全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 3 期 2012 年 3 月

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三叶木通 MSAP 反应体系的优化及引物筛选
高 寰 1，张 铮 1, 2, 3*，周 婷 1，曹向然 1，陈阳洋 1，王喆之 1, 2, 3
1. 陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062
2. 陕西师范大学 药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西 西安 710062
3. 西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西 西安 710062
摘 要：目的 研究三叶木通表观遗传多样性，建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified
polymorphism，MSAP）反应体系。方法 以三叶木通叶片为材料，利用正交试验建立三叶木通 MSAP 的预扩增和选择性扩
增的最佳反应体系。结果 建立的 MSAP 最佳反应体系为酶切反应：HpaII/MspI 10 U，EcoR I 10 U；预扩增反应：总体积
20 μL，连接产物 2 μL，E00、HM00 各 125 ng，dNTPs 0.312 5 mmol/L，Mg2＋ 1.875 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 2 U；选择性
扩增反应：总体积 20 μL，稀释 200 倍的预扩增产物 5 μL，引物 E-ACT、HM-CAT 各 50 ng，dNTPs 0.250 mmol/L，Mg2＋ 1.250
mmol/L，Taq DNA 酶 1 U。利用优化的体系，最终从 MSAP 的 80 对引物中筛选出有效引物 6 对。结论 建立的 MSAP 反应
体系可用于后续三叶木通 DNA 甲基化的相关研究。
关键词：三叶木通；MSAP；遗传多样性；体系优化；引物筛选；酶切反应
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)03 - 0572 - 05
Optimization of MSAP reaction system for Akebia trifoliata and primers screening
GAO Huan1, ZHANG Zheng1, 2, 3, ZHOU Ting1, CAO Xiang-ran1, CHEN Yang-yang1, WANG Zhe-zhi1, 2, 3
1. College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China
2. Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, Ministry of Education, Shaanxi Normal University,
Xi’an 710062, China
3. National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China, Xi’an 710062, China
Abstract: Objective To establish and optimize the MSAP reaction system for analysis on epigenetic diversity in Akebia trifoliata.
Methods The leaves of A. trifoliata were as materials, using orthogonal L16(45) method to establish pre-amplification and selective
amplification optimum reaction system of the MSAP. Results The optimal MSAP reaction systems include: 10 U HpaII/MspI and
EcoR I in the enzyme digestion; in the 20 μL pre-amplication mixture contained 2 μL of ligation products, 125 ng of each pre-selective
primers, E00 and HM0; 0.312 5 mmol/L of dNTPs, 1.875 mmol/L of Mg2+, 2 U of Taq DNA polymerase; in the 20 μL selective
amplification mixture contained 5 μL of 1∶200 diluted pre-amplification products, 50 ng of each selective primer, 0.250 mmol/L of
dNTPs, 1.250 mmol/L of Mg2+, and 1 U of Taq DNA polymerase. Using the optimal MSAP reaction system to screen for six pairs of
effective primers from 80 pairs of primers of MSAP. Conclusion Those results provide fundamental reference for further epigenetic
studies on A. trifoliata DNA methylation.
Key words: Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz.; MSAP; genctic diversity; optimization of system; primers screening; enzyme digestion

表观遗传为没有 DNA 序列变化的、可遗传的
基因表达改变[1]。DNA 甲基化是表观遗传修饰的主
要方式之一，已成为当今分子生物学领域的研究热
点。DNA 甲基化敏感扩增多态性（methylation
sensitive amplified polymorphism，MSAP）是基于
AFLP 技术的一种用于检测基因组甲基化变异的
PCR技术[2]。MSAP分子标记使用能够识别 5’-CCGG
的四核苷酸位点的同裂酶HpaII/MspI分别和内切酶
EcoRI 组合，对 DNA 序列进行切割。HpaII 只对一
条DNA链上胞嘧啶发生甲基化的DNA链有酶切活
性；MspI 对单链或双链上内部胞嘧啶甲基化序列有
酶切活性。基于此，可以使相同 DNA 序列扩增出

