全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 16 期 2013 年 8 月

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牛奶菜属植物及其近缘植物的 ITS2、rbcL 序列分析
张忠廉，宋美芳，李海涛，管燕红，牛迎凤，张丽霞*
中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所云南分所，西双版纳州傣药南药重点实验室，云南 景洪 666100
摘 要：目的 分析 ITS2、rbcL 序列在牛奶菜属植物及其近缘植物间的鉴别能力，并对牛奶菜属植物及其近缘植物的系统
进化进行初步分析。方法 采用直接测序法测定所分析样品的 ITS2、rbcL 序列，获得的序列采用软件 CodonCode Aligner
人工校正，Contig 软件拼接，用 MEGA 4.0 软件分析比对并进行遗传距离等分析，用 NJ 法对比对的序列构建系统分支树。
结果 ITS2、rbcL 序列对牛奶菜属植物及其他所分析样品有较好的鉴别能力，且鉴别能力 ITS2 优于 rbcL；南山藤属、匙羹
藤属植物与牛奶菜属植物间的亲缘关系非常相近。结论 条形码 ITS2、rbcL 序列能很好地区分牛奶菜属植物，且鉴别
能力 ITS2 优于 rbcL；建议将南山藤属、匙羹藤属等小属植物归入牛奶菜属内。
关键词：牛奶菜属；DNA 条形码；ITS2；rbcL；南山藤属；匙羹藤属
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)16 - 2300 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.16.021
ITS2 and rbcL sequence analysis on plants of Marsdenia R. Br. and its related species
ZHANG Zhong-lian, SONG Mei-fang, LI Hai-tao, GUAN Yan-hong, NIU Ying-feng, ZHANG Li-xia
Key Laboratory of Dai and Southern Medicine of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture, Yunnan Branch of Institute of
Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Jinghong 666100, China
Abstract: Objective To identify and preliminarily analyze the plants of Marsdenia R. Br. and its related species by ITS2 and rbcL
sequences. Methods The ITS2 and rbcL regions were amplified and sequenced directly. The sequence was manually calibrated using
CodonCode Aligner, and splited and jointed by Contig software. The genetic distance analysis was carried out by MEGA 4.0 and the
phylogenetic tree was constructed using the Neighbor-joining method. Results The samples analyzed were well identified by ITS2
and rbcL sequences, and the authentication ability of ITS2 was superior to rbcL. The genetic relationship among the plants of
Marsdenia R. Br., Dregea E. Mey., and Gymnema R. Br. was very close. Conclusion ITS2 and rbcL sequences could distinguish
Marsdenia R. Br. species very well, and the authentication ability of ITS2 is superior to rbcL. The preliminary studies suggest that the
Dregea E. Mey. and Gymnema R. Br. should be classified into genus Marsdenia R. Br.
Key words: Marsdenia R. Br.; DNA barcoding; ITS2; rbcL; Dregea E. Mey.; Gymnema R. Br.

牛奶菜属 Marsdenia R. Br. 为萝藦科植物，中
国有 22 种 5 变种，分布于我国华东、华中及西南各
省区，其中云南省境内分布有 16 种，2 变种[1]；该
属多种植物均有作为傣药及民间常用药的沿用历
史，具有清热解毒、止咳平喘、活血止血、祛风除
湿、强壮筋骨等疗效，现代药理学研究揭示该属植
物具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗生育、平喘、
降压、活血、抗炎、镇痛、提高机体免疫等作用[2]。
因具有丰富的药理活性，使得该属植物的临床应用
日益增多，国内外学者对其活性成分及药理作用机
制等方面的研究也在不断深入。
随着应用的不断增多、研究的不断深入，如何
建立一种准确、快速、简捷的牛奶菜属物种鉴定方
法成为当前亟待解决的问题；此外，关于萝藦科牛
奶菜族植物及其下属的组成及划分问题历来争议不
断，2000 年，Endress 等[3]发表的萝藦科分类系统中，
牛奶菜族包括眼树莲属 Dischidia R. Br.、金凤藤属
Dolichopetalum Tsiang、纤冠藤属Gongronema Decne
球兰属 Hoya R. Br.、牛奶菜属 Marsdenia R. Br.、扇
叶藤属 Micholitzia N. E. Br.、夜来香属 Tebsma Coville

