全 文 ：林荫银莲花组织培养研究
张忠池1 ,耿明建1 ,杨特武1, 2* ,刘 伟1 , 王 俊1 , 辛 龙1 ,刘保财1 ,朱端卫1
( 11 华中农业大学微量元素中心 植物营养与生态环境研究室, 湖北 武汉 430070;
21 华中农业大学植物科学技术学院, 湖北 武汉 430070)
摘 要:目的 研究林荫银莲花 Anemone f laccida 组织培养技术, 为保护与合理利用这一珍稀中药资源提供新的
方法和技术途径。方法 筛选适合组织培养的最佳外植体,并研究不同植物生长调节物质对林荫银莲花愈伤组织
诱导和芽分化的影响。结果 在 MS 培养基中添加 21 0 mg/ L 6-BA 和 11 0 mg/ L NAA , 在温度 17 e 条件下培养
有利于愈伤组织诱导和芽的分化;生长健壮的芽为最佳外植体,其愈伤组织诱导率可达 851 7% , 且易分化形成不定
芽和拟球茎;在 1/ 2MS+ 01 2 mg / L NAA 培养基上, 5 e 条件下培养,再生拟球茎和不定芽生根良好。结论 本研
究为林荫银莲花种苗繁殖提供了有效途径,为其人工扩大栽培奠定了良好基础。
关键词:林荫银莲花; 组织培养;拟球茎
中图分类号: R2841 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1168-05
Studies on tissue culture of Anemone f laccida
ZHANG Zhong- chi
1
, GENG M ing- jian
1
, YANG T e-wu
1, 2
, L IU Wei
1
, WA NG Jun
1
,
XIN Long 1 , LIU Bao-cai1 , ZHU Duan-w ei1
( 11 Labo rato ry of P lant Nutr ition and Eco lo gical Env ir onment Research, M icro element Resear ch Center, Wahan 430070,
China; 21 Colleg e of P lant Sciences and Techno lo gy , H uazhong Ag ricultur al Univ ersity , Wuhan 430070, China)
Abstract: Objective In order to rat ionally pr otect and ut ilize the r are medicinal plant resources, plant
tissue culture on A nemone f laccid a was studied1 Methods T he optimal explant w as screened and ef fects
of dif ferent plant gr ow th regulator s on callus induct ion and bud different iat ion w ere tested1 Results The
combination o f 21 0 mg / L 6-BA and 11 0 mg/ L NA A added in the basic M S medium was pr opit ious to callus
induction and bud differ ent iat ion1 The rate of cal lus induction at tained 851 7%, and the advent itio us bud o r
corm-like st ructure w as easy to dif ferent iate w hen healthy bud germinating f rom rhizome w as chosen as ex-
plant1 Root ing of the regenerated advent it io us bud or corm-like st ructure ( CLS) w as induced w ell on the
1/ 2M S+ 01 2 mg/ L NAA medium under 5 e 1 Conclusion An ef fectiv e approach for the seedling propaga-
t ion has been pr ovided, w hich could promote art ificial planting of A1 f laccida g reat ly1
Key words: A nemone f laccida Fr1 Schmidt ; t issue culture; corm-like st ructure ( CLS)
