全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 13 期 2013 年 7 月
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Box-Behnken 效应面法优化穿心莲内酯-PLGA 微球处方研究
王 芳，翟文婷，李艳丽，许 卉*
烟台大学药学院，山东 烟台 264005
摘 要：目的 采用 Box-Behnken 实验设计方法，对穿心莲内酯微球处方进行优化。方法 以聚乳酸羟基乙酸（PLGA）
为药物载体，采用溶剂挥发法制备穿心莲内酯微球。分别以 PLGA 质量浓度、聚乙烯醇（PVA）质量浓度、油水相体积
比为考察对象，以载药量和包封率为评价指标，采用 Box-Behnken 效应曲面法筛选穿心莲内酯微球的最佳处方。结果 穿
心莲内酯微球的最优处方为 PLGA 为 0.20 g/mL，PVA 为 18 mg/mL，油水相体积比为 1∶90（0.011），所得微球的载药量
为（47.21±2.36）%，包封率为（90.15±3.48）%，与模型预测值接近。结论 Box-Behnken 实验设计可用于穿心莲内酯微
球的处方优化筛选。
关键词：穿心莲内酯；微球；处方优化；Box-Behnken 实验设计；效应面法
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)13 - 1743 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.13.009
Formula optimization of andrographolide-loaded PLGA microsphere
by Box-Behnken design and response surface method
WANG Fang, ZHAI Wen-ting, LI Yan-li, XU Hui
School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264005, China
Abstract: Objective To optimize the formula of andrographolide-loaded PLGA microsphere. Methods The microspheres were
prepared by the solvent evaporation method using PLGA as drug carriers. The effects of the concentration of PLGA and PVA, and the
oil-water phase ratio were investigated. According to the drug loading amount and encapsulation efficiency, the formula was optimized
by Box-Behnken design and response surface method. Results The optimal formula was as follows: PLGA concentration of 0.20
g/mL, PVA concentration of 18 mg/mL, and oil-water phase ratio of 1∶90, respectively. The drug loading amount of the microsphere
was (47.21 ± 2.36)% and the encapsulation efficiency was (90.15 ± 3.48)%, which were very close to the predicted values. Conclusion
It is effective and feasible to apply Box-Behnken design and response surface method for the formula optimization of the
andrographolide-loaded PLGA microsphere.
Key words: andrographolide; microsphere; formula optimization; Box-Behnken design; response surface method
穿心莲内酯（andrographolide）为爵床科植物
穿心莲 Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees 中提
取得到的半日花烷型二萜内酯类化合物，是中药穿
心莲的主要有效成分之一[1]。已有研究表明，穿心
莲内酯在抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病、免疫调节
等方面有很好的药理活性，尤其是广谱的抗癌活性，
可以抑制不同肿瘤细胞（如乳腺癌、结肠癌、肝癌、
子宫颈癌等）的增殖[2-3]。同时还具有毒性低、副作
用小、药源广泛、价格低廉等特点，有着广阔的临
床应用价值和发展前景[4]。但由于穿心莲内酯的溶
解性差，口服生物利用度低，且口感极苦，口服时
易致呕吐，患者依从性差，使其临床应用受到极大
限制[5-6]。
微球相比传统的常规剂型，可以延长药物作用
时间，降低给药频率，提高病人的顺应性，应用于
肿瘤治疗具有十分重要的临床意义[7]。聚乳酸羟基
乙酸[poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是一类重