收稿日期：2011-10-18
基金项目：陕西省科技攻关项目（2010K17-05-02）；2010 年国家级大学生创新性实验计划资助项目（101071825）
作者简介：高 寰（1986—），女，硕士，研究方向为植物遗传多样性。E-mail: gaohuan_9132@163.com
*通讯作者 张 铮 E-mail: zhangzheng@snnu.edu.cn
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不同的谱带，以此判断 DNA 5’-CCGG 位点胞嘧啶
的甲基化状态和程度[3]。此技术无需预先知道所分
析 DNA 的序列，并且甲基化多态性高，引物设计
简单，现已成为检测植物基因组 DNA 甲基化水平
的重要方法，在研究植物表观遗传方面具有极大的
应用价值[4-5]。
三叶木通 Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz.为木
通科（Lardizabalaceae）木通属 Akebia Decne.落叶
木质藤本植物，是我国传统中药材。其具有清热利
尿、活血通脉、舒肝益肾等功效，现代药理研究表
明其还具有降压、抗肿瘤、抗衰老等作用[6-8]，已被
收录于《中国药典》2010 年版。目前国内对三叶木
通的研究多集中在生物学形态特征、化学成分、药
用价值、遗传多样性及亲缘关系等方面的研究[9-11]，
但对其表观遗传的研究尚未见报道。本研究以三叶
木通叶片为材料，对 MSAP 技术过程中的主要影响
因素进行正交试验分析，建立并优化三叶木通
MSAP 反应体系，为今后研究其 DNA 甲基化奠定
基础。
1 材料
三叶木通叶片采自陕西商洛镇安县，与陕西师
范大学种质资源圃内的三叶木通比对鉴定，确定所
采材料确为三叶木通 Akebia trifoliata (Thunb.)
Koidz.，经硅胶干燥后于−40 ℃保存。
限制性内切酶 HpaII、MspI 和 EcoR I（NEB 公
司），T4 连接酶（MBI 公司），Taq DNA 聚合酶
（TaKaRa 公司），DL2000 Marker（西安润德生物技
术有限公司），引物和接头由北京赛百盛基因技术有
限公司合成。
Microfuge 22R 离心机、DU730 核酸蛋白分析
仪（Beckman Coulter 公司），PTC—200 PCR 仪
（BIO-RAD 公司），Tanon—1600 数码凝胶图像处理
系统（上海天能科技有限公司），DYCZ—20F 型
DNA 序列分析电泳槽、DYY—12 型电泳仪电源（北
京市六一仪器厂）。
2 方法
2.1 基因组 DNA 的提取
MSAP 技术的 DNA 提取采用本实验室改良的
CTAB 法[11-12]，叶片经液氮处理迅速研磨后用缓冲
洗涤液（0.025% NaCl， 0.2 mol/L Tris-Cl（pH 8.0），
50 mmol/L EDTA（pH 8.0），0.1% PVP，4%巯基乙
醇）清洗 3 次，氯仿-异戊醇抽提前先用等体积苯酚-
氯仿-异戊醇（25∶24∶1）抽提 1 次，用 50%体积
的 5 mol/L NaCl 替换 NaAc。提取的基因组 DNA 样
品于 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2 MSAP 的酶切与连接
2.2.1 双酶切体系 总体积 25 μL，包括 500 ng 基
因组 DNA、NEB 缓冲液 2.5 μL、EcoRI 10 U、
HpaII/MspI 10 U、100×BSA（10 mg/mL）0.2 μL。
37 ℃恒温孵育 2 h，65 ℃变性 20 min。酶切产物于
1.1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2.2 连接体系 将两个单链的接头（EcoRI-
adapter I、EcoRI-adapter II、H/M-adapter I、H/M-
adapter II）复性为双链结构，即 95 ℃变性 5 min，
缓慢冷却至室温，−20 ℃冷冻保存备用。连接体系
总体积 20 μL，各因素水平设置参照三叶木通 AFLP
反应体系[11]，22 ℃连接反应 2 h，65 ℃变性 10 min
后迅速取出，放入−20 ℃保存。
2.3 预扩增的正交反应体系
根据单因子预试验结果，初步选定预扩增的各
因素水平范围，用 E-00/HM-00 引物组合进行连接产
物的预扩增反应，反应总体积 20 μL。采用正交试验
L16(45) 对预扩增反应中的 5 个因素：Taq DNA 聚合
酶、Mg2＋、连接产物、dNTPs 和引物的反应浓度进
行试验，反应条件见表 1。PCR 扩增程序：94 ℃、2
min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30
个循环。预扩增产物于 1.4%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.4 选择性扩增的正交反应体系
在前期预试验基础上，选用 E-ACT/HM-CAT
引物组合，对预扩增中最佳组合的产物进行选择性
表 1 预扩增反应体系的因素与水平
Table 1 Factors and levels of different pre-amplification systems
因 素 水 平
Mg2＋ / (mmol·L−1) dNTP / (mmol·L−1) 引物 / (ng·μL−1) TaqDNA 聚合酶 / ( U·μL−1) 连接产物 / μL
1 0.625 0 0.125 0 50 0.5 1.0
2 1.250 0 0.187 5 100 1.0 2.0
3 1.875 0 0.250 0 150 1.5 3.0
4 2.500 0 0.312 5 200 2.0 4.0
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扩增。采用正交 L16(45) 确定选择性扩增反应中的 5
个因素（Taq DNA 聚合酶、Mg2＋的浓度、预扩增
产物稀释倍数、dNTPs、引物）的最佳反应条件。
各因素水平见表 2。PCR 扩增程序：94 ℃、2 min；
94 ℃、30 s，65 ℃、30 s（每循环降低 0.7 ℃），
72 ℃、1 min，共 13 个循环；72 ℃、5 min；94 ℃、
30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共 24 个循环。
选择性扩增产物于 1.4%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.5 引物筛选
利用优化的选择性扩增体系，采用 EcoRI 引物
8 个，H/M 引物 10 个，共组合 80 对引物进行筛选，
见表 3。通过琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带丰
富清晰的引物组合。对琼脂糖凝胶筛选出的引物组
合进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的进一步检测和筛选。
表 2 选择性扩增反应体系的因素与水平
Table 2 Factors and levels of different selective amplification systems
因 素 水 平
Mg2＋/ (mmol·L−1) dNTP / (μmol·L−1) 引物 / (μmol·L−1) TaqDNA 聚合酶 / (U·μL−1) 预扩增产物稀释倍数
1 0.625 0.125 0 50 0.5 50
2 1.250 0.187 5 100 1.0 100
3 1.875 0.250 0 150 1.5 150
4 2.500 0.312 5 200 2.0 200
表 3 MSAP 分析的引物序列
Table 3 Sequence of primers used for MSAP analysis
引 物 序 列 引 物 序 列
E-AAC 5’GACTGCGTACCAATTCAAC3’ HM-CAG 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGCAG3’
E-ACT 5’GACTGCGTACCAATTCAAT3’ HM-CTC 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGCTC3’
E-AAG 5’GACTGCGTACCAATTCAAG3’ HM-CTA 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGCTA3’
E-ACA 5’GACTGCGTACCAATTCACA3’ HM-CAA 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGCAA3’
E-ACC 5’GACTGCGTACCAATTCACC3’ HM-CAT 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGCAT3’
E-ACG 5’GACTGCGTACCAATTCACG3’ HM-CTG 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGCTG3’
E-AGC 5’GACTGCGTACCAATTCAGC3’ HM-TCCA 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA3’
E-AGG 5’GACTGCGTACCAATTCAGG3’ HM-TCAA 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA3’
HM-CAT 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGCAT3’ HM-TCGA 5’ATCATGAGTCCTGCTCGGTCGA3’

