全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 6 期 2012 年 6 月

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青枯菌诱导广藿香防御相关酶同工酶分析
柴婷婷，贺 红*，谢建辉，徐 燃，杨玉秀
广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006
摘 要：目的 研究青枯菌诱导广藿香的致病过程及防御相关酶同工酶的动态变化。方法 利用青枯菌粗毒素诱导广藿香试
管苗，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对诱导植株中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）同工
酶谱带的变化进行分析。结果 青枯菌诱导 1～7 d 后的广藿香植株，表现渐进的发病过程，开始时，植株失绿、少数叶片
萎垂；逐渐植株茎杆弯曲、整株叶片萎蔫。同工酶电泳分析表明，SOD 同工酶在第 1、3 天时分别出现了新谱带，与对照共
有的谱带，强度先增后减；CAT 同工酶在第 3、5 天时分别出现新谱带，第 6 天时强度达到最大；POD 同工酶在第 1、4 天
时分别出现了新谱带，强度先增后减，第 7 天时所有谱带消失。结论 青枯病的发生呈现渐进的过程。青枯菌诱导 1～7 d，
广藿香 SOD、CAT 和 POD 同工酶谱带在数目和强度上均有所不同，呈动态变化，表明 SOD、CAT 和 POD 在广藿香抵抗青
枯菌入侵时可能起到较为重要的作用。
关键词：广藿香；青枯菌；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；过氧化物酶
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)06 - 1170 - 04
Analysis on defense related-enzyme isozymes in Pogostemon cablin
induced by Ralstonia solanacearum
CHAI Ting-ting, HE Hong, XIE Jian-hui, XU Ran, YANG Yu-xiu
College of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
Abstract: Objective To investigate the pathogenesis process and the dynamic change of defense related-enzyme isozymes in
Pogostemon cablin induced by Ralstonia solanacearum. Methods The crude toxin from R. solanacearum was used to induce
the test-tube plantlets of P. cablin and polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze the isozyme bands changes of
superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and peroxidase (POD) in induced plants. Results P. cablin represented
progressive pathogenesis during the R. solanacearum induction. Initially, the plants became gray-green and a few leaves wilted.
Along with the disease developing, the stems of the plants were bending down and the whole plants wilted. The isozyme
electrophoresis showed that new SOD bands emerged on the days 1 and 3, respectively, the strength of common bands of both the
control and induced plants increased at first and then decreased. New CAT bands emerged on days 3 and 5, respectively, and
achieved maximum strength on day 6. And new POD bands emerged on days 1 and 4, respectively, and the strength of the bands
increased at first and then decreased, and all the bands disappeared on day 7. Conclusion The occurrence of bacterial wilt
shows a gradual process. SOD, CAT, and POD isozymes represent dynamic change in P. cablin induced by R. solanacearum
from 1—7d, and the differences occur in the numbers and the strength of the bands, indicating that these enzymes might play an
important role in P. cablin defense against R. solanacearum.
Key words: Pogostemon cablin (Blanco) Benth.; Ralstonia solanacearum; superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT); peroxidase (POD)

广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth. 为唇
形科刺蕊草属植物，以干燥地上部位入药，是临床
上常用的芳香化湿药[1]。广藿香生产上面临青枯病
的危害，该病是由青枯菌 Ralstonia solanacearum 引
起的毁灭性土传病害[2]，发病植株茎叶萎蔫，逐渐
全株枯死，且迅速蔓延。选育抗病品种是降低病害
损失的重要途径，而加快寻找和筛选抗性的种质材
料，减少表型选择可能导致的误差，是首先要解决

