全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 2013 年 9 月

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娑罗子基原物种的 DNA 条形码鉴定研究
石召华 1, 2，陈士林 3，姚 辉 4，叶利春 2，宋经元 4，关小羽 1，刘享平 1*
1. 武汉爱民制药有限公司，湖北 鄂州 436070
2. 湖北省天然组分药物工程技术研究中心，湖北 鄂州 436070
3. 中国中医科学院 中药研究所，北京 100700
4. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193
摘 要：目的 筛选出适用于鉴定七叶树属药用植物的条形码序列。方法 考察了七叶树属 10 个物种 42 份样品的核 ITS、
ITS2与叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列的PCR扩增和测序效率、种内及种间变异、鉴定效率，对初筛后的序列进行barcoding
gap 检验及 NJ 树聚类分析。结果 psbA-trnH 序列的 PCR 扩增和测序效率均为 100%，种间最小变异大于其种内最大变异，
且鉴定效率为候选序列中最高，barcoding gap 检验结果表明该序列在种间、种内变异重合比例较小，且 NJ 树聚类分析结果
也表明 psbA-trnH 序列能够提供充分的辨析效果。结论 psbA-trnH 序列能准确鉴定七叶树属药用植物，可作为七叶树属药
用植物条形码序列。
关键词：七叶树属；DNA 条形码；物种鉴定；psbA-trnH；rbcL；matK
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)18 - 2593 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.18.021
DNA barcode identification of original species in Aesculus Linn.
SHI Zhao-hua1, 2, CHEN Shi-lin3, YAO Hui4, YE Li-chun2, SONG Jing-yuan4, GUAN Xiao-yu1,
LIU Xiang-ping1
1. Wuhan Aimin Pharmaceutical Co., Ltd., Ezhou 436070, China
2. Hubei Engineering Technology Centre of Natural Component Medicine, Ezhou 436070, China
3. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
4. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development,
Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
Abstract: Objective To screen the DNA barcodes for identifying the species in genus Aesculus Linn. Methods The PCR amplification
and sequencing efficacy, intraspecific and interspecific variation, and identification efficiency of nuclear ITS, ITS2, chlroplast psbA-trnH,
rbcL, and matK sequences from 42 samples of 10 species in genus Aesculus Linn. were investigated. The screened sequences were
determined by barcoding gap and NJ tree clustering analysis. Results The PCR amplification and sequencing efficacy of psbA-trnH
were 100%, the interspecific minimum variation was larger than the intraspecific maximum variation, and psbA-trnH had the highest
identification efficacy. The psbA-trnH sequence had less polymerization of intraspecific and interspecific variation. By constructing the
NJ tree, thorough verifying the three original plants could be used to separate with other related species. Conclusion The psbA-trnH
sequence is a powerful, though not perfect, barcode for the identification of species in Aesculus Linn.
Key words: Aesculus Linn.; DNA barcode; species identification; psbA-trnH; rbcL; matK

七叶树属 Aesculus Linn. 为无患子目七叶树科
（Hippocastanaceae）落叶乔木，主要分布在亚洲、欧
洲、美洲，约有 30 余种[1]。我国有 10 余种，主要分
布于湖北、云南、四川、陕西、浙江、广西、甘肃
等地，大部分为野生，有极少数地区形成产业化。
该属植物在产地民间多作理气药使用，其中中华七
叶树 Aesculus chinensis Bunge、浙江七叶树 Aesculus
chinensis Bunge var. chekiangensis (Hu et Fang) Fang