2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.6.1 制胶 取 60 g/L PA 胶 80 mL，96 μL TEMED
和 100 g/L APS 240 μL 混匀制胶，恒定功率 85 W 预
电泳 1 h。
2.6.2 电泳样品准备 取选择性扩增产物 4 μL 并
加入等体积的缓冲液（98%去离子甲酰胺，10
mmol/L EDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰），
混匀，95 ℃变性 5 min 后迅速取出放入冰中冷却，
防止复性，上样量 8.0 μL。
2.7 银染检测
采用三叶木通AFLP 反应体系中的银染检测法[6]。
3 结果
3.1 基因组 DNA 提取
本研究采用改良 CTAB 法所得的 DNA 用琼
脂糖凝胶电泳检测，结果显示 DNA 主带清晰，没
有降解，见图 1。经紫外分光光度计测定，A260/A280
值在 1.7～1.9，说明 DNA 纯度高，蛋白质量极少，
完全满足 MSAP 反应对 DNA 的要求。
3.2 预扩增结果
依据预扩增产物片段范围应集中在 100～750
bp 呈弥散状分布的原则，对预扩增电泳图进行直观

M-DNA Marker 1-三叶木通 DNA
M-DNA Marker 1-DNA of A. trifoliata
图 1 基因组 DNA 电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis of genomic DNA

M 1


2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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分析。从图 2 可以看出 1～10 体系整个预扩增产物
的片段主要集中在 100～750 bp，相对于 11～16
体系更符合 MSAP 对预扩增产物的要求。但是 1，
5 体系扩增的产物量较少，不利于后续选择性扩增
的进行，第 2、3、4、7、9 泳道的非特异性扩增较
多。第 6、8、10 泳道条带亮度较高，扩增产物浓
度高，且主要集中在 100～750 bp，符合预扩增对
产物的要求。最终确定第 6 号泳道的体系为最佳体
系：连接产物 1 μL，E00、HM00 各 150 ng，dNTPs
0.250 mmol/L，Mg2＋ 1.875 mmol/L，Taq DNA 聚
合酶 2 U，并选择第 6 号正交组合产物为选择性扩
增模板。