收稿日期：2013-04-08
基金项目：中国医学科学院药用植物研究所中央级公益性科研院所基本科研业务专项（YZYN-09-04）
作者简介：张忠廉（1982—），男，助理研究员，研究方向为热带药用植物资源及分子生物学研究。E-mail: zzl0605@163.com
*通信作者 张丽霞，副研究员。E-mail: zlx0428@yahoo.com.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 16 期 2013 年 8 月

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和荟蔓藤属 Cosmostigma Wight；而 Forster[4]建议将
匙羹藤属 Gymnema R. Br.、黑蔓藤属 Jasminanthes
Thou 、南山藤属 Dregea E. Mey. 、马兰藤属
Dischidanthus Tsiang、箭药藤属 Bebstemma Wallex
Wight 等小属归并到牛奶菜属，但《中国植物志》未
采纳 Forster 的观点，仍将匙羹藤属、黑蔓藤属、南
山藤属、马兰藤属、箭药藤属保留为独立的属。
DNA 条形码技术是利用基因组中一段公认
标准的、相对较短的 DNA 片段来进行物种鉴定的
新方法，由加拿大分类学家 Paul Hebert 首次提出，
因其具有操作简便、可重复性强、结果稳定可靠
等优点，引起国际相关学者的广泛关注[5-6]。ITS2
（internal transcribed spacers 2）及编码核酮糖 1, 5-
二磷酸羧化酶大亚基的 rbcL 序列作为 DNA 条形
码序列，因其分辨率高、易于扩增等特点，现已
广泛应用于植物界物种鉴定及不同分类阶元的分
子系统学研究[7-10]。本研究旨在通过比较牛奶菜
属植物及其近缘植物的 ITS2 及 rbcL 序列，分析
二者对牛奶菜属及其近缘植物的鉴别能力，构建
分子系统进化树，并进一步探讨牛奶菜属及其近
缘属植物间的亲缘关系，为该属植物的准确划分
奠定理论基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
实验所用的 21 份材料均野外采集后经本单位
李海涛副研究员鉴定，收集当年生新鲜嫩叶，经变
色硅胶快速干燥后带回实验室内−20 ℃低温保存，
备用。具体材料中文名、拉丁名及缩写代码见表 1。
表 1 供试材料名称及缩写代码
Table 1 Names of samples used for test and their abbreviation code
中文名 缩 写 拉丁名 中文名 缩 写 拉丁名
大叶牛奶菜 DYNNC Marsdenia koi 裂冠牛奶菜 LGNNC M. incisa
通光散 TGS M. tenacissima 球花牛奶菜 QHNNC1 M. globifera
云南牛奶菜 YNNNC M. balansae 大百解 DBJ1 M. griffithii
蓝叶藤 LYT M. griffithii 大百解 DBJ2 M. griffithii
圆头牛奶菜 YTNNC M. tsaiana 海枫屯 HFT M. officinalis
球花牛奶菜 QHNNC2 M. officinalis 球花牛奶菜 QHNNC3 M. officinalis
翅果藤 CGT Myriopteron extensum 马连鞍 MLA Streptocaulon griffithii
华萝藦 HLM Metaplexis hemsleyana 南山藤 NST Dregea volubilis
古钩藤 GGT Cryptolepis buchananii 牛角瓜 NJG C. gigantea
白花牛角瓜 BHNJG Calotropis procera 大叶匙羹藤 DYSGT Gymnema tingens
大花藤 DHT Raphistemma pulchellum