收稿日期：2013-03-07
基金项目：湖北省重大科技攻关项目（2012BCA02）
作者简介：石召华（1978—），男，高级工程师，研究方向为中药资源和质量研究。Tel/Fax: (0711)3818216 E-mail: whimyf@163.com
*通信作者 刘享平 Tel/Fax: (0711)3818208 E-mail: lxp821@sina.com
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和天师栗 Aesculus wilsonii Rehd 的干燥成熟种子是
《中国药典》2010 年版收载的常用中药材娑罗子，
具有疏肝、理气、和胃、止痛、杀虫之功效[2]。现代
药理研究表明，娑罗子在抗肿瘤、抗脑水肿、治疗高
血压脑、出血、冠心病、美尼尔氏病、老年支气管哮
喘、面神经炎等方面具有确切疗效[3]。因市场需求量
逐年提高，医药公司的采购量也日益增大，对娑罗子
基原植物的野生资源破坏严重，其产量呈下滑趋势，
且野生产量不稳定，有大小年之分，不能够满足市场
需求，娑罗子的采购价格一再攀升。为防止商品药材
出现品种混杂、品质不一的问题，寻找一种快速稳定
的鉴别方法势在必行。现有的七叶树属植物鉴别方法
主要有形态学及高效液相色谱法等，为娑罗子的甄别
筛选及药材品质控制提供了重要依据，但其操作需要
丰富的鉴定经验及复杂的实验条件。近年新兴的DNA
条形码技术能够通过 DNA 序列对物种进行快速、准
确的鉴别，为中药材的鉴定提供了一种新的方法[4]。
DNA 条形码（DNA barcoding）由加拿大动物学家
Hebert 等[5]首次提出，即通过一段标准DNA 片段，对
物种进行快速、准确地鉴定，是近年来发展最迅速的
学科之一。2009 年 8 月，CBOL（Consortium for the
Barcode of Life）植物工作组推荐 rbcL＋matK 组合作为
陆生植物的 DNA 通用条形码，在同年 11 月被第三届
国际生命条形码大会确定为核心条形码。由于该组合
条形码还存在研究样本量偏小和物种分辨率低等问
题，大会建议 psbA-trnH 和 ITS 作为辅助条形码[6]。陈
士林等[7]研究了753属4 800物种的6 600份植物样本，
检测了 psbA-trnH、matK、rbcL、rpoC1、ycf5、ITS2
和 ITS 等植物候选条形码，发现 ITS2 的鉴定成功率在
物种水平达到 92.7%，而众多学者推荐的 psbA-trnH 序
列在扩增成功率和物种鉴定成功率方面也有着优良的
表现[8-9]。近年来，ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK、
rbcL＋matK 这几个候选序列或序列组合由于通用性较
好，扩增成功率、有效序列获得率和物种鉴定成功率
较高，是植物条形码研究中重点推荐的候选序列[10]。
本研究选取 ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK
这5个热点候选序列针对七叶树科七叶树属10个物
种 42 个样本进行比较研究，验证各候选序列对该属
植物的鉴定能力，为 DNA 条形码技术应用于娑罗
子药材基原物种的鉴定研究提供理论依据。
1 材料
10 个物种 42 份样本采自云南、四川、陕西、湖
北、浙江和北京的各个分布区域，采集新鲜嫩叶硅
胶快速干燥保存，并对所选样品进行凭证标本、数
字影像的采集，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定，
凭证标本和数字影像信息保存于武汉爱民制药有限
公司研发中心药材 GAP 技术部，样本信息见表 1。
2 方法
2.1 研究思路设计
分别选取七叶树属植物除大叶七叶树和欧洲七
叶树外的 8 个不同物种的 16 份样品提取 DNA，然
后用表 2 中的 5 对引物进行 PCR 扩增、测序。针对
测序结果分析，筛选最佳条形码，最后利用初步筛
选出来的最佳条形码对全部样品进行鉴定分析。
2.2 DNA 的提取
材料均为硅胶干燥叶片，取样约 40 mg，用DNA
提取研磨仪（Retsch MM40，德国）研磨 2 min（30
次/s）后，利用植物 DNA 提取试剂盒（Tiangen
Biotech Co.，中国）提取总 DNA。
2.3 PCR 扩增及测序
实验所需引物的序列、PCR 扩增反应程序参照
文献方法[7,11-12]设计，见表 2。在 25 μL 反应体系中
包含有 2 μL 模板 DNA（60 ng），正反向引物（2.5
μmol/L）各 1 μL，0.2 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），
2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），2.5 μL 10×缓冲液，2 μL
MgCl2（25 mmol/L），2 μL 染料（Dye），12.3 μL
ddH2O。
PCR 反应在热循环仪（Applied Biosystems Co.，
美国）上进行，扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳
检测，EB 染色后，凝胶成像系统（Bio-Rad）紫外
成像观察，并记录结果。
PCR 扩增产物直接送测序，测序由上海美吉生
物医药科技有限公司完成，使用 ABI 3730XL 测序
仪（Applied Biosystems Co.，美国）进行双向测序。
2.4 数据处理方法
测 序 峰 图 利 用 CodonCode Aligner V 3.0
（CodonCode Co.，美国）校对拼接，去除低质量序
列及引物区，获得严格一致性（consensus）序列。
对于从 GenBank 上获得的 ITS 序列，使用基于隐马
尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S
区段，获得 ITS2 间隔区序列全长[11]。利用 Song 等[12]
方法，将所有序列用软件 MEGA （ Molecular
Evolutionary Genetics Analysis）5.0 分析比对并基于
K-2-P 双参数模型进行遗传距离计算。最后采用 Ross
等[13]报道的相似性搜索算法（BLAST 1）和最近距
离法（nearest distance）计算各序列的鉴定成功率。
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表 1 用于筛选候选条形码的样品
Table 1 Samples for screening potential barcodes
编号 基原植物 采集地 GenBank 号
1 天师栗 A. wilsonii 四川峨眉山 KC480179
2 天师栗 四川峨眉山 KC480180
3 天师栗 四川峨眉山 KC510147
4 天师栗 四川峨眉山 KC510148
5 天师栗 四川峨眉山 KC510149
6 天师栗 湖北鹤峰县 KC480181
7 天师栗 湖北宣恩县 KC510150
8 天师栗 湖北宣恩县 KC510151
9 天师栗 湖北宣恩县 KC510152
10 天师栗 湖北恩施市 KC510153
11 中华七叶树 A. chinensis var. chinensis 陕西留坝县 KC480182
12 中华七叶树 陕西留坝县 KC510154
13 中华七叶树 陕西留坝县 KC510155
14 中华七叶树 陕西留坝县 KC510156
15 中华七叶树 陕西留坝县 KC510157
16 浙江七叶树A. chinensis var. chekiangensis 浙江杭州市 KC480183
17 浙江七叶树 浙江杭州市 KC510158
18 浙江七叶树 浙江杭州市 KC510159
19 浙江七叶树 浙江杭州市 KC510160
20 浙江七叶树 浙江杭州市 KC510161
21 浙江七叶树 浙江杭州市 KC510162
22 云南七叶树 A. wangii var. wangii 云南马关县 KC480184
23 云南七叶树 云南马关县 KC510163
24 云南七叶树 云南马关县 KC510164
25 云南七叶树 云南马关县 KC510165
26 云南七叶树 云南马关县 KC510166
27 云南七叶树 云南马关县 KC510167
28 云南七叶树 云南马关县 KC510168
29 云南七叶树 云南马关县 KC480185
30 多脉七叶树 A. polyneura 云南马关县 KC510169
31 多脉七叶树 云南马关县 KC510170
32 多脉七叶树 云南马关县 KC510171
33 长柄七叶树 A. assamica 云南马关县 KC510172
34 长柄七叶树 云南马关县 KC510173
35 大果七叶树 A. chuniana 云南马关县 KC510174
36 大果七叶树 云南西畴县 KC510175
37 大果七叶树 云南马关县 KC510176
38 大叶七叶树 A. megaphylla 云南西畴县 KC510177
39 石生七叶树 A. wangii var. rupicola 云南西畴县 KC510178
40 石生七叶树 云南马关县 KC510179
41 石生七叶树 云南马关县 KC510180
42 欧洲七叶树 A. hippocastanum 北京潭柘寺 KC510181
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表 2 引物及其扩增程序
Table 2 Primers and amplification procedure
条形码 引物名称 引物序列 (5’-3’) PCR 反应程序 平均目的片段大小
5F GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG ITS
4R TCCTCCGCTTATTGATATGC
94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，50 ℃，
1 min，72 ℃，1.5 min /循环，30
个循环；72 ℃，7 min
707 （571～1 153） bp
S2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ITS2
S3R GACGCTTCTCCAGACTACAAT
94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，
30 s，72 ℃，45 s，40 个循环；
72 ℃，10 min
226 （163～311） bp
1f ATGTCACCACAAACAGAAAC rbcL
724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC
95 ℃，2 min；94 ℃，1 min，55 ℃，
30 s，72 ℃，1 min，35 个循环；
72 ℃，10 min
704 （702～883） bp
fwd PA GTTATGCATGAACGTAATGCTC psbA-trnH
rev TH CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，55 ℃，
1 min，72 ℃，1.5 min，30 个循
环；72 ℃，7 min
401（103～1 025）bp
KIM 3F CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG matK
KIM 1R ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC
94 ℃，1 min；94 ℃，30 s，52 ℃，
20 s，72 ℃，50 s，35 个循环；
72 ℃，5 min
794（656～861）bp