要的可生物降解的高分子材料，由于其具有无毒安
收稿日期：2013-01-18
基金项目：烟台大学青年学术骨干培养项目资助（2012）
作者简介：王 芳（1987—），女，硕士，研究方向为药物新剂型与药物代谢动力学。Tel: 13685351802 E-mail: wangfang732@163.com
*通信作者 许 卉 Tel: (0535)6706030-8009 E-mail: ytu309a@163.com
网络出版时间：2013-06-04 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130604.1802.003.html
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全、生物相容性好及降解性能可控等优点，是制备
微球的理想材料，现已被美国 FDA 批准用作注射
用微球的载体[8]。
本研究首次以 PLGA 为载体材料，采用溶剂挥
发法制备穿心莲内酯载药微球，以 Box-Behnken 效
应面法优化处方，并进行验证。
1 仪器与材料
TFZRJ—30 真空乳化搅拌机（温州天富机械有
限公司），JY92—II 探头超声波细胞粉碎仪（宁波
新芝生物科技股份有限公司），FD—10 冷冻干燥机
（北京惠城佳仪科技有限公司），Agilent 1100 型高效
液相色谱仪（Agilent 公司），0.45 μm 微孔滤膜（上
海安普科学仪器有限公司），S—4800 扫描电镜（日
立高新技术公司）。穿心莲内酯（四川什邡华康药物
原料厂，批号 20111108-A，HPLC 测定质量分数＞
98.0%），PLGA［50∶50，2A（代表黏度范围为 0.15～
0.25，封端为羧基），英国 Lakeshore Biomaterials 公
司］，聚乙烯醇（PVA，MW 13 000～23 000，Sigma-
Aldrich 公司），甲醇（色谱纯，SK Chemical 公司），
其余试剂均为市售分析纯，实验用水为娃哈哈纯净
水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
2 方法与结果
2.1 穿心莲内酯微球的制备
采用水包油包固（S/O/W）乳化溶剂挥发法[9]
制备载药微球。取 PLGA 500 mg 溶解于 2.5 mL 二
氯甲烷中，加入穿心莲内酯微粉 500 mg，冰浴条件
下超声乳化 30 s 配制成有机相。将有机相逐滴加入
水相（1% PVA 水溶液）中，1 000 r/min 搅拌 3 min，
100 r/min 继续搅拌 4 h，使二氯甲烷挥发完全，过
筛，收集 100～1 000 目的筛间物质，蒸馏水洗涤，
收集微球，冷冻干燥，得载药微球。同法制得空白
微球（有机相中不加穿心莲内酯）。
2.2 穿心莲内酯的 HPLC 测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Diamonsil C18 柱（250
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（60∶40），
检测波长 225 nm，体积流量 1 mL/min，柱温 30 ℃，
进样量 20 μL。
2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取穿心莲内酯对
照品 10 mg 置 10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容至 10
mL，即得 1 mg/mL 穿心莲内酯对照品溶液。
2.2.3 样品处理 精密称取穿心莲内酯微球 10
mg，置 10 mL 量瓶中，加二氯甲烷超声（600 W，
25 kHz，20 min）溶解并定容。进一步移取上述溶
液 1 mL 置 10 mL 量瓶中，以流动相稀释定容，过
0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得供测溶液，照
“2.2.1”项下色谱条件进行 HPLC 测定。
2.2.4 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液
0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mL 置 10 mL 量瓶中，用
流动相稀释至刻度，得系列对照品溶液。测定各溶
液色谱峰面积（Y），并与其质量浓度（X）进行线
性回归，得回归方程为 Y＝63.363 X－92.604（r＝
0.999 5），结果表明穿心莲内酯在 1～100 μg/mL 与
峰面积线性关系良好。
2.2.5 专属性考察 取按“2.2.3”项下方法制备的
穿心莲内酯微球溶液、空白微球溶液以及穿心莲内
酯对照品溶液，分别照“2.2.1”项下色谱条件进行
HPLC 测定，所得色谱图见图 1。结果表明，在实
验选定的色谱条件下，空白辅料对穿心莲内酯测定
无干扰。
2.2.6 精密度试验 取对照品溶液适量，分别用流
动相稀释配制 3 个不同质量浓度（5.0、50.0、80.0
μg/mL）的质控样品，每个质量浓度样本平行 5 份，
按“2.2.1”项下色谱条件分别在 1 d 内和连续 5 d
内进行平行测定。结果 3 个质量浓度样品的日内和
图 1 空白微球 (A)、穿心莲内酯对照品 (B)、穿心莲内酯微球样品 (C) 的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of blank microsphere (A), andrographolide reference substance (B),