林荫银莲花 Anemone f laccida Fr1 Schmidt 属
毛茛科银莲花属植物,为高山药用植物, 其干燥根茎
俗名地乌, 具祛风湿、助筋骨、消肿止痛等功效[ 1] , 对
动脉粥样硬化也有一定的防治作用 [ 2]。最近研究又
发现,地乌提取物具有良好的抗炎免疫功能, 可通过
诱导炎症细胞的凋亡而抑制炎症反应[ 3] ,且对淋巴
细胞增殖有显著的抑制作用[ 4] ,并具有高效低毒特
点。邴飞虹等[ 3, 4] 以地乌为原料研制出用于治疗类
风湿性关节炎的国家五类新药 ) ) ) 地乌风湿安胶
囊,极具开发前景。但是,由于林荫银莲花在自然条
件下生长、繁殖缓慢,极大地制约其药用成分的开发
利用。因此, 建立林荫银莲花种苗人工繁殖技术体
系并进行人工栽培是实现林荫银莲花这一珍稀中药
材可持续性利用的根本途径。近年来, 有许多珍稀
药用植物的繁殖采取了组织培养繁殖种苗的方法,
并成功应用于大规模生产[ 5~ 8] , 但目前仍未见有关
林荫银莲花组织培养的报道。本研究探索林荫银莲
花的组织培养繁殖技术,改良林荫银莲花的生长繁
殖方法,为其规模化种植提供大量优质种苗,实现自
然资源的可持续利用及促进本药材的产业化开发。
#1168# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 11-17 基金项目:广东省教育部产学研结合项目( 2006D90204009)作者简介:张忠池( 1984 ) ) ,男,湖北孝感人,硕士研究生。T el : ( 027) 87287184 E-mail: zz csteve@ w ebmail1 h zau1 edu1 cn
* 通讯作者 杨特武 T el: ( 027) 87287184 E- mai l: yangtew u@ mai l1 hzau1 edu1 cn
1 材料和方法
11 1 试验材料:供试材料采自湖北省长阳土家族自
治县麻池村铜鼓包山( 36b171 67cN, 110b481 81cE, 海
拔 1 728 m) ,经由湖北中医学院中药鉴定学教研室
陈科力教授鉴定。使用前, 将林荫银莲花根状茎用
50 mg/ L GA 3 和 10 mg / L 6-BA 浸泡 24 h,低温保
存解除其休眠; 然后用自来水冲洗, 洗洁精浸泡 30
min, 将表面污泥清洗干净, 再用自来水冲洗 30
min, 去除根茎表面的分支和须根。解除休眠后萌
发的根状茎,可提供叶片、叶柄、根和芽为组织培养
的外植体材料。
11 2 培养基:本课题组的前期研究发现, 林荫银莲
花外植体在组织培养中愈伤组织诱导和器官分化可
同步完成, 故本研究中采用的诱导和分化培养基相
同。以 MS 基本培养基添加不同种类和浓度的植物
生长调节剂,对愈伤组织诱导和分化进行调控。依
据植物生长调节剂的种类和浓度, 设置 A、B、C、D、
E、F、G共 7个处理(表 1)对外植体愈伤组织诱导培
养;依据不同浓度的 6-BA 和 NAA 配比,设置 R1~
R10共 10个处理(表 1)对外植体进行不同器官再
生分化途径进行调控。以 1/ 2M S基本培养基,设置
不同植物生长调节剂( 01 2 mg / L NAA、01 5 mg/ L
NAA、01 5 mg/ L IBA)和温度( 5、18 e )处理进行组
培苗生根培养。
11 3 接种及培养:分别以带有部分老组织的萌发芽
(老组织长度不超过 1 cm)、新展开叶、未展幼叶、叶
柄、根为材料,用 11 5%多菌灵浸泡 2 h, 自来水冲洗
干净,在超净工作台上用 75% 乙醇消毒 30 s, 无菌
水冲洗后, 转入经过灭菌的三角瓶中,滴入 2滴聚山
梨酯-20, 再加入适量01 2%HgCl2 进行消毒。其中,
芽消毒时间 9 m in,其他组织消毒 5 m in。无菌水冲
洗 6次后, 外植体在无菌滤纸上吸干表面水分并进
行切割。然后, 将外植体接种至添加有 300 mg/ L
的头孢噻肟钠的不同处理的培养基上, 在温度 17
e 、光照强度 3 000 lux、光照周期为 12 h/ d的条件
下培养,每 25 d继代 1次。将分化好的再生苗转入
生根培养基,分别于 5、18 e 的黑暗条件下进行生根
培养。
试验结果中诱导率均以未污染的有效外植体进
行计算,即诱导率= (诱导产生愈伤组织的外植体
数+ 直接分化产生器官的外植体数) /有效外植体
数@ 100%。
2 结果与分析
21 1 适宜外植体筛选:分别采用带部分老组织的
表 1 林荫银莲花外植体诱导培养基的植物生长调节
物质配比
Table 1 Ratio of plant growth regulators in explant
induction medium of A1 f laccida
处理 植物生长调节物质配比/ ( mg # L
- 1 )
6-BA ZT IBA NAA