3 结果与分析
3.1 序列信息、PCR 扩增效率和测序成功率
ITS 引物 PCR 扩增后电泳检测，发现全部泳道
都出现了大小极其接近的 2 条带，测序时出现严重
的套峰现象，获得的序列无法完成拼接，所以统计
序列信息时未列入表中。
除 matK 的扩增效率为 81.25%，测序成功率
为 92.3%外，其余 3 条片段的 PCR 扩增效率和测
序成功率均较高，均为 100%。片段长度方面，ITS2
的长度最短，均为 221 bp，其次是 psbA-trnH，为
430～492 bp，rbcL 和 matK 较长，分别为 703 bp
和 790～837 bp。各片段的 GC 量以 psbA-trnH 最
低，为 27.8%，ITS2 最高，为 72.3%。psbA-trnH
变异位点最多，有 17 个，matK 和 ITS2 分别有 8
和 6 个，而 rbcL 的变异位点最少，只有 2 个。
psbA-trnH 有 3 个插入/缺失，片段大小分别为 2、
11、7 bp，其他条形码均无插入/缺失。各片段统
计详见表 3。
表 3 各候选条形码 PCR 扩增相关信息统计
Table 3 PCR amplification related information statistics of candidate codes
条形码 片段长度 / bp GC 量 / % PCR 扩增效率 / % 测序成功率 / % 变异位点数 插入/缺失 / bp
ITS2 221 72.3 100 100 6 0
matK 790～837 34.0 81.25 92.3 8 0
rbcL 703 43.0 100 100 2 0
psbA-trnH 430～492 27.8 100 100 17 2、11、7

