全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月

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穿心莲内酯在 Caco-2 细胞单层模型中的吸收机制
廖琼峰 1*，姚 媛 1，谢智勇 2，张 蕾 1，曾元儿 1
1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006
2. 中山大学药学院，广东 广州 510006
摘 要：目的 研究穿心莲内酯在 Caco-2 细胞单层模型中的吸收机制。方法 观察穿心莲内酯在 Caco-2 细胞模型中的双向
转运，考察时间、药物浓度、温度和抑制剂对穿心莲内酯吸收的影响。用 LC/MS/MS 检测药物浓度，计算其表观渗透系数
（Papp）。结果 穿心莲内酯在 Caco-2 细胞模型中，随时间和浓度的增加，药物吸收呈饱和趋势，且受温度和碘乙酰胺影响，
但不受外排抑制剂维拉帕米和 MK-571 的影响。结论 穿心莲内酯在 Caco-2 细胞中的吸收主要是由载体介导的主动转运。
关键词：穿心莲内酯；Caco-2 细胞模型；主动转运；LC/MS/MS；载体介导
中图分类号：R285.61 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)07 - 1363 - 04
Absorption mechanism of andrographolide in human Caco-2 cell monolayer model
LIAO Qiong-feng1, YAO Yuan1, XIE Zhi-yong2, ZHANG Lei1, ZENG Yuan-er1
1. College of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
2. School of Pharmaceutical Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China
Abstract: Objective To study the absorption of andrographolide in human Caco-2 cell monolayer model. Methods Caco-2 cell
monolayer model was applied to investigating the bidirectional transport of andrographolide. The effects of time, drug concentration,
temperature, and inhibitor on the absorption of andrographolide were observed. Drug concentration was measured by LC/MS/MS and
the apparent permeability coefficients (Papp) were calculated. Results Time and concentration saturation were observed for the
absorptive transport of andrographolide across Caco-2 monolayers. The transport of andrographolide was influenced by the change of
temperature and the presence of iodoacetamide, but not Verapamil or MK-571. Conclusion The absorption and transport mechanism
of andrographolide in Caco-2 cell monolayers are active transportation mediated by transporter.
Key words: andrographolide; Caco-2 cell monolayer model; active transport; LC/MS/MS; mediated

穿心莲内酯是常用中药穿心莲 Andrographis
paniculata (Burm. f.) Nees 中量最高的二萜内酯类有
效成分。现代药理研究表明[1-2]，其具有抗炎、抗菌、
抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、治疗心脑血管疾病、
保肝利胆等作用。目前有关穿心莲内酯的药动学已
有研究，但结果参差不齐[3-6]。然而关于穿心莲内酯
吸收机制的研究未见报道。Caco-2 细胞（human
colon androcarcinoma cell line）模型是目前国内外广
泛应用的体外吸收模型，已迅速发展为研究药物吸
收的必备手段[7-11]，并已获美国 FDA 批准用作药物
吸收筛选模型。本课题组应用 Caco-2 模型对脱水穿
心莲内酯的吸收机制进行了研究[12]，本实验继续利
用 Caco-2 细胞单层模型研究穿心莲内酯的吸收机
制，考察时间、药物浓度、双向转运、温度和抑制
剂对穿心莲内酯转运的影响，旨在为穿心莲二萜内
酯类成分的药动学研究提供参考。
1 材料
1.1 药品与试剂
穿心莲内酯（中国药品生物制品检定所，批号
110797-200307，质量分数大于 98%），甲醇（色谱
纯，Merck 公司），DMEM 培养基（Gibico 公司），
胎牛血清（Excell 公司），非必需氨基酸（Hyclone
公司），L-谷氨酰胺（MBchem 公司），胰蛋白酶-
0.25% EDTA（Sigma 公司）；水为 Milli-Q 超纯水；
其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器

收稿日期：2010-11-17
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30600823）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2009ZX09304-003, 2009ZX09501-017）
作者简介：廖琼峰，女，副教授，研究方向为中药药效物质基础和药动学研究。Tel: (020)39358081 E-mail: liaoqf2075@yahoo.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月

