全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 12 期 2013 年 6 月

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• 药理与临床 •
木犀草苷对人食管鳞状癌 Eca109 细胞生长的抑制作用及其机制
王婷婷，王少康，黄桂玲，孙桂菊*
东南大学公共卫生学院，江苏 南京 210009
摘 要：目的 研究木犀草苷对人食管鳞状癌 Eca109 细胞生长的抑制作用及其机制。方法 Eca109 细胞经不同浓度木犀草
苷处理后，MTT 法检测 Eca109 细胞增殖；倒置显微镜观察 Eca109 细胞形态的变化；流式细胞术检测 Eca109 细胞周期变化
及细胞凋亡情况；RT-PCR 检测 Eca109 细胞 cyclin D1、survivin 和 c-myc 基因表达。结果 MTT 实验表明，木犀草苷 80、
120、160、200、240 μmol/L 对 Eca109 细胞均有抑制作用，且与浓度相关。木犀草苷可引起 Eca109 细胞形态改变、体积缩
小，并与周围细胞脱离，浓度为 240 μmol/L 时使细胞呈出芽状，有的细胞伸出多个伪足样突起；浓度为 160、240 μmol/L 时，
可将细胞阻滞于 G2/M 期，诱导细胞凋亡；浓度为 240 μmol/L 并处理 Eca109 细胞 48 h 后，使 Eca109 细胞 cyclin D1、survivin
和 c-myc 基因表达低于对照组（P＜0.05）。结论 木犀草苷对食管鳞状癌 Eca109 细胞的生长有显著抑制作用，其通过改变
细胞周期、诱导细胞凋亡及抑制相关基因的表达发挥抗肿瘤作用。
关键词：木犀草苷；食管鳞状癌细胞 Eca109；细胞生长；细胞周期；细胞凋亡；基因表达
中图分类号：R979.19 文献标志码：A 文章编号：0253 -2670(2013)12 - 1604 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.12.016
Inhibition of luteoloside on proliferation of human esophageal carcinoma cell line
Eca109 and its mechanism
WANG Ting-ting, WANG Shao-kang, HUANG Gui-ling, SUN Gui-ju
School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China
Abstract: Objective To investigate the inhibition of luteoloside on the proliferation of human esophageal carcinoma cell line Eca109
and its mechanism. Methods MTT assay was used for detecting the influence of luteoloside at different concentration on the
proliferation of Eca109. The morphological changes of cells were observed under inverted microscope. The cell cycle and apoptosis
were detected by flow cytometry. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of cyclin D1, survivin, and c-myc genes. Results
The results of MTT assay showed different doses (80, 120, 160, 200, and 240 μmol/L) of luteoloside could inhibit the cell proliferation
of Eca109 cells in a dose-response manner. Luteoloside could also change the morphological characteristics of cells, reduce the cell
size, and separate from peripheral cells. Treated with 240 μmol/L luteoloside, the cells were sprouting and some of them developed
multiple pseudopodia-like protrusions. Treated with luteoloside (160 and 240 μmol/L), the cell cycle of Eca109 cells was blocked in
G2/M phase and apoptosis was induced (P < 0.05). Compared with the control group, the gene expression of cyclin D1, survivin, and
c-myc was decreased after treated with 240 μmol/L luteoloside for 48 h (P < 0.05). Conclusion Luteoloside could significantly
inhibit the proliferation of Eca109 cells by changing the cell cycle and inducing the apoptosis. Moreover, it could decrease the mRNA
expression of relative genes.
Key words: luteoloside; esophageal cancer cell line Eca109; cell growth; cell cycle; cell apoptosis; gene expression

木犀草苷（luteoloside），又名木犀草素-7-O-葡
萄糖苷，属黄酮类化合物，主要存在于芹菜、青辣
椒、紫苏叶等植物中，在金银花、菊花、金雀花和
小苦苣菜中也有分布[1-6]，其在紫苏子、荷兰芹中以