A 01 0 01 0 01 0 01 0
B 21 0 01 0 11 0 01 0
C 21 0 01 0 01 0 11 0
D 01 0 21 0 11 0 01 0
E 01 0 21 0 01 0 11 0
F 11 0 11 0 11 0 01 0
G 11 0 11 0 01 0 11 0
R1 01 0 ) ) 01 0
R2 11 0 ) ) 01 0
R3 21 0 ) ) 01 0
R4 11 0 ) ) 01 2
R5 21 0 ) ) 01 2
R6 11 0 ) ) 01 5
R7 21 0 ) ) 01 5
R8 11 0 ) ) 11 0
R9 21 0 ) ) 11 0
R10 31 0 ) ) 11 0
芽、叶柄、未展开幼叶、展开叶片、展开叶切块( 01 5
cm @ 01 5 cm) 和根作为外植体, 接种于 MS+ 21 0
mg/ L 6-BA + 01 5 mg / L NAA 培养基上培养。由
表 2可知,不同外植体诱导、分化差异明显,以芽体
( W-1-6)为外植体最佳,诱导率达 851 7% ,其次是未
展开叶片( W-1-3) ,诱导率为 161 7%, 二者均可在诱
导产生愈伤组织后直接分化出不定芽(图 1-3~ 6)
或拟球茎(图 1-8~ 9) ,且这些不定芽和拟球茎能不
断进行增殖。W-1-2为不切块的展开叶片, 虽在培
养初期膨大、卷曲,且少数可分化产生嫩绿色芽, 但
随后出现黄化、死亡现象。以展开叶片的切块为外
植体( W-1-1) ,在培养 30 d左右全部黄化、死亡。叶
柄( W-1-4)接种到培养基上很快( 15 d)就开始膨大、
伸长,有时会在叶柄基部产生少量愈伤组织(图 1-
7) , 但愈伤组织继续增殖困难。以新生的无菌根为
外植体( W-1-5) ,经培养也能诱导产生愈伤组织,且
愈伤组织分化率高、生长旺盛,但愈伤组织诱导率很
低,仅为 51 0%。因此,林荫银莲花组织培养最佳外
植体为带部分老组织的芽, 诱导率最高,增殖最快,
且能直接诱导产生不定芽和拟球茎。
21 2 不同植物生长调节物质组合对林荫银莲花愈
伤组织诱导及芽再生的影响:以 1/ 2芽作为外植体,
一般在培养 28 d左右产生愈伤组织, 40 d左右开始
分化出芽。在处理 A 中由于培养基中没有添加任
何植物生长调节剂,培养外植体均无愈伤组织产生,
也无器官直接发生; 处理 C 为 6-BA 21 0 mg/ L+
#1169#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
NAA 11 0 mg/ L 的植物生长调节剂组合,愈伤组织
和芽诱导率最高达 801 0%, 且外植体的生长比较旺
盛、分化系数高; 处理 B 为 6-BA 21 0 mg/ L+ IBA
11 0 mg/ L 的植物生长调节剂组合,愈伤组织和芽的
诱导率为 401 0%, 说明生长素类物质中 NAA 的效
果比 IBA 好。在 D 和 E 处理中, 分别以 ZT 21 0
mg/ L 与两种生长素类物质组合进行处理, 诱导率
均低于 B和 C处理(表 3) , 说明细胞分裂素类物质
中 6-BA 诱导愈伤的效果比 ZT 好。在处理 F 和 G
中,以质量浓度各为 11 0 mg / L 的 6-BA 和 ZT 分别
与两种生长素进行组合, 其诱导效果也不如 C 组
合。因此, 在林荫银莲花组织培养中以添加 21 0
mg/ L 6-BA 和 11 0 mg/ L NAA 的植物生长调节剂
组合为最佳。
表 2 林荫银莲花不同外植体的诱导差异
Table 2 Induction differences among different
explants of A1 f laccida
处理
编号
外植体
类型
接种
总数
诱导率*
/ %
培养情况
W-1- 1 展开叶切块 200 01 0 黄化、死亡
W-1- 2 展开叶整体 40 101 0 叶边缘极度卷曲、膨大, 少数
产生嫩绿色芽
W-1- 3 未展开叶 30 161 7 叶边缘极度卷曲、膨大, 少数
产生嫩绿色芽
W-1- 4 叶柄 50 01 0 膨大、轻微愈伤化, 培养后期
死亡
W-1- 5 根 20 51 0 根膨大, 根尖产生少量愈伤
组织
W-1- 6 芽 30 851 7 颜色嫩绿、分化系数极高
*-产生愈伤组织和器官分化的外植体数占有效外植体数的百
分比,下同
*-Percentage of callus t issue induct ion and dif feren tiat ion fr om
ex plant , same as below
1-地上部 2-萌发的根茎 3-叶片诱导产生的不定芽 4-叶片诱导产生的不定芽 5-叶片诱导产生的不定芽 6-叶片诱导产生的不定芽 7-
叶柄基部产生的愈伤组织 8-芽为外植体诱导产生的不定芽 9-芽为外植体诱导产生的拟球茎