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96 孔普通培养板、12 孔 Transwell 板（Corning
公司），飞鸽高速离心机（上海安亭科学仪器厂），
CU—600 电热恒温水槽（上海齐欣科学仪器有限公
司），CO—150 型 INNOVA CO2 培养箱（美国 NBS
公司），Millicell-ERS 跨膜电阻仪（美国 Millipore
公司），IX51 型倒置显微镜（日本 Olympus 公司），
LC-MS 系统（美国 Finnigan 公司）：Surveyor MS
Pump 液相色谱输液泵、Surveyor Autosampler 自动
进样器、Xcalibur 1.3 数据采集软件。
2 方法
2.1 细胞培养
Caco-2 细胞（美国 ATCC）培养于 DMEM 培
养基，其中含 10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及
100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素双抗液，于37 ℃、
5% CO2 环境中培养。细胞接种在 12 孔 Transwell
板上，接种密度为每孔 1×105/mL，培养约 21 d 后，
细胞形成紧密单层，可用于实验。
2.2 MTT法检测穿心莲内酯对Caco-2细胞的抑制
取对数生长期 Caco-2 细胞，调整细胞密度至
1×105/mL，每孔加 200 μL 细胞悬液接种于 96 孔培
养板，培养 24 h 后换液，实验组加入含穿心莲内酯
（浓度分别为 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）
培养液，对照组加不含穿心莲内酯的培养液，空白
组只加培养液。每组设 4 个复孔，继续培养 24 h 后，
每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，再培养 4 h 后吸弃
孔内培养液，每孔加 150 μL DMSO 溶液，将 96 孔
板置于双层空气恒温振荡器中，以转速为 50 r/min
振荡 10 min，使结晶物 Formazan 充分溶解，在酶
标仪上选择波长 570 nm，测定各孔吸光度（A）值。
计算细胞存活率（细胞存活率＝实验组 A 值/对照组
A 值）。
2.3 转运试验
用 pH 6.5 HBSS 溶液配制浓度为 50、75、100
μmol/L 穿心莲内酯溶液，经滤过除菌，取符合转运
条件且细胞生长形态完好的Transwell孔，用 37 ℃、
pH 7.4 空白 HBSS 溶液冲洗 3 遍，最后一次于 37 ℃
培养箱中孵育 30 min。对于从顶端（apical side，
AP 侧）到底端（basolateral side，BL 侧）转运：将
药物溶液 0.5 mL 加到 AP 侧作为供给池，同时 BL
侧加入 pH 7.4 空白 HBSS 1.5 mL 作为接收池；对于
从 BL 到 AP 转运：将药物溶液 1.5 mL 加到 BL 侧作
为供给池，空白HBSS 0.5 mL加到AP侧作为接收池。
分别在 30、60、90、120 min 吸取接收液 0.1 mL，
同时补加 37 ℃、pH 7.4 空白 HBSS 0.1 mL。每组平
行 3 个孔。
2.4 分析方法
2.4.1 色谱条件 预柱为 C18 保护柱（4 mm×2.0
mm，美国 Phenomenex 公司）；分析柱为 Aquasil-C18
柱（150 mm×2.1 mm，5 μm，美国热电公司）；流
动相为甲醇 -1%甲酸（70∶30）；体积流量 0.5
mL/min；进样量 10 μL；柱温为室温。
2.4.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI
源），喷雾电压为 4 000 V，加热毛细管温度为 350 ℃，
鞘气（N2）压力 3.44×105 Pa，辅助气（N2）压力
8.27×104 Pa；正离子方式检测；扫描方式为选择反
应监测（SRM）；由于穿心莲内酯的 [M＋H]+ m/z:
373.4 的二级碎片中无主要的碎片离子，且所有碎片
信号强度极不稳定，无法找到一对合适的母离子与
子离子用于定量分析，但是当充分利用串联质谱的
优势，用选择反应监测模式分析，即三重四极杆的
Q1 和 Q3 都选用 373.4 时（此为一种极端化的 SRM
模式），比只利用 Q1 的选择离子检测模式（此时
Q3 为全扫描方式）进行监测的灵敏度和抗干扰能力
都大为改善，因而本实验用 SRM 模式进行分析，
用于定量反应的离子对为一对特殊的离子对，即
m/z: 373.4→373.4（此反应中的子离子为未经打碎的
与母离子相同的离子）。
2.4.3 样品处理 样品 30 μL，加入甲醇 60 μL，涡
流 1 min，静置 10 min，5 000 r/min 离心 3 min，吸
取上清液进样。
2.5 数据分析
药物透过Caco-2细胞单层的表观渗透系数Papp
（apparent permeability coefficients）值作为参考，进
行数据处理。两组间比较采用 t 检验，数据均以 sx ±
表示。
Papp＝ (dQ/dt) / (A·C0)
dQ/dt 为接收池待测药物浓度变化的表观线性速率，以吸收
药量对时间作线性回归，回归曲线斜率即为表观线性速率；
A 为 Caco-2 单层细胞膜的表面积；C0为在 Caco-2 单层细胞
的 AP 侧或 BL 侧的药物初始浓度
3 结果
3.1 穿心莲内酯对 Caco-2 细胞的抑制作用
MTT 检测结果表明，穿心莲内酯浓度在 6.25～
200 μmol/L 时，细胞存活率未出现突然下降的情况，
细胞存活率均在 80%以上，是 Caco-2 细胞的安全浓
度范围。结果见图 1。
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图 1 穿心莲内酯对Caco-2 细胞存活率的影响 ( 4=± n , sx )
Fig. 1 Effect of andrographolide on survival rate of Caco-2
cells ( 4=± n , sx )
3.2 时间、浓度对穿心莲内酯转运的影响
从 30～120 min，50、75、100 μmol/L 穿心莲
内酯从 AP 侧到 BL 侧的 Papp 值随时间的增加趋向
饱和，前 90 min 近似线性增加，随浓度增大，线性
部分斜率变小，即转运速率变小，提示穿心莲内酯
随浓度增加有饱和趋势。结果见图 2。