收稿日期：2012-11-25
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金资助项目（30800914）；江苏省研究生科研创新计划（CXZZ_0179）；达能膳食营养研究与宣教基
金（DIC2011-05）
作者简介：王婷婷（1986—），女，硕士研究生，研究方向为营养与肿瘤。E-mail: danyangwtt@gmail.com
*通信作者 孙桂菊 E-mail: gjsun@seu.edu.cn
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木犀草素的形式存在。木犀草苷是重要的生物活性
物质，具有抗氧化、消炎和抗病毒等多种活性[7-9]；
还具有抗肿瘤作用，可抑制人胃癌 BGC-823 细胞增
殖[10]，将肺癌 A549 细胞阻滞于 G2 期或诱导其凋
亡 [11]。本实验研究木犀草苷体外对人食管鳞状癌
Eca109 细胞增殖的抑制作用，并从细胞周期、细胞
凋亡及相关基因表达的变化初步探讨其作用机制，
为研发新一代的预防食管癌药物提供实验依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
木犀草苷（批号 MUST-12041703），质量分数≥
98%，5-氟尿嘧啶（5-Fu，批号 F20121224），南京
奥多福尼生物公司；RPMI-1640 培养基、胎牛血清、
Trizol，Gibco 公司；含 0.25% EDTA 的胰蛋白酶、
二甲基亚砜（DMSO）、Annexin V-FITC/PI 双染细
胞凋亡试剂盒、细胞周期检测试剂盒，南京凯基生
物科技发展有限公司；第一链 cDNA 合成试剂盒、
即用 PCR 扩增试剂盒、引物，上海生工生物工程技
术服务有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），Sigma
公司；磷酸盐缓冲液（PBS），武汉博士德生物工程
有限公司。
1.2 细胞
人食管鳞状癌 Eca109 细胞，中国科学院上海细
胞库提供。
1.3 仪器
RT—600 酶标仪，Rayto 公司；IX51 倒置显微镜，
日本 Olympus 公司；DSC—HX1 数码相机，日本 Sony
公司；MCO—15AC 型 CO2培养箱，日本 Sanyo 公司。
2 方法
2.1 细胞培养
Eca109 细胞株置于含 10%胎牛血清、80 U/mL
青霉素和 0.08 mg/mL 链霉素的 RPMI 1640 培养基
中，于 37 ℃、饱和湿度、5% CO2 的培养箱中培养，
2～3 d 传代 1 次，取对数期细胞进行实验。
2.2 MTT 法检测细胞增殖和细胞形态观察
取对数生长期 Eca109 细胞，经胰酶消化后调整
密度为 5×104/mL，每孔 150 μL 接种于 96 孔板，培
养 24 h 后弃去培养液，设立空白对照组、阴性对照
组、5-Fu（240 μmol/L）阳性对照组和不同浓度木
犀草苷（20、40、80、120、160、200、240 μmol/L）
组，每组 5 个复孔，各给药组细胞给予相应药物后
（空白对照和阴性对照组给予培养液）置于 37 ℃、
5% CO2 条件下分别培养 24、48、72 h，培养结束后
每孔轻轻弃去上清液，用 PBS 洗 1 遍，每孔加入 5
mg/mL MTT 20 μL 继续培养 4 h，吸去液体，每孔
加入 DMSO 150 μL，振荡 10 min，用全自动酶标仪
检测 490 nm 处吸光度（A）值，计算细胞生长抑制
率。实验重复 3 次。
细胞生长抑制率＝(A 对照－A 实验) / A 对照
根据 MTT 实验结果，选取木犀草苷低（80
μmol/L）、中（160 μmol/L）、高（240 μmol/L）3 个
浓度进行后续实验。
按相同密度将 Eca109 细胞接种于 6 孔板中，待
24 h 细胞贴壁后分别用含 0、80、160、240 μmol/L
木犀草苷的培养液作用 48 h，倒置显微镜下观察（×
100）细胞形态，数码相机采集图像。
2.3 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡
取对数生长期细胞，用含 0、80、160、240 μmol/L
木犀草苷的培养液作用 48 h，胰酶消化，收集 1×
106 个细胞，用预冷的 PBS 洗 1 次，2 000 r/min 离
心 5 min，加入 70%乙醇 4 ℃固定过夜，离心弃乙
醇，加 100 μL RNase A 在 37 ℃下水浴 30 min，加
400 μL PI 染色混匀，4 ℃避光 30 min，上机检测。
记录激发波长 488 nm 处红色荧光，检测细胞周期。
取对数生长期细胞，用含 0、80、160、240 μmol/L
木犀草苷的培养液作用 48 h，用不含 EDTA 的胰酶
消化悬浮细胞，2 000 r/min 离心 5 min，用 PBS 洗
涤细胞 2 次，收集 5×105 个细胞，加入 Binding 缓
冲液 500 μL 悬浮细胞，加入 Annexin V-FITC 5 μL
混匀后再加入 PI 5 μL 染色，混匀，室温避光、反
应 10 min，在 1 h 内用流式细胞仪观察和检测细胞
凋亡情况。
2.4 RT-PCR 法检测 Eca109 细胞相关基因表达
2.4.1 Eca109细胞总RNA的提取 将Eca109细胞
以 5×104/孔接种于 6 孔板，于 37 ℃、5% CO2培
养箱内培养 24 h，弃尽培养液，分别加入含有 0、
80、160、240 μmol/L 木犀草苷的培养基，相同条件
下培养 48 h 后裂解细胞。Trizol 法提取总 RNA，按
照RT-PCR试剂盒说明书进行 cDNA第一链的合成。
2.4.2 RT-PCR 检测 以反转录产物为模板，引物
序列见表 1。RT-PCR 反应体系 25 μL：上游引物 1
μL，下游引物 1 μL，模板（反转录产物）1 μL，ddH2O
22 μL。循环参数：cyclin D1，94 ℃、4 min，94 ℃、
30 s，53 ℃、45 s，72 ℃、30 s，35 个循环；72 ℃、
10 min；survivin，94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，58 ℃、
30 s，72 ℃、30 s，35 个循环，72 ℃、10 min；c-myc，
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表 1 基因引物序列及片段
Table 1 Primer sequence and fragments of genes
基因 引物序列 片段长度 / bp
cyclin D1 正向：5’-CTTCAAATGTGTGCAGAAGAG-3’ 374
反向：5’-GCATTTTGGAGAGGAAGTGTTC-3’
survivin 正向：5’-GGACCACCGCATCTCTACAT-3’ 344
反向：5’-TCTCCGCAGTTTCCTCAAAT-3’
c-myc 正向：5’-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3’ 113
反向：5’-AGTTGTGCTGATGTGTGGAGA-3’
β-actin 正向：5’-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3’ 202
反向：5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’