M-DNA Marker 1～16-预扩增反应体系正交组合中的个因素组合
M-DNA Marker 1—16-pre-amplification reaction system
orthogonal combination of factor combinations
图 2 预扩增正交体系电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of orthogonal design
pre-amplification systems
3.3 选择性扩增结果
运用直观分析法对选择性扩增正交电泳图（图
3）进行分析，可以看到 1～16 号体系非特异性扩增
在逐渐减少，而 11、12、15、16 的非特异性扩增几
乎没有。对正交体系表各个因素进行单因素分析，
发现随着模板稀释倍数的增大，非特异性扩增逐渐
减小。当达到 150～200 倍时，扩增产物的特异性有
明显的提高。从整个电泳图中可以看出 6、11、12、
15、16 泳道效果较好，扩增产物浓度较高，条带清
晰，无明显的非特异性扩增，且片段主要集中在
500～100 bp，符合选择性扩增对产物的要求。同时
兼顾结果与试剂用量，故选择第 16 号体系：总体积
20 μL，稀释 200 倍的预扩增产物 5 μL，E-ACT、
HM-CAT 各 50 ng，dNTPs 0.250 mmol/L，Mg2＋1.875
mmol/L，Taq DNA 酶 1 U。
3.4 引物筛选结果
采用优化的三叶木通 MSAP 反应体系，通过琼
脂糖凝胶电泳检测从 80 对引物中初筛出 11 对扩增
条带清晰，丰富的引物，见图 4。

M-DNA Marker 1～16-选扩增反应体系正交组合中的因素组合
M-DNA Marker 1—16-selective amplification reaction
system orthogonal combination of factor combinations
图 3 选择性扩增正交体系电泳图
Fig. 3 Electrophoresis of orthogonal design selective
amplification systems

1-E-AAC/HM-CAA 2-E-AAC/HM-CAG 3-E-AAC/HM-TCGA
4-E-AAC/HM-CTC 5-E-AAC/HM-CTA 6-E-AAC/HM-CAC
7-E-ACT/HM-CAA 8-E-ACT/HM-CAG 9-E-ACT/HM-TCGA
10-E-ACT/HM-CTC 11-E-ACT/HM-CTA
图 4 引物筛选电泳图
Fig. 4 Electrophoresis of primers screening
3.5 银染结果
将 11 对不同引物组合的选择性扩增产物进行
聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染第 2 次筛选，选取条带
清晰，多态性好的引物组合共 6 对（图 5）。
4 讨论
在建立和优化分子标记反应体系时，常用单因
子试验和正交试验两种方法。但单因子试验无法考
虑到各因素间的相互影响作用，而正交试验设计具
有均衡分散，综合可比及可伸缩，效应明确等特点，

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp


M 1 2 3 4 5 6 7 8
M 9 10 11 12 13 14 15 16
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp


M 1 2 3 4 5 6 7 8
M 9 10 11 12 13 14 15 16
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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1-E-AAC/HM-TCGA 2-E-ACT/HM-CAG 3-E-ACT/HM-CTC
4-E-ACT/HM-CTA 5-E-AAC HM-CAA 6-E-AAC HM-CTA
图 5 引物筛选的银染结果
Fig. 5 Silver stained results of primers screening
可较快地找到因素间的最优组合[13-14]。故本实验在
建立三叶木通 MSAP 反应体系时，根据预试验了解
该反应体系中各因素的浓度水平范围，在此基础上
利用正交试验获取最佳反应体系。
本实验着重对三叶木通MSAP反应体系中预扩
增和选择性扩增进行优化。对预扩增正交试验进行
单因素分析，发现引物浓度和模板浓度是影响本实
验的关键因素。随着模板浓度的升高，预扩增产物
片度范围整体偏下，无法达到预扩增对产物的要求。
引物浓度过低，条带变弱，产物量明显下降。引物
浓度过高，非特异性扩增产物增多。在选择性扩增
中发现模板稀释倍数是影响实验的关键因素，随着
稀释倍数的增大，扩增产物的非特异扩增明显减少。
在对预扩增产物稀释至 150～200 倍时均可获得较
好的产物。
本实验扩增结果表明，扩增反应中 Mg2＋浓度，
dNTPs 浓度和 TaqDNA 聚合酶量三者之间的配比关
系对扩增效果的影响也较为重要。结果显示 Mg2＋
浓度过高致使反应产生非特异性扩增，浓度过低会
导致 TaqDNA 聚合酶的活性降低。过多的 dNTPs
则可与游离的 Mg2＋结合，从而降低反应中 Mg2＋的
实际浓度，对扩增反应产生一定的抑制作用。本实
验结论与多数研究报道一致[15-16]。
本实验建立并优化了适于三叶木通MSAP技术
的反应体系。在此基础上进行引物筛选，得到 6 对
适于三叶木通 MSAP 反应的引物，为分析三叶木通
DNA 甲基化奠定基础。
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