图 2 时间、浓度对穿心莲内酯从 AP 侧到 BL 侧转运的
影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 2 Effects of time and concentration on transport
of andrographolide from AP to BL ( 3=± n , sx )
3.3 温度对穿心莲内酯转运的影响
固定穿心莲内酯浓度为 50 μmol/L，分别在 4、
25、37 ℃考察穿心莲内酯从 AP 侧到 BL 侧的转运，
结果见图 3。结果表明，在 4、25、37 ℃下，穿心
莲内酯的 Papp 值差异非常显著，说明穿心莲内酯的
转运受温度的影响。
3.4 双向转运
穿心莲内酯从 BL 侧到 AP 侧的 Papp比从 AP 侧
到 BL 侧的 Papp 大（P＜0.05），且两者比值≥1.5，
提示穿心莲内酯的跨膜转运可能存在载体介导机
制。结果见表 1。
3.5 抑制剂对穿心莲内酯的影响
在考察抑制剂的影响中，发现在碘乙酰胺（5
mmol/L）存在下，穿心莲内酯（50 μmol/L）从 AP
侧到 BL 侧转运的 Papp 经 t 检验比较差异有统计学
意义（P＜0.05），而外排抑制剂维拉帕米（50
μmol/L）和 MK-571（50 μmol/L）的存在对穿心莲
内酯的转运均无影响。结果见表 2、3。