收稿日期：2011-12-26
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30873376）
作者简介：柴婷婷（1987—），女，新疆石河子人，在读硕士研究生，主要从事中药生物技术研究。Tel: (020)39358544 E-mail: binglingctt@163.com
*通讯作者 贺 红 Tel: (020)39358067 E-mail: hehong67@yahoo.com.cn
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的问题。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶
（CAT）、过氧化物酶（POD）是植物体内重要的防
御酶，参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等
抗病相关物质的合成，能抵御活性氧及氧自由基对
细胞膜系统的伤害，增强植物对病害的抵抗能力[3]。
植物受到病原菌侵染时，这些防御相关酶同工酶会
产生相应的变化，且在一定程度上反映了寄主植物
的抗性水平[3]。然而，关于广藿香这方面的研究尚
未见报道。本实验主要研究青枯菌诱导广藿香的致
病过程及其 SOD、CAT、POD 同工酶的动态变化，
以揭示病原物与寄主之间的互作关系，为广藿香抗
病育种及抗病机制的研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 青枯菌Ralstonia solanacearum菌
株 HX5，由本实验室采用组织分离法从感染了青枯
病的广藿香植株中分离获得[4]。
1.1.2 供试植株 广藿香植株采自广州中医药大学
药圃，经广州中医药大学药用植物教研室潘超美教
授鉴定为唇形科广藿香 Pogostemon cablin (Blanco)
Benth.。采取广藿香叶片培育试管苗，选择株高 10
cm 左右的试管苗用作对照药材（CK）。
1.2 方法
1.2.1 青枯菌的培养 将供试菌株 HX5 划线接种于
2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培养基上，培养 48
h。TTC 培养基配方：蛋白胨 10.0 g，酸水解酪蛋白
1.0 g，TTC 0.05 g，葡萄糖 10.0 g，H2O 1 000 mL[4]。
1.2.2 青枯菌粗毒素的制备 取 TTC 培养基上培
养的青枯菌单菌落，接种至 Nutrient Agar（NA）液
体培养基中，于 30 ℃、200 r/min 恒温振荡培养 12
h 后，测量细菌培养液的吸光度（A）值，并将其于
4 000 r/min 离心 30 min，取上清液，过 0.22 μm 微
孔滤膜，即得粗毒素原液[5]。
1.2.3 青枯菌诱导广藿香试管苗 将青枯菌粗毒素
按一定比例加入 Murashge and Tucker（MT）培养基
中，使其终浓度为 5.0×108 cfu/mL，再将广藿香试
管苗伤根处理后接入添加了粗毒素的培养基中，进
行致病性诱导试验。
1.2.4 酶液提取 分别称取经青枯菌诱导1～7 d的
广藿香植株及未经诱导的对照植株叶片 0.5 g，加入
1.0 mL 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4），冰浴研
磨。在 4 ℃下，10 000 r/min 离心 10 min，取上清
液即为酶液，置于−20 ℃冰柜中保存，供同工酶电
泳检测[6]。
1.2.5 电泳 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，3
种同工酶分析所用的分离胶质量分数均为 7.5%，浓
缩胶质量分数均为 3%。每个点样孔上样 30 μL，用
0.1%溴酚蓝作为前沿指示剂，Tris-甘氨酸（pH 8.3）
作为电极缓冲液，置于 4 ℃冰箱中进行电泳，初始
电压 100 V，2 h 后 200 V，待指示剂距玻璃板末端
1.5 cm 处时，停止电泳。在此电泳条件下，每种同
工酶进行 4 次重复试验，均出现稳定的条带模式。
1.2.6 染色 SOD 染色采用氯化硝基四氮唑蓝
（NBT）法[7]。在 0.24 mmol/L NBT 溶液黑暗浸泡 20
min，然后在 pH 7.8 的 0.036 mol/L 磷酸缓冲液（内
含 0.028 mol/L 四甲基乙二胺，2.5 mmol/L 核黄素）
中黑暗浸泡 20 min，最后在 pH 7.8 的 0.05 mol/L 磷
酸缓冲液（内含 0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸）中光照
20 min，在紫色背景下出现黄色条带。
CAT 染色采用铁氰化钾法[8]。用预冷蒸馏水冲
洗胶板后，加入适量 0.3%过氧化氢溶液，轻轻摇荡
凝胶板 10 min，倒出溶液，再用预冷蒸馏水冲洗，
然后加入含 2%三氯化铁-2%铁氰化钾（1∶7）的溶
液，10 min 后在墨绿色背景下出现亮黄色条带。
POD 染色采用醋酸-联苯胺法[9]。称取 0.1 g 联
苯胺，用 1 mL 的冰醋酸充分溶解，依次加入 5%乙
二胺四乙酸二钠 5 mL，5%氯化铵 5 mL，蒸馏水 160
mL，用前加入 0.3%过氧化氢 5 mL，30 ℃恒温下
出现深蓝色条带。
2 结果与分析
2.1 青枯菌诱导广藿香试管苗的致病过程
将广藿香试管苗伤根处理后接入添加了青枯菌
粗毒素的培养基中，进行致病性诱导试验。经过反
复试验，以终浓度为 5.0×108 cfu/mL 的青枯菌粗毒
素较为适宜，诱导的广藿香试管苗呈现渐进的发病
过程。从图 1 可以看到，未添加粗毒素的对照植株
生长正常，植株保持直立、叶片舒展、色泽深绿。
而在添加粗毒素的处理中，植株生长 2 d 后顶部叶
片开始收缩下垂，色泽稍变浅；生长 4 d 后更多叶
片失水萎垂，植株整体倾斜；7 d 后植株茎杆弯曲，
萎蔫发黄，最后凋零死亡，这与田间感染青枯病的
发病状况较为一致。
2.2 青枯菌诱导后广藿香防御相关酶同工酶分析
在建立的青枯菌诱导广藿香致病模式的基础
上，分别取经青枯菌诱导 1～7 d 的广藿香植株及
未经诱导的对照植株叶片，提取酶液，并采用聚
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A B C D
A-对照 B、C、D-在含青枯菌粗毒素培养基上分别生长了 2、4、7 d 的植株
A-CK B, C, and D-plants cultured in the medium supplemented with the crude toxins for 2, 4, and 7 d, respectively
图 1 青枯菌诱导的广藿香试管苗
Fig. 1 Test-tube plantlets of P. cablin induced by R. solanacearum
丙烯酰胺凝胶电泳的方法对 SOD、CAT、POD 同
工酶进行分析，以观察其同工酶谱带的变化情况。
2.2.1 SOD同工酶分析 图 2-A显示诱导后 1～7 d
的 SOD 同工酶谱带的变化情况。对照主要有迁移
率为 0.28、0.33 和 0.50 的 3 条谱带，诱导后的植
株，出现与对照共有的 3 条谱带，谱带色度和宽
度均呈先增后减的趋势，且在第 3 天时达到高峰。
此外，第 1、3 天分别出现 1 条新的谱带，迁移率
分别为 0.45、0.37，并一直持续至第 7 天。
2.2.2 CAT 同工酶分析 图 2-B 显示诱导后 1～7 d
的 CAT 同工酶谱带的变化情况。对照主要有迁移率
为 0.17、0.25 的 2 条谱带，诱导后的植株，与对照
共有的 2 条谱带变化较为复杂，从色度和宽度上看，
呈现两次先增后减，分别在第 2 天和第 4 天时达到
高峰。此外，第 3、5 天时分别出现迁移率为 0.47、
0.58 的新谱带，并一直持续至第 7 天，且在第 6 天
时强度达到最大。
2.2.3 POD同工酶分析 图 2-C 显示诱导后 1～7 d
的 POD 同工酶谱带的变化情况。对照出现迁移率
为 0.07、0.63 的 2 条谱带。诱导 1 d 后的植株出现
了 1 条迁移率为 0.56 的新谱带，第 3 天时强度有所
增加，随后逐渐减弱，并持续至第 6 天；诱导 4 d
后又出现了 1 条新谱带，迁移率为 0.39；第 7 天时
所有谱带消失。
3 讨论
青枯菌是一种毁灭性的土传性病原菌，寄主范
围广泛。该病原菌从寄主的根部，入侵木质部导管，
通过维管束系统迅速扩张到植物的地上部分。有
关青枯菌的致病机制，植物病害生理学研究表
明，青枯菌在导管中生长时可产生大量的胞外多
糖，从而影响和阻碍植物体内的水分运输引起植
株枯萎[10]；同时，青枯菌还可向细胞外分泌多种