94 ℃、4 min，94℃、30 s，56 ℃、45 s，72 ℃、
30 s，32 个循环，72 ℃、10 min。PCR 产物采用
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果，用 Quantity
One 软件对电泳结果进行灰度值分析，通过灰度值
统计学分析结果间接推测各处理组相关基因的表
达水平。
2.5 统计学分析
采用 SPSS 19.0 统计分析软件进行单因素方差
分析，各组数据均以 ±x s 表示，组间比较采用
Dunnett-t 检验。
3 结果
3.1 对 Eca109 细胞增殖和细胞形态的影响
木犀草苷在低浓度（20、40 μmol/L）时轻微促
进 Eca109 细胞生长，但随药物浓度的升高，对
Eca109 细胞的抑制作用逐渐增强，超过 80 μmol/L
时，随药物干预时间的延长，对细胞的抑制率也提
高。木犀草苷浓度为 240 μmol/L 且干预 Eca109 细
胞 48 h 后，细胞增殖抑制率超过 50%，但仍弱于
5-Fu 组。结果见表 2。
在高倍显微镜下观察，可见对照组 Eca109 细胞
生长呈“铺路石”样，细胞呈饱满的梭形或多角形，
细胞边界清晰，细胞膜完整。与对照组相比，木犀
草苷 80 μmol/L 处理 Eca109 细胞后，细胞略皱缩，
与周围的细胞略脱离，形态不规则，内部结构不清
楚，随着木犀草苷浓度的升高，细胞形态变化特征
也愈加明显，至 240 μmol/L 时，细胞呈现芽状，有
的细胞伸出多个伪足样突起。结果见图 1。
3.2 对 Eca109 细胞周期的影响
木犀草苷可引起 Eca109 细胞周期的改变，浓度
为 160、240 μmol/L 时，将细胞周期阻滞于 G2/M 期，
与对照组相比差异显著（P＜0.05）。结果见图 2、
表 3。
表 2 木犀草苷对 Eca109 细胞增殖的影响 ( 3=± n , sx )
Table 2 Effect of luteoloside on cell proliferation of Eca109 cells ( 3=± n , sx )
抑制率 / % 组 别 C / (μmol·L−1)
24 h 48 h 72 h
对照 － － － －
木犀草苷 20 −7.59±3.65 −5.40±3.30 −8.40±3.99
40 −5.18±1.06 −2.17±3.10 −6.20±3.78
80 9.91±5.56* 9.33±4.80* 10.79±4.10*
120 21.51±3.75* 23.58±5.69* 26.48±3.40*
160 28.65±5.63* 32.82±4.67* 37.10±3.57*
200 36.05±3.43* 38.85±1.88* 43.56±3.48*
240 46.09±4.10* 54.09±3.74* 56.42±3.42*
5-Fu 240 53.24±3.16* 84.29±0.88* 84.30±2.74*
与对照组比较：*P＜0.05，下表同
*P < 0.05 vs control group, same as below
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图 1 各组 Eca109 细胞形态观察
Fig. 1 Morphological observation of Eca109 cells in each group