1- shoots 2- germ inat ing rhiz om e 3- advent iti ou s b uds induced f rom leaf 4-advent it ious buds indu ced f rom leaf
5- advent it iou s buds induced from leaf 6-adven tit ious bu ds induced f rom leaf 7-callus induced at b as e of pet iole
8- advent it iou s buds induced from bud ex plan t 9-CLS induced fr om bud explant
图 1 林荫银莲花不同外植体及其在不同组培中产生的愈伤组织、不定芽及拟球茎
Fig1 1 Callus, adventitious buds, and CLS induced from different explants of A1 f laccida in different tissue culture
#1170# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
表 3 植物生长调节物质对林荫银莲花外植体诱导率的
影响
Table 3 Effect of dif ferent plant growth regulators
on explant induction rate of A1 f laccida
处理 接种外植体数 诱导数 诱导率/ %
A 30 0 01 0
B 30 12 401 0
C 35 28 801 0
D 36 3 81 3
E 32 4 121 5
F 36 9 251 0
G 30 20 661 7
21 3 不同质量浓度植物生长调节物质配比对芽再
生途径的影响: 不定芽是指从叶、根、茎节间等通常
不产生芽的部位生出的芽;球茎为地下变态茎,膨大
呈球形,茎内部实质, 顶端有肥大的顶芽, 因在本研
究的器官分化中产生了一种类似球茎的诱导产物,
故称为拟球茎。图 2为在不同质量浓度植物生长调
节剂配比的培养基上不定芽和拟球茎的诱导率。在
处理 R1中,由于培养基中未添加任何植物生长调
节物质,未产生不定芽或拟球茎; 在处理 R2中, 培
养基中单独添加 11 0 mg/ L 的细胞分裂素类物质 6-
BA,只诱导产生不定芽,没有拟球茎,不定芽的诱导
率为( 361 7 ? 61 7) % ;在处理 R3中,当 6-BA 增加到
21 0 mg / L 时, 不定芽的诱导率与 R2差异不显著。
R4和 R5处理是分别在 R2和 R3的基础上添加了
01 2 mg/ L NAA,其拟球茎的诱导率均有所提高, 其
中 R4拟球茎诱导率为( 411 0 ? 31 6) %, R5 拟球茎
诱导率达( 631 0 ? 21 6) % ,且两者间差异显著, 但其
不定芽诱导率与 R2 和 R3 差异不显著。当 NAA
提高到 01 5 mg / L 时,即在处理 R6( 6-BA 1 mg / L )
和 R7( 6-BA 2 mg / L )中,不定芽和拟球茎的诱导率
均低于 01 2 mg / L NAA 的相应组合( R4和 R5) , 其
中 R6拟球茎诱导率为( 301 0 ? 41 5) %, 处理 R7 中
拟球茎诱导率为( 501 0 ? 21 0) % ;当 NAA 进一步提
高到 11 0 mg/ L 时, 即在处理 R8( 6-BA 为 11 0 mg/
L )和R9( 6-BA 为 21 0 mg/ L)中,不定芽和拟球茎的
诱导率进一步下降,其中在处理 R8中没有拟球茎
产生。在处理 R10中, 植物生长调节剂配比为 11 0
mg/ L NAA+ 31 0 mg/ L 6-BA,则没有不定芽产生,
只有少数拟球茎产生。上述结果表明, 不同 NAA
和 6-BA 组合对林荫银莲花的器官分化再生具有不
同的调控作用, 其中 01 2 mg/ L NAA+ 21 0 mg/ L 6-
BA 组合( R5)对不定芽和拟球茎的诱导率均较高。
21 4 植物生长调节物质及温度对林荫银莲花组培苗
生根的影响:林荫银莲花生长在海拔较高的地区, 在
差异检验为 LSD法,不同的小写字母( a、b、c)分别表示不定芽、
拟球茎不同处理间诱导率差异达 01 05的显著水平
Using LSD m ethod to tes t dif feren ce levels , dif f erent let ters
( a, b, and c) rep resent signif icant dif f erence ( P < 01 05)
am ong dif feren t t reatments at th e rate of adven tit ious
