入 Trans1-T1 Phage
Resistant Chemically Competent Cell 中，菌株在含
80 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上筛选，PCR 验证
为阳性单克隆的菌落测序并−80 ℃保种。
2.5 表达载体的构建
将全长 β-AS 基因切胶产物插入 pEASYTM-E1
Expression Vector ， 获 得 pβ-AS-vector ， 转 入
Trans1-T1 感受态中，菌株在含有 50 μg/mL 氨苄青
霉素的 LB 平板上筛选，PCR 验证为阳性单克隆的
菌落测序并−80 ℃保种。阳性单克隆菌株抽取质
粒，−20 ℃保存备用。
2.6 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导原核
表达和粗蛋白的提取
将 pEASYTM-E1 Expression Vector（空载体）和
pβ-AS-vector 分别转入表达菌株 BL21（DE3）plysS
中，挑取经 PCR 验证的阳性单克隆菌株转入 50 mL
含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月

·1458·
℃振荡培养至 A600＝0.3～0.5，加入 100 mmol/L 的
IPTG至终浓度为 0.4 mmol/L，32 ℃继续培养 3.5 h，
离心收集表达菌体，−80 ℃保存。粗蛋白的提取按
照 Bacterial Protein Extraction Kit 说明书操作。提取
的粗蛋白经 SDS-PAGE 电泳分析，将含有目的蛋白
的提取液过 Sephadex G-25 小柱，采用 Brandford 法
测定蛋白量。
2.7 表达产物的功能鉴定
参照金铁锁鲨烯合酶体外酶促反应体系[4-5]，取
经 Ni2+琼脂糖柱纯化的重组鲨烯合酶蛋白 10 μg，以
2, 3-氧化鲨烯为底物，进行体外酶促反应，反应体
系为 3 mmol/L NADPHNa4，100 mmol/L Tris-HCl
（pH 7.5），10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，2%
glycerin；500 μg/L 酶液；40 μg/L FPP，上覆 1 倍体
积正己烷，32 ℃ 10 h，10 000×g 离心，取上层有
机相，分别进行 TLC 及 HPLC。TLC 分析条件：环
己烷-醋酸乙酯 4∶1；HPLC 分析条件：色谱柱为
ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温 30 ℃；
流动相为甲醇-水（75∶25）；体积流量 1 mL/min；
检测波长 210 nm；进样量 10 μL。
3 结果与分析
3.1 总 RNA 的质量
琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA，结果见图 1，18
S 与 28 S 的比约为 1∶2，点样孔周围无污染。

图 1 金铁锁总 RNA 电泳检测
Fig. 1 Electrophoresis of total RNA in P. tunicoides
3.2 5’-和 3’-RACE
5’-RACE 片段约为 1 600 bp，3’-RACE 片段约
为 1 700 bp（图 2）。
3.3 全长 β-AS cDNA 的合成
将 5’-RACE 和 3’-RACE 片段进行拼接后设计
引物扩增后得到约为2 700 bp的全长β-AS cDNA片
段（图 3）。测序后并对序列进行分析得到，β-AS
cDNA 全长 2 882 bp，ORF 长 2 284 bp，编码 760

图 2 5’-RACE 和 3’-RACE 电泳检测
Fig. 2 Electrophoresis of 5’-RACE and 3’-RACE

图 3 全长 β-AS cDNA PCR 电泳检测
Fig. 3 Electrophoresis of full-length β-AS cDNA PCR
个氨基酸。经 EditSeq 软件分析得到蛋白质相对分子
质量为 87 454.75，等电点为 6.178。β-AS cDNA 全
长与王不留行Vaccaria hispanica (Neck.) Garcke同源
性为 87%；与天南星 Gypsophila paniculata Blume 同
源性为 88%；与光果甘草 Glycyrrhiza glabra L. 同源
性为 75%，与人参 Panax ginseng C. A. Mey. 同源性
为 70% ，与三七 Panax notoginseng Wall. var.
notoginseng (Burkill) Hoo et Tseng 同源性为 70%。
3.4 表达载体的构建
首先将已得到的全长 cDNA 与 pEASYTM-E1
Vector 进行连接，得到有目的 DNA 片段、具有 Amp
抗性、带 T7 启动子、His 标签的 pEASYTM-E1 Vector
融合表达载体质粒 pβ-AS-vector ，然后转入
Trans1-T1 感受态细胞，经过 Amp 筛选的单克隆进
行 PCR 验证为阳性克隆（图 4）。将阳性克隆的重
组质粒 pβ-AS-vector 抽提后（图 5）成功转入表达
菌株 BL21（DE3）plysS（图 6）中，经 Amp 筛选
的阳性克隆经引物 T7 promotor primer 和目的基因
反向引物 B1-2 进行 PCR 验证出正确表达方向的阳
28 S
18 S
Marker 总RNA
1 600 bp

2 000 bp

1 500 bp
1 000 bp

1 800 bp

Marker 5’-RACE Marker 3’-RACE
3 000 bp
2 500 bp 2 700 bp
Marker 全长 β-AS
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月

·1459·

1～9-扩增产物
1—9-amplification products
图 4 pβ-AS-vector 转 Trans1-T1 阳性单克隆 PCR 鉴定
Fig. 4 PCR of positive clone by transferring
pβ-AS-vector into Trans1-T1

1～4-扩增产物
1—4-amplification products
图 5 pβ-AS-vector 质粒抽提
Fig. 5 Extraction of pβ-AS-vector plasmid