3.2 不同 DNA 条形码候选序列种内种间差异分析
理想的条形码序列其种间差异与种内差异应存
在显著区别，且种间差异应明显大于种内差异。引
入种间差异、种内差异等 6 个指标以量化分析各候
选序列对实验样本的整体差异水平[7]，通过对七叶
树属各条形码候选序列的种内变异、种间变异、种
间最小变异和种内最大变异分析，结果表明
psbA-trnH 序列的种间差异最大，rbcL 序列最小，
种内差异的情况同样是 psbA-trnH 序列差异最大，
rbcL 序列最小。psbA-trnH 序列的种间最小变异大
于其种内最大变异。其余 3 条候选序列的种间最小
变异与种内最大变异间差异不明显，见表 4。
3.3 候选序列的鉴定效率评价
鉴定效率是评价不同条形码优劣的标准之
一。采用 BLAST1 和最小距离法 2 种方法评估
各候选序列的鉴定效率，结果表明（图 1），在物
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表 4 4 个条形码种间种内差异
Table 4 Intraspecific and interspecific differences of four barcodes
候选序列 种间变异 平均种间变异 最小种间变异 种内变异 平均种内变异 种内最大变异
ITS2 0.005 0±0.001 5 0.005 0±0.006 9 0.001 2±0.002 3 0.002 1±0.006 0 0.006 5±0.011 1 0.006 9±0.011 0
matK 0.003 5±0.002 3 0.003 5±0.006 2 0.000 8±0.001 3 0.002 5±0.002 3 0.002 2±0.001 3 0.002 9±0.002 0
rbcL 0.000 6±0.001 2 0.000 6±0.001 2 0.000 3±0.002 2 0.001 2±0.001 5 0.000 4±0.000 9 0.000 7±0.001 5
psbA-trnH 0.010 4±0.005 9 0.010 4±0.011 7 0.009 1±0.002 3 0.006 9±0.005 9 0.003 1±0.004 5 0.004 6±0.006 7