图 2 木犀草苷对 Eca109 细胞周期的影响
Fig. 2 Effect of luteoloside on cell cycle of Eca109 cells
表 3 木犀草苷对 Eca109 细胞周期的影响 ( ± = 3x s n, )
Table 3 Effect of luteoloside on cell cycle of Eca109 cells ( ± = 3x s n, )
细胞分布 / % 组 别 C / (μmol·L−1)
G0 / G1期 S 期 G2 / M 期
对照 － 65.95±2.85 26.31±5.13 7.75±2.28
木犀草苷 80 64.72±1.38 21.83±1.57 13.46±2.95
160 61.32±3.67 23.71±2.57 14.98±1.10*
240 59.05±0.43 22.53±1.22 18.43±0.79*

3.3 对 Eca109 细胞凋亡的影响
用木犀草苷 80、160、240 μmol/L 处理 Eca109
细胞 48 h 后，Eca109 细胞凋亡率均高于对照组，
且呈浓度相关性，其中木犀草苷 160、240 μmol/L
组 Eca109 细胞的凋亡率与对照组相比差异显著
（P＜0.05），提示木犀草苷能够促进 Eca109 细胞
凋亡。流式细胞图见图 3，各组 Eca109 细胞凋亡
率见图 4。
3.4 对 Eca109 细胞相关基因表达的影响
与对照组相比，木犀草苷 240 μmol/L 可使
Eca109 细胞 cyclin D1、survivin、c-myc 基因表达
下调（P＜0.05 ）。结果见图 5 和表 4。
4 讨论
我国食管癌患者以鳞状细胞癌为主，因此本研究
选用人食管鳞状癌 Eca109 细胞进行体外实验。MTT
法检测显示，木犀草苷在低剂量时可促进 Eca109

对照 木犀草苷 80 μmol·L−1 木犀草苷 160 μmol·L−1 木犀草苷 240 μmol·L−1



1 200
1 000
800
600
400
200
0
1 200
1 000
800
600
400
200
0
1 200
1 000
800
600
400
200
0
1 000
800
600
400
200
0
二倍体 Q1 二倍体 Q2
二倍体 S

0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150
0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150
TL2-A
细
胞
数