4 ℃、25 ℃、37 ℃两两比较：**P＜0.01
**P<0.01 comparison between each two of 4 ℃, 25 ℃, and 37 ℃
图 3 温度对穿心莲内酯转运的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 3 Effect of temperature on Caco-2 cell transport
of andrographolide ( 3=± n , sx )
表 1 穿心莲内酯在不同浓度时双向转运 Papp 值
( 3=± n , sx )
Table 1 Papp values of andrographolide from bidirection
at different concentrations ( 3=± n , sx )
Papp/(×10−6 cm·s−1) C/
(μmol·L−1) AP→BL BL→AP
PappBL→AP/
PappAP→BL
100 3.30±0.35 6.14±0.26 1.86
75 3.88±0.71 6.21±0.35 1.50
50 4.42±1.32 6.31±1.01 1.52
表 2 碘乙酰胺对穿心莲内酯转运的影响 ( 3=± n , sx )
Table 2 Effect of iodoacetamide on Caco-2 cell transport
of andrographolide ( 3=± n , sx )
Papp/(×10−6 cm·s−1) 组 别
AP→BL BL→AP
穿心莲内酯 4.42±1.32 6.31±1.01
穿心莲内酯＋碘乙酰胺 9.39±1.04* 7.57±0.21
与穿心莲内酯组比较：*P＜0.05
*P<0.05 vs andrographolide group
表 3 维拉帕米和 MK-571 对穿心莲内酯转运的影响
( 3=± n , sx )
Table 3 Effect of Verapamil and MMK-571 on Caco-2 cell
transport of andrographolide ( 3=± n , sx )
Papp/(×10−6 cm·s−1) 组 别
AP→BL BL→AP
穿心莲内酯 4.20±0.07 4.99±0.78
穿心莲内酯＋维拉帕米 3.95±0.33 4.68±0.32
穿心莲内酯＋MK-571 4.05±0.11 4.94±0.62
4 讨论
穿心莲内酯是中药穿心莲的主要有效成分之
100
80
60
40
20
0
6.25 12.5 25 50 100 200
C / (μmol·L–1)
存
活
率
/%

0
1
2
3
4
5
6
7
0 20 40 60 80 100 120 140
t / min
P a
pp
/(×
10
–6
cm
·s–
1 )

100 μmol·L−1
75 μmol·L−1
50 μmol·L−1
0
1
2
3
4
5
6
7
4 ℃ 25 ℃ 37 ℃
P a
pp
/(×
10
–6
cm
·s–
1 )

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一，具有多种药理活性，为了更好地开发利用穿心
莲内酯，本研究通过 Caco-2 细胞模型，研究穿心莲
内酯跨膜转运机制，从而探讨穿心莲内酯小肠吸收
转运的机制，为今后临床研究提供参考依据。
穿心莲内酯在 Caco-2 细胞中，高、中、低 3 个
浓度结果均为 PappBL→AP/PappAP→BL≥1.5，且从 AP 侧
到 BL 侧的 Papp值随浓度增加而下降，说明穿心莲
内酯跨 Caco-2 细胞单层转运不依赖化合物浓度；在
Caco-2 细胞对穿心莲内酯转运的经时曲线上，随着
穿心莲内酯浓度增大，曲线线性部分的斜率变小，
即转运速率在底物浓度低时增加快，随着底物浓度
的升高，转运速率的逐渐减慢。对温度敏感是载体
介导主动转运的共同特征[13-14]，当温度下降时，载
体活性逐渐减弱或者失活。而本实验结果表明温度
对于穿心莲内酯从 AP 侧到 BL 侧的转运有非常显
著的影响（P＜0.01），该结果也预示着 Caco-2 细胞
对穿心莲内酯的转运受到主动转运载体的介导。此
外，已知烷基化试剂碘乙酰胺具有抑制能量代谢并
且耗竭细胞内储存的 ATP 的作用[15]，在 Caco-2 细
胞单层用 5 mmol/L 的碘乙酰胺处理实验中，穿心莲
内酯从 AP 侧到 BL 侧的转运受到影响，而从 BL 侧
到 AP 侧的转运未受影响，提示其转运需消耗能量，
是由载体介导的转运，且该载体可能位于 AP 侧。
肠吸收实验方法主要有在体灌注法、在体回流
法、在体肠段结扎法和离体 Ussing chamber 体系法、
外翻肠囊法，以及 Caco-2 细胞模型[16]。与动物实验
相比，Caco-2 细胞模型有着显著的优点：同源性好，
培养省时经济，可以从不同方向进行转运实验，提
供细胞水平的肠吸收和代谢信息，观察药物对肠黏
膜的毒性作用。Caco-2 细胞模型在中药吸收研究中
的应用更是近年才见报道。由于大部分中药成分的
吸收过程和机制还未明确，因此 Caco-2 细胞模型在
中药口服吸收研究方面具有广阔的应用前景。
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