图 1 BLAST1 和最小距离法分析各序列的鉴定效率
Fig. 1 Identification efficiency of each sequence by BLAST1 and nearest distance methods
种水平上通过 BLAST1 分析，psbA-trnH 的鉴定效
率最高，为 95.4%，其次是 ITS2 序列，为 76.1%。
matK 和 rbcL 序列均不足 50%。通过最小距离法也
得到同样的结论，但各序列的鉴定成功率均较
BLAST1 低。各序列错误鉴定率均为 0。
3.4 七叶树属药用植物 psbA-trnH序列分析检验及
NJ 树聚类分析
通过对候选序列 ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、
matK 进行 PCR 扩增效率、测序成功率、种内种间
差异分析以及鉴定效率评价，筛选出 psbA-trnH 序
列为鉴定七叶树属药用植物的最佳条形码。
3.4.1 psbA-trnH 序列信息及变异分析 七叶树属
植物 psbA-trnH 序列长度为 373～454 bp。经 MEGA
5.0 软件分析，其中碱基组成平均量 T 为 43.9%，C
为 10.8%，A 为 32.4%，G 为 12.8%，GC 为 23.7%，
AT 为 76.3%，GC 量明显低于 AT 量。变异位点 36
个，简约信息位点 31 个，分别占序列总长的 9.65%
和 8.31%。共有 6 处插入/缺失，分别位于第 90～92、
151～157、253～296、341～364、414～415 和 472～
473 位，最大长 44 bp，最小长 2 bp。
3.4.2 七叶树属植物 psbA-trnH 序列 barcoding gap
检验 理想的条形码应具备种间遗传变异明显大于
种内遗传变异的特点，并且能够在两者间存在显著
差异，形成一个明显的间隔区，即 barcoding gap[14]。
七叶树属植物的 psbA-trnH 序列 barcoding gap（图
2）显示，该序列在种间、种内的变异重合比例较
小，且种间和种内变异的分布呈两边分开的趋势，
有利于区分物种，可作为七叶树属植物的 DNA 条
形码。
图 2 psbA-trnH 序列 barcoding gap 检验图
Fig. 2 Barcoding gap test diagram of psbA-trnH
3.4.3 NJ 树聚类分析 通过构建 NJ 树对条形码候
选序列 psbA-trnH 鉴定七叶树属植物的适用性进行
了进一步的考察。从聚类分析结果（图 3）可知，
psbA-trnH 序列具有鉴定七叶树属药用植物及其混伪
品的作用，并且也可用于鉴定七叶树属的不同品种。
4 讨论
4.1 七叶树属药用植物候选序列的筛选
DNA 条形码是通过合适的条形码获得高质量
的序列，使被鉴定样品具有较小的种内变异及显著
70
60
50
40
30
20
10
0
种
内
种
间
变
异
分
布
/
%

K2P 遗传距离
0 0.002 0.006 0.010 0.014 0.018
种内变异
种间变异

80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
60
50
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30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
100
80
60
40
20
0
比
率
/
%