and andrographolide microsphere sample (C)
A B C
穿心莲内酯
穿心莲内酯
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
t / min
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日间 RSD 分别为 0.56%、0.39%、0.67%和 1.21%、
0.96%、1.12%，表明测定方法精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一穿心莲内酯供试品溶
液，分别于制备后 0、1、2、4、6、12、24 h 进样
测定，记录峰面积。结果穿心莲内酯峰面积的 RSD
为 2.45%，表明供试品溶液至少在 24 h 内稳定。
2.2.8 重复性试验 取同一批次的穿心莲内酯-
PLGA 微球 6 份，按“2.2.3”项下配制供试品溶液，
以“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果 6 批穿心
莲内酯-PLGA 微球中质量分数 RSD 为 1.57%。
2.2.9 加样回收率试验 精密吸取对照品储备液适
量至 10 mL 量瓶中，分别加入 10 mg 空白微球，二
氯甲烷溶解后流动相定容制得低、中、高 3 个质量
浓度供试品溶液（5.0、50.0、80.0 μg/mL）各 3 份，
以“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。
结果 3 种质量浓度供试品溶液的平均回收率分别为
99.36%、98.92%、99.73%，RSD 分别为 0.86%、
0.97%、1.02%。
2.3 载药量及包封率的测定
按照“2.2.3”项下方法处理样品，经 HPLC 法
测定得微球内穿心莲内酯质量，分别计算包封率及
载药量。
载药量＝微球内穿心莲内酯质量 / 微球质量
包封率＝微球内穿心莲内酯质量 / 穿心莲内酯投料量
2.4 处方优化实验
2.4.1 试验设计 采用 Box-Behnken 效应面法优化
处方。综合相关文献报道以及前期预试结果，选取
对穿心莲内酯微球载药量和包封率影响较为显著的
3 个因素，即有机相中 PLGA 的质量浓度（X1）、水
相中 PVA 的质量浓度（X2）和油水相比例（X3），
在 3 个水平上进行了优化研究，以穿心莲内酯微球
的载药量（Y1）和包封率（Y2）为响应值，建立数
学模型优化处方。因素水平见表 1。
2.4.2 数据处理 针对设计的 17 个处方分别测定
Y1 和 Y2 2 个指标，结果见表 1。进一步利用 Design
Expert 8.0 实验设计软件分别对指标 Y1 和 Y2 与影响
因素间的关系进行多元回归分析，综合考虑模型的
检验结果、拟合优度以及模型的简洁性，选择采用
二次多项式进行拟合，得到拟合方程：Y1＝42.41＋
5.07 X1＋1.32 X2＋0.60 X3－0.19 X1X2－0.21 X1X3＋
0.10 X2X3＋0.39 X12－0.62 X22＋0.01 X32（r＝0.992 2，
P＜0.01；失拟度 F＝0.247 1＞0.05）；Y2＝73.61＋
15.40 X1＋3.88 X2＋1.78 X3－0.15 X1X2－0.26 X1X3＋
表 1 Box-Behnken 实验设计及响应值
Table 1 Box-Behnken experimental design
and response values
试验号
X1 /
(g·mL−1)
X2 /
(mg·mL−1)
X3
Y1 /
%
Y2 /
%
1 0.15 10 0.013 35.35 54.69
2 0.20 10 0.020 46.72 87.68
3 0.15 5 0.010 37.58 60.20
4 0.20 5 0.013 47.85 91.77
5 0.20 10 0.010 36.63 57.80
6 0.15 20 0.020 46.63 87.38
7 0.15 10 0.013 38.14 61.65
8 0.15 10 0.013 47.76 91.43
9 0.15 10 0.013 39.45 65.16
10 0.20 20 0.013 43.13 75.83
11 0.10 5 0.013 40.62 68.41
12 0.15 20 0.010 43.96 78.43
13 0.15 5 0.020 40.93 69.28
14 0.10 10 0.020 41.51 70.98
15 0.10 10 0.010 42.41 73.65
16 0.10 20 0.013 41.23 70.16
17 0.15 10 0.013 42.01 72.43
0.38 X2X3＋2.48 X12－1.60 X22－0.05 X32（r＝0.992 6，
P＜0.01；失拟度 F＝0.249 9＞0.05）。
结果表明，对于 Y1 和 Y2 这 2 个指标，模型预
测值与实测值间均呈高度相关，且所拟合的模型方
程具有显著的统计学意义（P＜0.01），拟合优度良
好，可充分反映实际情况[10]。针对上述方程各项系
数的显著性进一步进行了统计检验（表 2），结果在
Y1 模型方程中仅 X1、X2 的系数项显著（P＜0.01），
Y2 模型方程中仅 X1、X2 和 X12 的系数项显著（P＜
0.05）。因此，为了简化模型，在删除不显著项后分
别对 Y1、Y1 进行进一步的拟合，所得模型：Y1＝
42.09＋5.16 X1＋1.21 X2（r＝0.963 6，P＜0.01；失拟
