全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 5 期 2011 年 5 月

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灯盏花素对大鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用
叶 立 1，李建宇 2，李月鹏 2，顾 军 2*
1. 天津医科大学总医院，天津 300052
2. 武警医学院 药物化学教研室，天津 300162
摘 要：目的 观察灯盏花素对谷氨酸致原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞（rBMECs）损伤的保护作用。方法 灯盏花素
（200、100、50 μmol/L）作用于 rBMECs 24 h 后，加入谷氨酸（终浓度为 1 mmol/L）培养 18 h，MTT 法检测 rBMECs 细胞
活性，并按试剂盒方法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）水平、细胞中丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）
活性。结果 谷氨酸（l mmol/L）使原代培养的 rBMECs 明显受到损伤，灯盏花素高、中浓度（200、100 μmol/L）可显著对
抗谷氨酸造成的 rBMECs 损伤，抑制 LDH 释放，降低 MDA 水平，增强 SOD 活性。结论 灯盏花素对谷氨酸所致原代培养
的 rBMECs 损伤具有明显的保护作用，其机制与增强细胞抗氧化能力有关。
关键词：灯盏花素；谷氨酸；大鼠脑微血管内皮细胞（rBMECs）；抗氧化；乳酸脱氢酶（LDH）
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)05 - 0955 - 03
Protection of scutellarin on rat brain microvascular endothelial cells injury
YE Li1, LI Jian-yu2, LI Yue-peng2, GU Jun2
1. General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China
2. Department of Medicinal Chemistry, Medical Collage of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China
Key words: scutellarin; glutamic acid; rat brain microvascular endothelial cells (rBMECs); anti-oxidant; lactate dehydrogenase (LDH)

血管内皮细胞自稳态调控失衡和微血管损伤是
缺血性损伤的重要发病机制之一。血管内皮细胞具
有维持管壁通透性、防止凝血和血栓形成的生理功
能，干预多种与血管有关的生理和病理生理过程[1-2]。
脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial
cell，BMEC）及其紧密连接是血脑屏障（blood brain
barrier，BBB）的结构基础，具有与外周血管内皮
细胞不同的独有特征，是研究脑血管疾病的最佳细
胞模型。
灯盏花素（scutellarin），又称野黄芩苷，是菊
科植物短葶飞蓬 Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.
-Mazz. 提取物中的主要成分，属黄酮类化合物。现
代药理实验表明，灯盏花素具有扩张血管、增加冠
脉流量和脑血流量、降低脑血管阻力、提高血脑屏
障通透性以及对抗由二磷酸腺苷引起的血小板凝集
等作用[3-4]。灯盏花素制剂用于临床已多年，其中灯
盏花素注射剂用于治疗中风、冠心病、心绞痛等疾
病，是治疗心脑血管疾病，特别是脑栓塞疾病的较
好药物[5]。但灯盏花素对脑血管内皮细胞是否具有
保护作用尚未见报道。本研究采用原代培养的大鼠
脑微血管内皮细胞（rBMECs）模型，观察灯盏花
素对谷氨酸所致 rBMECs 损伤的保护作用，并初步
探讨其作用机制。
1 材料
1.1 药品与试剂
灯盏花素（批号 090801，南京泽朗医药科技有
限公司）；胰蛋白酶（Difco）、MTT，北京鼎国生物
技术开发中心；DMEM/F-12 培养基，Gibco 公司；
胎牛血清，中国医学科学院血液病研究所；胰蛋白
酶、胶原酶 II、谷氨酸，Sigma 公司产品；二甲基
亚砜（DMSO），Aldrich 公司；乳酸脱氢酶（LDH）、
超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，