1～7-诱导天数 Rf-相对迁移率
1—7-induction days Rf-relative mobility
图 2 SOD (A)、CAT (B)、POD (C) 同工酶电泳图 (左)及
其模式图(右)
Fig. 2 SOD (A), CAT (B), and POD (C) isozymes electro-
phoresis (left) and their diagram (right)
7 6 5 4 3 2 1 CK 7 6 5 4 3 2 1 CK Rf 值
7 6 5 4 3 2 1 CK 7 6 5 4 3 2 1 CK
7 6 5 4 3 2 1 CK 7 6 5 4 3 2 1 CK
强带 中带 弱带
0.28
0.33
0.37
0.45
0.50




0.17
0.25

0.47
0.58


0.07

0.39

0.56
0.63
A
B
C
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细胞壁降解酶（如果胶酶类和纤维素酶类），这
些细胞壁降解酶对破坏导管组织也起一定作用。
青枯菌培养后，经滤过获得的粗毒素含有大量的
胞外分泌物是常用的重要致病因子之一[11]。本研
究以青枯菌制备的粗毒素进行诱导试验，考察广
藿香体内防御相关酶同工酶的变化，以揭示广藿
香的抗性生理反应。
近年来研究表明，SOD、CAT、POD 在植物抗
病过程中起着重要作用。任爱霞等[12]研究表明 4 条
POD 同工酶酶带与棉花抗黄萎病有关，这些酶带
的特殊表现可用于棉花抗病性辅助育种。袁庆华等
[13]在苜蓿上的研究指出，大部分抗病株系的 POD
和 SOD 同工酶有新谱带出现，提示可能用作鉴定
苜蓿抗病的同工酶标记。朱友林等[14]研究表明 Rf
值为 0.25 的 SOD 同工酶酶带，与玉米抗病基因的
作用有关。本研究建立了在实验室条件下青枯菌诱
导广藿香致病的模式，考察了青枯菌诱导 7 d 内
SOD、CAT 和 POD 同工酶谱的动态变化，与对照
相比，均有新增谱带出现，同时在强度上也有所增
减，表明 SOD、CAT 和 POD 在广藿香抵抗青枯菌
入侵时可能起到较为重要的作用，为后续种质材料
的抗性鉴定及抗病育种提供依据，但 SOD、CAT 和
POD 同工酶的变化规律及其与广藿香抗性的关系
仍有待深入研究。
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