bud or CLS
图 2 不同植物生长调节物质配比对林荫银莲花外植体
再生途径的影响
Fig1 2 Effect of different ratios of plant growth regulators
on morphogenesis of A1 f laccida
自然条件下其休眠根茎需经较长时间的低温才能解
除休眠,萌发。本试验模拟自然低温条件,研究了外
源植物生长调节物质对拟球茎生根的促进作用。表
4结果表明,在 5 e 暗培养 60 d后观察,即使不添加
任何植物生长调节剂, 组培苗也可生根(图 3-1~ 2) ,
生根率为60% ,平均生根数为 41 6条/株; 在添加 01 2
mg/ L NAA培养基上,生根率最高达 90%,平均生根
数为 161 2条/株(图 3-4) ;当 NAA 增加至 01 5 mg/ L
时,生根率( 80%)和根数( 101 0条/株)略有下降;而在
添加 01 5 mg/ L的 IBA培养基中,拟球茎生根率虽然
也有 80%,但生根数明显低于其他处理(仅 31 0条/
株) ,新生根却明显较为粗壮(图 3-3)。在 18 e 的暗
培养条件下,拟球茎生根率和单芽生根数都降低,并
且,在没有添加植物生长调节物质的处理中无新根分
化。可见,植物生长调节物质与温度对拟球茎生根具
有协同效应。
表 4 植物生长调节物质和温度对林荫银莲花再生拟球茎
生根的影响
Table 4 Ef fects of plant growth regulators and temperature
on rooting of regenerated CLS of A1 f laccida
NAA/
( mg# L- 1)
IBA/
(mg# L- 1)
5 e
生根率/% 生根数/
(条#株- 1 )
18 e
生根率/% 生根数/
(条#株- 1)
010 01 0 60 41 6 0 01 0
012 01 0 90 161 2 30 31 2
015 01 0 80 101 0 10 21 5
010 01 5 80 31 0 0 01 0
#1171#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
1-不定芽诱导产生的根 2-拟球茎诱导产生的根 3-IBA 处理拟球茎产生的根 4-NAA 处理拟球茎产生的根
1-roots in duced f rom advent iti ou s b uds 2- roots indu ced f rom CLS 3-r oots induced from CLS by IBA treatment
4-r oots induced fr om CLS by NAA tr eatm ent
图 3 林荫银莲花组培再生不定芽和拟球茎诱导产生的根
Fig1 3 Roots induced from regenerated adventitious buds or CLS of A1 f laccida in tissue culture
3 讨论
本实验结果表明, 添加 21 0 mg/ L 6-BA 和 11 0
mg/ L NAA 的 MS 培养基对林荫银莲花愈伤组织
诱导效果较好, 芽、叶片、叶柄和根均能诱导产生愈
伤组织,但综合考虑愈伤组织诱导率及质量, 以芽为
外植体最佳,诱导率高,诱导产生的愈伤组织质地紧
密, 且分化系数高。植物生长调节物质 6-BA 和
NAA的配比不同, 诱导产生的不定芽和拟球茎的
比例不一样, 以添加 21 0 mg/ L 6-BA + 01 2 mg/ L
NAA组合的不定芽和拟球茎诱导率最高。林荫银
莲花组培的不定芽再生苗和拟球茎在生产应用上存
在明显不同的利用价值。不定芽在培养过程中由于
基部连接在一起,在移栽时需要切割分离而产生伤
口,因而会影响幼苗的移栽成活率。同时,由于林荫
银莲花具有生长期短(自然条件下生长季节在 3 月
中旬至 5月上旬)的自然特性,导致不定芽在组培过
程中易衰老死亡, 从而影响其繁殖效率。而拟球茎
再生后在培养后期渐渐脱离愈伤组织, 并逐步进入
休眠状态, 这极利于制作人工种子,直接用于播种生
产。通过调整植物生长调节剂配比建立外源调控器
官再生分化途径的方法, 在虎眼万年青研究中也得
到证实[ 9] ;在马铃薯和魔芋[ 10] 等植物组织培养中也
发现有类似的情况。因此,在本实验首次证明了组
织培养繁殖林荫银莲花是可行的基础上, 如何进一
步提高拟球茎分化率, 是建立更具实际应用价值的
林荫银莲花组织培养快繁技术的关键。
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#1172# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月