1～4-扩增产物
1—4-amplification products
图 6 pβ-AS-vector 转入表达菌株 BL21 (DE3) plysS 阳性
克隆 PCR 鉴定
Fig. 6 PCR of positive clone by transferring
pβ-AS-vector into BL21 (DE3) plysS
性重组子，用该阳性重组子进行蛋白表达。
3.5 IPTG 诱导原核表达
用 pEASY-E1Vector 空载体，转入 B21（DE3）
作为对照，装有 pβ-AS-vector 并具有正确表达方向
的阳性重组菌株记作 β-1，含有 pEASY-E1 Vector
空载体的 B21（DE3）不表达蛋白，含有 pβ-AS-vector
的阳性重组菌株在 IPTG 的诱导下表达出相应的蛋
白，大小为 87 000 左右。因此，β-香树素 synthase
在大肠杆菌中成功表达。经提取纯化的粗蛋白经
SDS-PAGE 电泳分析（图 7），大小为 87 000 左右，
与预测结果一致。
3.6 全长 β-AS cDNA 的功能鉴定
3.6.1 TLC 分析[6-7] 经环己烷-醋酸乙酯（4∶1）
展开，10%的硫酸乙醇显色，分析结果表明，样品
和对照品在同一位置显相同斑点且样品和对照品斑
点重合，表明样品中含有 β-amyrin（图 8）。

图 7 表达蛋白的 SDS-PAGE 结果
Fig. 7 SDS-PAGE of protein expression

1-β-香树素合成酶催化产物样品 2-样品与 β-amyrin 对照品混合物
3-β-amyrin
1-catalytic products of β-amyrin synthase 2-mixture of samples and
β-amyrin reference substance 3-β-amyrin
图 8 β-香树素合成酶催化产物的 TLC 分析
Fig. 8 TLC analysis of catalytic products
of β-amyrin synthase
3.6.2 产物的 HPLC 分析[8-9] 以甲醇-水（75∶25）
为流动相，检测波长 210 nm，进样量 10 μL。结果分
析表明，在 210 nm，保留时间为 3.5 min 处催化产物
样品色谱图出现与 β-香树素相应的特征峰，所以该
样品含有 β-香树素。因此，所得的全长 cDNA 可表
达出催化 2, 3-氧化鲨烯生成 β-香树素的蛋白酶。
4 讨论
本研究中，本课题组选择用金铁锁根提取总

2 500 bp
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pβ-AS-vector


2 500 bp

2 500 bp
Marker 1 2 3 4
β-1 对照
8 700 bp
Marker 1 2 3 4
1 2 3 2 1
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月

·1460·
RNA，是因为金铁锁的药用部位是根部，且有效成
分在根部质量分数较高，这样能更好地保证得到所
要研究的基因片段。对金铁锁 β-香树素合成酶基因
序列进行分析显示，该序列与本项目组前期所得金
铁锁 β-香树素合成酶基因核心片段序列的同源性为
99%（GenBank：EF533703.1），证明其为金铁锁 β-
香树素合成酶基因。
在 β-香树素合成酶基因的原核表达中，本课题
组选用根据融合表达载体改进的 pEASY Expression
Vector，并且高表达的 BL（DE3）plysS 菌株对其进
行表达，因为在对 BL（DE3）和 BL（DE3）plysS
两种菌株进行筛选时发现， pEASY Expression
Vector 对 BL（DE3）plysS 转化率高，得到了可溶
并完整的 β-香树素合成酶蛋白，通过 β-香树素合成
酶催化产物的 TLC、HPLC 分析，表达产物具有催
化 2, 3-氧化鲨烯得到 β-香树素的活性。并且 BL21
（DE3）plys 的 T7 RNA 聚合酶基因能防止表达的融
合蛋白质分解[10]。
参考文献
[1] 王学勇, 邱德文, 蒋朝晖. 苗族药物金铁锁研究进展
[J]. 中国中医基础医学杂志, 2002, 8(11): 77-82.
[2] 金 虹, 谭克勤. 西南民族药金铁锁的研究现状及展
望 [J]. 中医药导报, 2005, 11(12): 66-67.
[3] 刘 强, 丛丽娜, 张宗申. 植物甾醇与三萜类皂苷生物
合成基因调控的研究进展 [J]. 安徽农业科学, 2006, 34
(19): 4844-4846.
[4] 戴住波, 钱子刚, 胡运乾, 等. 金铁锁鲨烯合酶 cDNA
的克隆和功能鉴定 [J]. 药学学报 , 2008, 43(12):
1245-1250.
[5] Nakashim A T, Inoue T. Cloning, expression, and
characterization of cDNA encoding A. thaliana squalene
synthase [J]. PNAS, 1995, 92: 2328-2332.
[6] Tetsuo K, Masaaki S, Yutaka E. β-Amyrin synthase
cloning of oxidosqualene cyclase that catalyzes the
formation of the most popular triterpene among higher
plants [J]. Eur J Biochem, 1998, 256: 238-244.
[7] 周 超, 孙 伟, 宋 刚. 人参北芪片主要成分的鉴别
[J]. 中国药业, 2008, 10(17): 34.
[8] 郭 杰, 徐 嵬, 杨秀伟. 娑罗子中三萜皂苷成分的
HPLC 定量分析 [J]. 中草药, 2007, 38(5): 767-770.
[9] 秦学玲, 杨崇仁, 杨庆雄, 等. 金铁锁中 3-O-6′-甲基-β-D
葡萄糖醛酸丝石竹苷的含量测定 [J]. 中国药科大学学
报, 2006, 37(6): 516-518.
[10] Jennifer G, John J D. ompT encodes the Escherichia coli
outer membrane protease that cleaves T7 RNA
polymerase during purification [J]. J Bacteriol, 1988,
170: 1245-1253.