1.2 仪器与试剂
DNA 提取试剂盒，Tiangen（DP305）；引物，
上海生工生物技术有限公司合成；rTaq DNA 聚合酶
（大连宝生物工程有限公司，DR001B）包括：TaKaRa
TaqDNA 聚合酶（5 U/μL），10×缓冲液（Mg2+ free），
dNTP mixture（各 2.5 mmol/L），MgCl2（25 mmol/L）；
Marker，北京鼎国生物技术有限公司（B031）；其
他试剂均为分析纯。
扩增仪（Biometra Professional Standard），电泳
仪（Biometra 公司），凝胶成像系统（Uvitec 公司）。
2 方法
2.1 样品 DNA 的提取、PCR 扩增及测序
供试材料经灭菌水清洗后晒干，将嫩叶剪成碎
块状后经液氮迅速充分研磨，按照 DNA 快速提取
试剂盒所提供方法提取基因组 DNA。所提 DNA 样
品经 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，经适当稀释后
−20 ℃保存备用。扩增 ITS2 序列所用引物，正向
为 5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’ ，反向为
5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；扩增 rbcL
序列所用引物正向为 5’-ATGTCACCACAAACAG-
AAAC-3’，反向为 5’-TCGCATGTACCTGCAGTA-
GC-3’。PCR 反应体系为 20 μL：2 μL 10×PCR 缓
冲液，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1.5 U
Taq 酶，上游和下游引物各 0.5 μmol/L，模板 10～
50 ng。扩增程序为 94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性
45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循
环，最后延伸 10 min；PCR 产物经 PCR 清洁试
剂盒（AXYGEN）纯化后，送由上海英俊生物科
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技有限公司进行正反测序，测序产物同 PCR 扩
增引物。
2.2 数据处理
获得的序列采用软件 CodonCode Aligner
（CondonCode Co，USA）进行人工校正，去除低质
量序列及引物区，contig 软件拼接，对于 ITS2 序列，
拼接得到一致序列后使用基于隐马尔可夫模型的
HMMer 注释方法去除两端 5.8 S 和 26 S 区段获得
ITS2 间隔区序列[11]，应用 Clustal X 软件进行序列
比对，用 MEGA 4.0 软件分析比对并进行遗传距离
等分析，用 NJ 法对比对的序列构建系统分枝树，
用靴带分析（bootstrap analysis，1 000 replicates）
检验简约树中各分支的支持率。
3 结果与分析
3.1 序列信息、PCR 扩增效率和测序成功率
本次所用通用引物在所有分析样品中显示出很
好的通用性。ITS2 序列分析及 rbcL 序列分析中，
PCR 效率均为 100%，测序效率 ITS-2 为 90.5%（样
品 TGS、YNNNC 因聚核酸位点导致直接测序失败，
后采用载体克隆测序成功），rbcL 为 100%；ITS2
序列分析表明，序列最长的为 YNNNC（259 bp），
最短的为 MLA（220 bp），ITS2 比对后序列长度为
284 bp，变异位点为 148 bp（67.15%），其中多态性
信息位点为 90 bp（46.93%），G＋C 量为 52.1%～
73% ，碱基转换（ transition ）数为 26 ，置换
（transiversion）数为 24，二者比值为 1.1；rbcL 序
列分析表明，所有样品的序列长度较一致，（702～
708 bp），最短的为 DYSGT，rbcL 比对后序列长度
为 710 bp，变异位点为 52 bp（7.32%），其中多态
性信息位点为 37 bp（5.21%），变异系数较 ITS2 片
段低很多，G＋C 量为 42.9%～44.8%，碱基转换数
为 8，置换数为 5，二者比值为 1.6。
3.2 牛奶菜属植物亲缘关系分析及 NJ 树鉴定
ITS2 及 rbcL 序列分析均表明，所分析牛奶菜
属样品中，种间亲缘关系最近的为通光散与大百
解，亲缘关系最远的为大叶牛奶菜与通光散，不
同的是 2 种分析方法所显示的最大、最小遗传距
离不同，ITS2 序列分析显示的种间最大、最小遗
传距离分别为 0.134、0.040，而 rbcL 序列分析显
示的最大、最小遗传距离分别为 0.018、0.001。由
此可知，ITS2 序列分析方法与 rbcL 序列分析方法
相比较，鉴别能力较强。
利用 MEGA 4.0 软件构建的 NJ 系统树见图 1、
图 2，两种分析方法所得NJ系统树大体分为 3大支，
后又分为数个小分支。虽 2 种方法所得系统树在个
别细小分支及各分支支持率上有所差别，但总体来
说，2 分析方法所得系统树大体相同，说明所得分
析结果准确度较高，且所分析样品均处于不同分支，
均能被很好的鉴别开来。而 2 系统树在细节处所展
现出的个别差异及各细小分支支持率的不同，恰能
说明 2 分析方法在物种鉴别方面所展现出的能力差
异。如同为球花牛奶菜物种的不同样品，基于 rbcL
序列构建的系统树显示三者完全相同，而基于 ITS2
序列构建的 NJ 系统树却能很好地显示出三者的差
异，且支持率很高（分别为 99、93），进一步证明
ITS2 序列分析方法鉴别能力较高。