细
胞
数

细
胞
数

细
胞
数

对照 木犀草苷 80 μmol·L
−1
木犀草苷 160 μmol·L−1 木犀草苷 240 μmol·L−1
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图 3 木犀草苷对 Eca109 细胞凋亡的影响
Fig. 3 Effect of luteoloside on apoptosis of Eca109 cells

与对照组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs control group
图 4 木犀草苷对 Eca109 细胞凋亡率的影响
Fig. 4 Effect of luteoloside on Eca109 apoptosis rate
细胞生长，但随着药物浓度的升高抑制作用逐渐增
强。肿瘤发生的主要分子机制是细胞周期紊乱导致
细胞无限增殖和细胞凋亡受到抑制[12]。本实验流式
细胞术检测结果表明，木犀草苷可将 Eca109 细胞阻
滞在 G2/M 期。cyclin D1 是重要的细胞周期调控因
子之一，在食管癌中过度表达较为常见，其不但与
食管癌的发生、发展相关，还与肿瘤的转移、预后
及放疗后肿瘤复发密切相关[13]。survivin 是凋亡抑
制蛋白家族的成员之一，具有抑制细胞凋亡和调节
细胞增殖的双重作用，其表达具有细胞周期依赖性，
在细胞周期的 G2/M 期选择性地表达，在食管癌中
的表达高于正常组织[14-15]。c-myc 基因是 myc 基因

1-对照 2-木犀草苷 80 μmol·L−1 3-木犀草苷 160 μmol·L−1 4-木
犀草苷 240 μmol·L−1
Marker 自上而下依次为 100、200、300、400、500、600 bp
1-control 2-80 μmol·L−1 luteoloside 3-160 μmol·L−1 4-240
μmol·L−1 luteoloside
Marker-top-down followed by 100, 200, 300, 400, 500, and 600 bp
图 5 木犀草苷对 Eca109 细胞 cyclin D1、survivin 和 c-myc
基因 mRNA 表达的影响
Fig. 5 Effect of luteoloside on mRNA expression of cyclin
D1, survivin, and c-myc in Eca109 cells
表 4 木犀草苷对 Eca109 细胞 cyclin D1、survivin 和 c-myc 基因表达的影响 ( ± = 3x s n, )
Table 4 Effect of luteoloside on gene expression of cyclin D1, survivin, and c-myc in Eca109 cells ( ± = 3x s n, )
组 别 C / (μmol·L−1) cyclin D1 / β-actin survivin / β-actin c-myc / β-actin
对照 － 0.98±0.21 0.66±0.10 0.98±0.11
木犀草苷 80 0.79±0.12 0.65±0.09 1.01±0.09
160 0.69±0.19 0.51±0.11 0.86±0.17
240 0.32±0.05* 0.40±0.04* 0.44±0.16*


1 2 3 4 M 1 2 3 4
β-actin
cyclin D1

β-actin
survivin
c-myc
β-actin
202 bp
374 bp
202 bp
344 bp
113 bp
202 bp


104
103
102
101
100
104
103
102
101
100
104
103
102
101
100
104
103
102
101
100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
FITC Annexin V
PI

PI

PI

PI

对照 木犀草苷 80 μmol·L−1 木犀草苷 160 μmol·L−1 木犀草苷 240 μmol·L−1

35
30
25
20
15
10
5
0
细
胞
凋
亡
率
/
%

对照 80 160 240
木犀草苷 / (μmol·L−1)
*
*
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家族的重要成员之一，其高表达可刺激细胞增殖、
分化，向恶性肿瘤细胞转化。另外，c-myc 基因与
肿瘤细胞凋亡及侵袭和迁移有关联[16]。本实验发
现，木犀草苷浓度为 240 μmol/L 时可下调 Eca109
细胞 cyclin D1、survivin 和 c-myc 基因表达，对食
管癌的发生、发展有一定抑制作用。
综上所述，木犀草苷能抑制 Eca109 细胞的生
长，可将细胞周期阻滞于 G2/M 期并诱导细胞凋亡，
下调 Eca109 细胞 cyclin D1、survivin 和 c-myc 基因
表达。但木犀草苷抑制食管癌细胞生长的分子信号
途径还需要深入探讨。
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