度 F＝0.258 1＞0.05）；Y2＝72.25＋15.49 X1＋3.56
X2＋2.42 X12（r＝0.968 8；P＜0.01，失拟度 F＝
0.271 1＞0.05）。2 个简化模型均有显著的统计学意
义，且拟合优度良好。
2.4.3 效应面评估和优化 根据实际生产及临床应
用情况，微球的载药量及包封率值越大越好，应用
Design Expert 8.0 实验设计软件绘制各因变量对响
应值的三维曲面图（图 2）。按照上述条件结合模拟
方程进行优化，得优化后处方为 PLGA 0.19 g/mL、
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表 2 回归方程系数显著性检验
Table 2 Significance of regression equation coefficient
Y1 Y2 误差来源 系数估计
SE P 值
系数估计
SE P 值
常数项 42.410 0.45 0.000 1 73.610 1.320 0.000 1
X1 5.070 0.28 0.000 1 15.400 0.810 0.000 1
X2 1.320 0.27 0.001 7 3.880 0.380 0.001 7
X3 0.600 0.26 0.059 9 1.780 0.260 0.052 3
X1X2 −0.190 0.35 0.596 6 −0.150 0.130 0.887 4
X1X3 −0.210 0.34 0.555 3 −0.260 0.190 0.805 1
X2X3 0.099 0.33 0.774 5 0.380 0.370 0.709 2
X12 0.390 0.35 0.306 7 2.480 0.130 0.047 3
X22 −0.620 0.41 0.168 8 −1.600 0.129 0.220 3
X32 0.003 0.50 0.994 2 −0.054 0.460 0.971 4
SE-系数标准误差；P-P 概率
SE-standard error of coefficient; P-P probability
PVA 18 mg/mL、油水相体积比 1∶89（0.011），预
测载药量为 48.00%，包封率为 91.93%。
2.5 工艺验证
为进一步验证筛选所得的优化制剂处方的合理
性和制备工艺的重现性，并考虑实际操作的简便性，
将上述各处方因素取整，即 PLGA 质量浓度 0.20
g/mL、PVA 质量浓度 0.018 g/mL、油水相体积比 1∶
90（0.011）。依此最优处方平行制备 3 批穿心莲内
酯微球样品，并分析其主要指标。实验测得载药量
分别为 48.49%、47.06%、46.08%，包封率分别为
92.67%、89.76%、88.03%，结果与模型预测值非常
接近，表明该模型比较可靠，为最佳微球制剂处方。
进一步利用电子扫描显微镜观察了所制备微球
的形状和表面形态（图 3），结果表明，在最优处方
下制得的穿心莲内酯-PLGA 微球为大小均匀的球
形，且表面光滑。
图 2 各因素与响应值的三维图
Fig. 2 Three-dimensional plot of independent factors and response values
图 3 载药穿心莲内酯-PLGA 微球扫描电镜图
Fig. 3 SEM photograph of andrographolide-loaded
PLGA microspheres
3 讨论
Box-Behnken 效应面法适用于多因素多水平试
验设计，可以考察各因素的交互作用，相比于中心
复合设计法试验次数少，节约成本，并且解决了正
交设计、均匀设计试验精度不够，无法精确得到最
佳点的问题[11-12]。《中国药典》2010 年版对微球的
包封率做了明确规定，要求包封率不得低于 80%。
本实验采用 S/O/W 溶剂蒸发法制备穿心莲内酯微
球，以包封率和载药量为指标对其制备工艺进行优
选。由效应曲面及模型方程可以看出 PLGA 的质量
浓度及 PVA 的质量浓度对包封率及载药量的影响
50
载
药
量
/
%
50
42
34
载
药
量
/
%
载
药
量
/
%
包
封
率
/
%
包
封
率
/
%
包
封
率
/
%
2.00
42
34
1.25
0.50
2.0
1.0
1.5
20
10
15 15
20
10
50
42
34
2.0
1.5
1.0
2.00
1.25
0.50 X2 X1 X3 X1 X3 X2
1.25
2.00
0.50
60
80
100
10
15
20
100
80
60
20
15
10
2.0
1.5
1.0
100
80
60
2.0
1.5
1.0
2.00
1.25
0.50 X2 X1 X3 X1 X3 X2
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显著。当 PLGA 质量浓度升高时，包封率及载药量
增加，这可能是因为随着 PLGA 质量浓度增加，有
机相黏度的增加，微球的内部结构更加致密因此减
少了药物在微球固化阶段向外水相的流失[13]。PVA
在整个成球过程中不仅起到降低表面张力、乳化成
乳和提高乳剂稳定性的作用，还能够增加水相的黏
度，对于形成之中和形成之后的微球都有助悬稳定
的作用，能使微球在固化过程中充分混悬，防止发
生黏连与沉积。当 PVA 质量浓度升高时，包封率及
载药量减小，这可能是因为外水相中高质量浓度的
PVA 增加了药物的溶解度，在微球固化阶段引起了
更多的药物流失，因此包封率及载药量降低[14]。
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