南京建成生物工程研究所；其余试剂均为市售分析
纯。灯盏花素用 DMSO 溶解，配制成 10 mmol/L 母

收稿日期：2010-11-25
基金项目：国家自然科学基金资助项目（20902110）；天津市自然科学基金资助项目（10JCYBJC14700）；武警医学院重点课题（WYZ201101）
作者简介：叶 立（1966—），女，天津人，副主任药师，硕士，研究方向为心脑血管药理。Tel: (022)60363162 E-mail: lilyyeh@126.com
*通讯作者 顾 军 Tel: (022)60578187 E-mail: gjonly@eyou.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 5 期 2011 年 5 月

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液，加药前用 DMEM/F-12 培养基稀释。
1.2 动物
SD 大鼠，雌雄兼用，7～10 日龄，由中国人民
解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证
号 SCK-（军）2002-001。
1.3 主要仪器
SW—CJ—1F 医用型超净工作台，Forma 3111
CO2 培养箱（美国），Olympus CK—40 倒置相差显
微镜、Olympus CH—2 显微镜（日本），HG303—
3A 电热恒温培养箱，LD5—2A 普通离心机，
BIORAD 680 酶标仪（美国），UV—1601 紫外可见
分光光度计（日本岛津），SH—5 加热磁力搅拌器（北
京金北德工贸有限公司），FA2004 电子天平（上海
精科天平），Mias 2000 图像分析系统（四川大学），
CYS—1 型数字式测氧仪（北京中仪器材）。
2 方法
2.1 rBMECs 的分离与原代培养[6]
6 只 7～10 日龄 SD 大鼠，雌雄兼用，脱颈处
死，置 75%冰乙醇中浸泡 3～5 min 后，于超净工作
台无菌条件下，沿大鼠脑正中线剪开颅骨，剔除硬
脑膜，取出大脑半球，去除小脑和脑干。将取出的
脑组织立即放入盛有冰磷酸缓冲液（PBS）的培养
皿中，尽量去除软脑膜、大血管、白质组织，剪碎
至 1 mm3（以上操作在冰板上进行）。剪碎的灰质组
织用 PBS液漂洗 3次，再用 0.05%胰蛋白酶（pH 7.8）
37 ℃消化 25 min，5 min 摇 1 次，加入含有小牛血
清的 DMEM/F-12 培养基终止消化，吹打混匀，依
次通过 100、200 目的尼龙筛滤过，收集 200 目尼龙
筛上细胞团块，1 000 r/min 离心 5 min。将沉淀复悬
于 0.1%胶原酶 II 溶液中，吹打混匀，37 ℃消化 30
min，1 000 r/min 离心 5 min。将下层沉淀用培养基
漂洗 1 次，再次离心，沉淀用培养基悬浮，接种至
细胞培养瓶中，静置培养（37 ℃、5% CO2）4 d 后
换液，可见梭形贴壁细胞。以后每 2 天换液 1 次，
约 14 d 细胞铺满培养瓶，可进行传代培养。取传至
2 代的细胞用于实验。用培养基将传至第 2 代的
rBMECs 调至 1×105/mL，1 000 μL/孔，接种至 24
孔板上，置 5% CO2 培养箱中于 37 ℃培养，每 2
天换液 1 次，直至细胞长成致密单层后用于以下
实验。
2.2 分组与给药
取 10 mmol/L 灯盏花素溶液，用无血清 DMEM/
F-12 液稀释至终浓度分别为 200、100、50 μmol/L
的含药培养基。取长成致密单层的 rBMECs，分为
对照组、模型组和灯盏花素高、中、低浓度（200、
100、50 μmol/L）组，每组 3 个复孔。给药前轻轻
吸去 24 孔板中的培养基，用 PBS 洗涤 2 次后，用
含药培养基继续培养。24 h 后，将谷氨酸直接加入
培养板中（终浓度为 1 mmol/L），对照组加入等体
积的培养基，于培养箱中培养 30 min 后将培养基完
全去除，用 PBS 洗涤 2 次，再恢复正常培养基，继
续培养 18 h 后进行检测。
2.3 MTT 法检测细胞存活情况
吸去 24 孔板内培养基，加入无血清培养基 450
μL，每孔中再加入 MTT 溶液（5 g/L）50 μL，摇床
内 37 ℃温孵 4 h，吸去含 MTT 的培养基，每孔加
入 DMSO 液 200 μL，温孵 10 min，每孔取 150 μL
移至 96 孔板中，用酶标仪于 570～690 nm 检测各
孔的吸光度（A）值。
2.4 LDH 的测定
取各组细胞培养上清液 10 μL，按说明书操作，
在 490 nm 测定 A 值。
2.5 SOD 活性及 MDA 水平的测定
造模后，去除培养基，用 PBS 洗涤 2 次，加入
细胞裂解液振荡，使细胞裂解，收集裂解液，按试
剂盒说明书方法测定 SOD 活性及 MDA 水平。
2.6 统计学处理