图 1 基于 ITS2 序列构建的 NJ 系统树
Fig. 1 NJ tree based on ITS2 sequences

图 2 基于 rbcL 序列构建的 NJ 系统树
Fig. 2 NJ tree based on rbcL sequences

QHNNC3
QHNNC1
QHNNC2
DYSGT
NST
TGS
DBJ1
DBJ2
YTNNC
LGNNC
YNNNC
VLT
HFT
DYNNC
HLM
DHT
NJG
BHNJG
MLA
CGT
GGT
0.05
93
99
96
82
40
40
42
99
99
89
98
93
95
82
100
100
100
100

QHNNC2
QHNNC1
QHNNC3
DYSGT
YTNNC
NST
TGS
DBJ1
DBJ2
LGNNC
LYT
HFT
YNNNC
DYNNC
DHT
HLM
BHNJG
NJG
MLA
GGT
CGT
0.002
84
55
55
68 79
48
58
34
76
94
98
96
99
99
69
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3.3 牛奶菜属植物及其近缘植物的系统进化分析
利用 ITS2 及 rbcL 序列构建的 NJ 系统树，大体
可分为 3 支，1 支由古钩藤、翅果藤及马莲鞍组成，
三者同为杠柳亚科植物；第 2 支包括牛角瓜属的牛
角瓜及白花牛角瓜、萝藦属的华萝藦以及大花藤属
的大花藤，4 份样品同属于马利筋族；第 3 支除包
括所有牛奶菜属样品外，还包括南山藤属的南山藤、
匙羹藤属的大叶匙羹藤，且 2 份样品与牛奶菜属植
物间的亲缘关系非常相近，甚至其与个别牛奶菜属
植物的亲缘关系小于牛奶菜属种间亲缘关系，如南
山藤与圆头牛奶菜、大叶匙羹藤与球花牛奶菜，充分
说明此 2 属植物与牛奶菜属植物间亲缘关系很近。
4 讨论
随着科技的进步、社会的发展，人们对中草药
及传统药物的重视程度越来越高，应用范围及使用
频率也日益增多，但随之而来的问题就是药物应用
的安全性及准确性。多种牛奶菜属植物因其良好的
临床疗效在民间应用广泛，如何能够快速、准确地
鉴别牛奶菜属植物及其近缘植物已成为亟待解决的
问题。本研究利用 ITS2 及 rbcL 序列作为分析手段，
试图区分牛奶菜属植物及其近缘植物，从而为牛奶
菜属植物及其近缘植物的分类及鉴别提供依据。研
究证明，利用此 2 种序列能很好地区分出所分析物
种，且论鉴别能力，ITS2 序列优于 rbcL 序列。
此外，本研究利用 ITS2 及 rbcL 序列对所分析
物种构建的 NJ 系统树显示，南山藤属、匙羹藤属
植物与牛奶菜属植物间具有很好的亲缘关系，个别
物种的属间亲缘关系比牛奶菜属植物种内亲缘关系
更近。而早在 1995 年，Forster 就建议将匙羹藤属
Gymnema R. Br.、黑蔓藤属 Jasminanthes Thou、南
山藤属 Dregea E. Mey.、马兰藤属 Dischidanthus
Tsiang、箭药藤属 Bebstemma Wallex Wight 等小属归
并到牛奶菜属内，但《中国植物志》一直未采纳，
仍按原系统分类法分类。虽本研究所分析样品数量
较少，初步研究结果推荐采纳 Forster 所提建议，但
仍需收集大量样品做进一步分析之后才能做出准确
判断。
参考文献
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