比
率
/
%

比
率
/
%

比
率
/
%

鉴定成功率 模糊鉴定率 鉴定错误率 鉴定成功率 模糊鉴定率 鉴定错误率 鉴定成功率 模糊鉴定率 鉴定错误率 鉴定成功率 模糊鉴定率 鉴定错误率
BLAST1
最小距离
ITS2 matK rbcL psbA-trnH
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图 3 psbA-trnH 序列构建的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree constructed
with psbA-trnH sequences
的种间变异[6]。本研究选取 ITS、ITS2、psbA-trnH、
rbcL、matK 序列进行七叶树属药用植物的条形码筛
选，对各序列分析后发现，psbA-trnH 序列更适用于
七叶树属的鉴定分析，其扩增效率与测序成功率均
为 100%，并且物种鉴定效率最高，为 95.4%。ITS2、
rbcL序列的扩增效率及测序成功率虽然也为100%，
但物种鉴定效率分别为 76.1%和 31.4%，明显低于
psbA-trnH 序列。matK 序列的序列获得率及物种鉴
定效率均较差，其中物种鉴定效率仅为 41.5%。ITS
则因扩增产物测序时出现严重套峰，无法获得序列
信息。分析比较 psbA-trnH、ITS2、rbcL 和 matK 序
列的种间、种内差异，结果表明 psbA-trnH 序列的
种间差异最大，虽然其种内差异也是最大，但其种
间最小变异大于种内最大变异，在区分物种上具有
优势。ITS2、rbcL 和 matK 序列的种间最小变异与
种内最大变异间差异并不明显，不利于物种的区分
鉴定。
4.2 psbA-trnH 序列在七叶树属药用植物鉴定中的
作用
psbA-trnH 序列是叶绿体间隔区进化速率最快
的片段之一，且其两端存在约 75 bp 的保守区域，
可用于设计通用引物[15]，由 Kress 等[9]推荐作为条
形码候选序列。本研究筛选得到的 psbA-trnH 序列
能够成功鉴定包括天师栗、中华七叶树、浙江七叶
树、欧洲七叶树、云南七叶树、大果七叶树、多脉
七叶树、大叶七叶树、长柄七叶树、石生七叶树在
内的七叶树属药用植物。利用 psbA-trnH 序列计算
得到 K-2P 遗传距离，天师栗和混伪品多脉七叶树
的种间 K-2P 距离最大，大果七叶树和大叶七叶树
的种间 K-2P 距离最小；3 个基原物种天师栗、中华
七叶树、浙江七叶树与混伪品的种间遗传距离均较
大，这表明通过 psbA-trnH 序列能够将《中国药典》
2010 年版中收录的天师栗、中华七叶树、浙江七叶
树与混伪品区分开来。基于 psbA-trnH 序列构建的
NJ 树（图 3）表明娑罗子基原物种与混伪品聚在不
同分支，可准确鉴别基原物种及其混伪品。3 种基
原物种天师栗、中华七叶树、浙江七叶树也各自聚
为一支，能够进行品种的区分。这些都表明
psbA-trnH 序列能够鉴定区分七叶树属药用植物。
4.3 DNA 条形码的应用对于控制娑罗子药材品质
的意义
DNA 条形码技术从分子水平进行物种鉴定，可
以避免形态学上的错误鉴别，准确性高、操作简便
快捷，是生物分类学的发展趋势之一。因娑罗子商
品药材性状十分相似，气味、质地等也不易区分，
易出现商品药材品种混杂、品质不一的问题，利用传
统的中药材鉴定方法进行形态鉴定费时费力、且对鉴
定人的经验也有较高要求；显微结构、超显微结构、
化学指纹图谱等鉴定方法也在中药材鉴定和质量评
估中发挥了重要作用，但仍有其不便利的方面。DNA
条形码分子鉴定具有高通量、自动化、可靠性高的优
点，其鉴定不受药材性状、鉴别经验的影响，可直接
从基因水平提供鉴定依据，快速准确的区分药材及其
混伪品。这种方法能够为药材市场的规范化管理以及
药材的流通安全提供重要依据。
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 2013 年 9 月

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