数据用 SPSS 13.0 统计软件处理，结果用 sx ±
表示，进行单因素方差分析。
3 结果
3.1 对谷氨酸损伤的大鼠 rBMECs 存活情况的影响
预试验结果显示，灯盏花素 100～500 μmol/L
无明显的细胞毒作用，确定灯盏花素作用浓度为
200、100、50 μmol/L。
MTT 结果显示，1 mmol/L 谷氨酸引起细胞损
伤（P＜0.01），灯盏花素 200、100 μmol/L 均能明
显对抗谷氨酸对 rBMECs 的损伤作用（P＜0.05、
0.01），而灯盏花素 50 μmol/L 未见明显的保护作用
（P＞0.05），结果见表 1。
3.2 对谷氨酸损伤的大鼠 rBMECs释放LDH的影响
表 1 结果显示，1 mmol/L 谷氨酸促进细胞
LDH 的释放（P＜0.01），表明细胞膜受到了明显
的损伤，通透性增加。灯盏花素 200、100 μmol/L
均能明显抑制细胞上清液中 LDH 的增加（P＜
0.01），灯盏花素 50 μmol/L 组也有一定的抑制作用
（P＜0.05）。
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表 1 灯盏花素对谷氨酸损伤的 rBMECs 细胞存活、LDH 释放、SOD 活性和 MDA 水平的影响 ( 6=± n , sx )
Table 1 Effect of breviscapine on cell survival, leakage of LDH, SOD activity, and MDA level
in rBMECs injured by glutamic acid ( 6=± n , sx )
组 别 C/(μmol·L−1) A LDH/(U·L−1) SOD/(U·mL−1) MDA/(nmoL·mL−1)
对照 － 1.03±0.05** 58.90±6.19** 73.63±6.40** 3.03±0.55**
模型 － 0.52±0.04 94.03±9.80 38.74±3.85 7.52±0.74
灯盏花素 200 0.84±0.09** 65.84±6.41** 68.41±6.99** 4.52±0.94**
100 0.75±0.05* 70.87±8.26** 60.21±5.41** 4.90±1.05*
50 0.69±0.12 78.64±6.75* 45.50±4.48 5.97±1.22
与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs model group
3.3 对谷氨酸损伤的大鼠 rBMECs 的 SOD 活性和
MDA 水平的影响
表 1 结果显示，1 mmol/L 谷氨酸造成细胞内
SOD 活性降低、MDA 水平明显增加（P＜0.01），
说明 rBMECs 清除氧自由基的能力下降。灯盏花素
200 μmol/L 能明显增强细胞内 SOD 的活性、降低细
胞内 MDA 水平（P＜0.01），灯盏花素浓度为 100
μmol/L 时也可明显增加 SOD 活性（P＜0.01）、降
低 MDA 水平（P＜0.05），而浓度为 50 μmol/L 时未
见明显作用（P＞0.05）。
4 讨论
BBB 在维持大脑内环境和功能方面起着极其
重要的作用，BBB 的破坏是缺血-再灌注损伤性脑
病发生的重要病理生理基础。减轻脑缺血-再灌注后
BBB 的损伤可能是防治脑血管疾病继发性脑损伤的
重要手段，也是研究和开发脑保护药物的主要靶点[7]。
谷氨酸是中枢神经系统中的兴奋性氨基酸，在
脑内的浓度相当高。脑缺血时，大量的谷氨酸释放
到细胞外。谷氨酸过度兴奋其特异性受体可导致钙
大量内流和一系列生化改变，如线粒体钙超载和线
粒体膜去极化。细胞内 Ca2+超载导致一系列的毒性
反应，如激活 Ca2+依赖性酶，触发花生四烯酸代谢
瀑布、黄嘌呤氧化酶系活化，产生活性氧自由基，
造成细胞损伤。活性氧自由基可抑制谷氨酸转运体
的功能，加剧胞外谷氨酸的堆积，增强谷氨酸的毒
性作用，形成恶性循环[8]。本实验结果表明，灯盏
花素对由谷氨酸所致 rBMECs 损伤具有保护作用。
MTT 检测结果显示，灯盏花素能够提高细胞活性，
减轻细胞损伤。
缺血和缺氧同时发生时，Ca2+大量内流引起脑
细胞损伤，BBB 破坏，激活一系列的酶促反应，造
成细胞内 LDH 大量外释，并且诱导脑细胞的进一
步损伤，通过细胞上清液中 LDH 水平的测定，可
以反映细胞膜的通透性和完整性[9]。本研究结果表
明，灯盏花素能明显抑制细胞上清液中 LDH 的增
加，很好地保护了细胞膜的稳定性。本实验结果还
表明灯盏花素能够增加细胞内 SOD 活性，降低
MDA 水平，改善能量代谢。
综上所述，灯盏花素对由谷氨酸所致大鼠
rBMECs 损伤具有明显保护作用，其机制可能与减
少氧自由基生成，提高细胞对氧自由基的清除能力
及维持内皮功能有关。
参考文献
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